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1、,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,ppt課件,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第

2、五級,ppt課件,*,RNA-seq,技術(shù)原理及應(yīng)用,RNA-seq技術(shù)原理及應(yīng)用,主要內(nèi)容,1,、,RNA-seq,技術(shù)簡介,2,、,RNA-seq,技術(shù)原理,3,、,RNA-seq,結(jié)果分析,4,、,RNA-seq,技術(shù)應(yīng)用,2,ppt課件,主要內(nèi)容1、RNA-seq技術(shù)簡介2ppt課件,一、,RNA-seq,技術(shù)簡介,1.,誕生于 20 世紀(jì) 70 年代的 Sanger 法是最早被廣泛應(yīng)用的 DNA 測序技術(shù)，也是完成人類基因組計(jì)劃的基礎(chǔ)。,2.2005 年以來，以 Roche 公司的 454 技術(shù)、Illumina 公司的 Solexa 技術(shù)和 ABI 公司,的,SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志

3、的新一代測序技術(shù)相繼誕生,，又稱作深度測序技術(shù)。,3.把高通量測序技術(shù)應(yīng)用到由 RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 上，從而獲得來自不同基因的RNA 片段在特定樣本中的含量，這就是 RNA測序或 RNA-seq,。,3,ppt課件,一、RNA-seq技術(shù)簡介1.誕生于 20 世紀(jì) 70 年代,二、RNA-seq技術(shù)原理,Illumina/Solexa 測序技術(shù)的基本原理是邊合成邊測序，即測序過程是以 DNA 單鏈為模板，在生成互補(bǔ)鏈時(shí)，利用帶熒光標(biāo)記的 dNTP 發(fā)出不同顏色的熒光來確定不同的堿基。,新加入 dNTP 的末端被可逆的保護(hù)基團(tuán)封閉，既保證單次反應(yīng)只能加入一個(gè)堿基，又能在該堿基讀取完畢

4、后，將保護(hù)基團(tuán)除去，使得下一個(gè)反應(yīng)可繼續(xù)進(jìn)行。為了增加熒光強(qiáng)度，使之更易被成像系統(tǒng)所采集，該技術(shù)在測序之前還需要對待測片段做橋式擴(kuò)增。,4,ppt課件,二、RNA-seq技術(shù)原理Illumina/Solexa 測,Shot Gun,文庫構(gòu)建,DNA,片段固定,簇序列讀取反應(yīng),圖像獲得和處理,序列組裝和比較,單條模板擴(kuò)增,1,2,3,4,T T T T,T,G,C,T,二、RNA-seq技術(shù)原理,5,ppt課件,Shot Gun文庫構(gòu)建DNA片段固定簇序列讀取反應(yīng)圖,二、RNA-seq技術(shù)原理,RNA-seq,實(shí)驗(yàn)流程圖,6,ppt課件,二、RNA-seq技術(shù)原理RNA-seq實(shí)驗(yàn)流程圖6ppt

5、課,為了便于測序數(shù)據(jù)的發(fā)布和共享，高通量測序數(shù)據(jù)以 FASTQ 格式來記錄所測的堿基讀段和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。NCBI、EBI、DDBJ 等數(shù)據(jù)中心建立了大容量的數(shù)據(jù)庫 SRA來存放共享的測序數(shù)據(jù)。,三、,RNA-seq結(jié)果分析,7,ppt課件,為了便于測序數(shù)據(jù)的發(fā)布和共享，高通量測序數(shù)據(jù)以 FASTQ,三、,RNA-seq結(jié)果分析,RNA-seq 數(shù)據(jù)的基本處理,8,ppt課件,三、RNA-seq結(jié)果分析RNA-seq 數(shù)據(jù)的基本處理8p,1.序列定位算法,（,1,）空位種子索引法：首先將讀段切分，并選取其中一段或幾段作為種子建立搜索索引，再通過查找索引、延展匹配來實(shí)現(xiàn)讀段定位，通過輪換種子考慮允許出

6、現(xiàn)錯(cuò)配的各種可能的位置組合（,Maq）,。,（,2,）Burrows-Wheeler 轉(zhuǎn)換技術(shù)：通過B-W 轉(zhuǎn)換將基因組序列按一定規(guī)則壓縮并建立索引，再通過查找和回溯來定位讀段，在查找時(shí)可通過堿基替代來實(shí)現(xiàn)允許的錯(cuò)配（,Bowtie）,。,（,3,）,改進(jìn)的 SmithWaterman 動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法：隨著讀長的增加，允許讀段序列中存在插入刪除(indel)的定位（BFAST、SHRiMP、Mosaik）。,三、,RNA-seq結(jié)果分析,9,ppt課件,1.序列定位算法三、RNA-seq結(jié)果分析9ppt課件,2.基因表達(dá)水平估計(jì),RNA-seq 數(shù)據(jù)最基本的應(yīng)用是檢測基因的表達(dá)水平，與基因芯片數(shù)

7、據(jù)相比，RNA 測序得到的是數(shù)字化的表達(dá)信號(hào)，具有靈敏度高、分辨率高、無飽和區(qū)等優(yōu)勢,。,RNA 測序數(shù)據(jù)是對提取出的 RNA 轉(zhuǎn)錄本中隨機(jī)進(jìn)行的短片段測序，如果一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的豐度高，則測序后定位到其對應(yīng)的基因組區(qū)域的讀段也就多，可以通過對定位到基因外顯子區(qū)的讀段計(jì)數(shù)來估計(jì)基因表達(dá)水平,。,三、,RNA-seq結(jié)果分析,10,ppt課件,2.基因表達(dá)水平估計(jì)三、RNA-seq結(jié)果分析10ppt課,3.選擇性剪接事件識(shí)別和剪接異構(gòu)體表達(dá)水平推斷,只要測序深度足夠深，就能檢測到所有轉(zhuǎn)錄本的全部序列，包括來自剪接接合區(qū)的序列,。,Tophat 等軟件定位剪接接合區(qū)讀段的策略能標(biāo)定出剪接事件中的兩個(gè)剪接

8、位點(diǎn)：供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn),。,通過比較供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)的組合，就能識(shí)別選擇性剪接事件,。,進(jìn)一步，通過對供體和受體位點(diǎn)的讀段計(jì)數(shù)，結(jié)合外顯子其他區(qū)域的讀段數(shù)據(jù)，還能定量地計(jì)算選擇性剪接事件之間的比例。,三、,RNA-seq結(jié)果分析,11,ppt課件,3.選擇性剪接事件識(shí)別和剪接異構(gòu)體表達(dá)水平推斷三、RNA-,三、,RNA-seq結(jié)果分析,兩類樣本 RNA-seq 數(shù)據(jù)比較分析的框架,12,ppt課件,三、RNA-seq結(jié)果分析兩類樣本 RNA-seq 數(shù)據(jù)比較,四、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用,1、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究,利用單堿基分辨率的RNA-Seq技術(shù)可極大地豐富基因注釋的很多方面內(nèi)容,包括 5/3

9、邊界鑒定、UTRs區(qū)域鑒定以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。RNA-Seq還可對可變剪接(Alternative splicing)進(jìn)行定量研究。,2、轉(zhuǎn)錄本變異研究,在發(fā)現(xiàn)序列差異方面，如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)性研究等，RNA-seq也具有很大的潛力。,13,ppt課件,四、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用1、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究13ppt課件,四、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用,3、非編碼區(qū)域功能研究,轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的一個(gè)重要方面就是發(fā)現(xiàn)和分析 ncRNA，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)。,4、基因表達(dá)水平研究,RNA-Seq一個(gè)特別強(qiáng)大的優(yōu)勢是它可以捕捉不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化而無需對數(shù)據(jù)集進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)化。,14,ppt課件,四、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用3、非編碼區(qū)域功能研究14ppt課,總結(jié),高通量測序技術(shù)的應(yīng)用面非常廣，RNA-seq 只是其中一個(gè)方面，除此之外，基因組的從頭測序和重測序、染色質(zhì)免疫沉淀測序、甲基化測序等技術(shù)都同樣有著廣泛的應(yīng)用。,15,ppt課件,總結(jié)高通量測序技術(shù)的應(yīng)用面非常廣，RNA-seq 只是其中一,THANK YOU!,16,ppt課件,THANK YOU!16ppt課件,