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2019-2020年高三生物總復(fù)習(xí) 第45講 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)教案 【考綱要求】 生物技術(shù)在其它方面的應(yīng)用 考綱要求 具體內(nèi)容 (3)PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 (4)蛋白質(zhì)的提取和分離 Ⅱ Ⅱ 實驗內(nèi)容 (3)血紅蛋白的提取和分離操作 實驗與探究能力 【考點分析】 考點 試卷類型 題型 PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 xx江蘇生物 非選擇題 xx江蘇生物 選擇題 【考點預(yù)測】 從近幾年高考試題看，有關(guān)植物的組織培養(yǎng)內(nèi)容是命題的重點。預(yù)測今年高考命題可能會從下面兩個方面展開： 1．植物組織培養(yǎng)和花藥離體培養(yǎng)的原理、方法、操作步驟、注意事項等 2．PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 3．蛋白質(zhì)的提取和分離原理、過程及其注意事項 從近幾年新課標改革地區(qū)生物試題看，主要考查植物組織堵喬的原埋、近程及影響因素，以非選擇題為主。由于近兩年考查面的增加，賦分也有所增加的趨勢。以07年到08年逐漸增多。命題角度的最大變化應(yīng)該是以過程圖和表格形式等多種表達形式考查學(xué)生對知識的掌握程度和識圖能力。總體上來說本單元的考查難度較低，且作為選做題出現(xiàn)為主。在復(fù)習(xí)的過程中，要多加強識記，同時注意實驗探究能力的培養(yǎng)。 【知識梳理】 一、 DNA的粗體取與鑒定 1、 提取DNA的方法 2、 DNA的鑒定 3、 設(shè)計實驗過程 二、DNA體外擴增技術(shù) 1、 PCR原理 2、 PCR的反應(yīng)過程 3、 DNA含量的鑒定 三、血紅蛋白的提取和分離 【重點解析】 一、DNA的粗提取和鑒定 1．DNA的理化性質(zhì) (1)DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達到分離目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些成分如蛋白質(zhì)等卻溶于酒精，利用這一原理，可將DNA與蛋白質(zhì)等進一步地分離。 (2)DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對DNA沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60℃～80℃的高溫，而DNA在80℃以上時才會變性，洗滌劑能夠溶解細胞膜，但對DNA沒有影響。 (3)DNA的熱變性 DNA分子在細胞內(nèi)復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時，在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂，而在體外，DNA在80℃～l00℃的溫度范圍內(nèi)變性，即雙螺旋解開，成為單鏈；當(dāng)溫度慢慢降低后，兩條彼此分離的單鏈又會重新結(jié)合形成雙鏈。但高溫能使DNA聚合酶變性失活，后來發(fā)現(xiàn)了耐高溫的TaqDNA聚合酶，解決了上述矛盾。 2．基本原理 (1)DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0．14 mol／L的NaCl溶液中的溶解度最低，如下表所示 由上表可以看出，在NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為2 mo1／L時，DNA溶解，部分蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析而生成沉淀，通過過濾可除去部分蛋白質(zhì)；在NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為0．14 m01／L時，DNA析出．，過濾可除去溶解的部分蛋白質(zhì)。 (2)DNA不溶于酒精溶液——加入體積分數(shù)為95％的冷卻酒精溶液可使DNA析出，除去溶于酒精的蛋白質(zhì)。 (3)DNA不被蛋白酶所水解——嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，加入嫩肉粉可使蛋白質(zhì)水解而DNA不被水解。 (4)DNA可被二苯胺染成藍色——向含DNA的試管中加入二苯胺并沸水浴，溶液呈現(xiàn)藍色可確認DNA。 3．方法步驟 (1)實驗材料的選擇 ①首先選擇含有DNA的生物材料。 ②選用DNA含量相對較高的生物組織，成功率較大。 (2)破碎細胞——獲取含DNA的濾液 ①動物細胞如雞血細胞——在血細胞液中加入蒸餾水，用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。 ②植物細胞用洗滌劑溶解細胞膜，進行充分攪拌和研磨，過濾后收集濾液。 (3)去除濾液中的雜質(zhì) 方案①利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)(用2 mol／I。NaCl溶液過濾除去不溶的雜質(zhì)，用0．14 mol／I。NaCl溶液析出DNA，過濾，除去溶液中的雜質(zhì)，再用2 mol／L NaCl溶液溶解DNA)。 方案②在濾液中加入嫩肉粉，利用其蛋白酶水解蛋白質(zhì)。 方案③將濾液放入60℃～75℃恒溫水浴箱中保溫10～15 rain，使蛋白質(zhì)變性。 (4)DNA的析出與鑒定 ①析出：將處理后的溶液過濾，加入與濾液等體積的冷卻酒精溶液(體積分數(shù)為95％)靜置，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物(此即粗提取的DNA)，用玻璃棒沿一個方向攪拌卷起絲狀物。 ②鑒定 【例1】關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”的實驗裝置如圖 (1)實驗材料選用雞血細胞液，而不用雞全血。主要原因是雞血細胞液中 含量較高。 (2)在圖A所示的實驗步驟中加蒸餾水20 mL的目的是 通過圖B所示的步驟取得濾液，再在濾液中加入2mol/l NaCl溶液的目的是 ．圖C所示實驗中加蒸餾水的目的是 。 (3)為鑒定實驗所得絲狀物的主要成分是DNA，可滴加 溶液，結(jié)果絲狀物被染成綠色。 解析：(1)雞血細胞中含較多的DNA，而血漿中不合DNA，因此，實驗材料應(yīng)用雞血細胞液而不用雞全血。 (2)要明確區(qū)別兩次加蒸餾水的目的，第一次目的是讓雞血細胞吸水漲破，放出DNA，第二次加蒸餾水是為了降低NaCl溶液的濃度，使溶解于2 molL_1 NaCl溶液中的 DNA析出。 (3)本題考查DNA的鑒定，可以加二苯胺沸水浴變藍色，也甲基綠使DNA變綠色，本題干無沸水浴這一條件，且結(jié)果是絲狀物變綠色，所以使用的試劑為甲基綠。 答案： (1)DNA (2)使血細胞吸水漲破，放出DNA使濾液中的DNA溶于鹽溶液 使DNA析出 (3)甲基綠 二、PCR技術(shù) 1．生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的區(qū)別 體內(nèi)DNA復(fù)制 PCR反應(yīng)， 時期 細胞有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂間期及無絲分裂、二分裂過程 體外隨時進行 場所 細胞內(nèi) 微量離心管內(nèi) 解旋 在解旋酶作用下，細胞提供能量，部分解開 加熱至90℃，雙鏈全部解開，不需解旋酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或單鏈DNA分子片段 合成子鏈 在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成 分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合成，控制溫度72℃ 特點 邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制 體外迅速擴增 DNA聚合酶 需DNA聚合酶 需耐高溫的Taq DNA聚合酶 循環(huán)次數(shù) 受生物體自身控制 30多次 相同點 ①需提供DNA復(fù)制的模板 ②四種脫氧核苷酸作原料 ③子鏈延伸的方向都是從5‘端到3‘端 2． PCR技術(shù)擴增DNA片段 (1)原理：DNA復(fù)制。 (2】需要條件：模板DNA、RNA引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)、離子。 (3)方法：DNA受熱變性解旋為單鏈、冷卻后RNA引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合、在DNA聚合酶作用下延伸合成互補鏈。 (4)特點：指數(shù)形式擴增。 (5)過程：變性、復(fù)性、延伸、重復(fù)。 步驟名稱 需要溫度 過程 第一步變性 90℃～95℃ 將反應(yīng)體系(包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等)加熱至90℃～95℃，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵 打開，變成單鏈DNA，作為互補鏈聚合反應(yīng)的模板 第二步復(fù)性 55℃～60℃ 將反應(yīng)體系降溫至55℃～60℃，使兩種引物分別與模板DNA鏈3’端的互補序列互補配對，這個過程稱為復(fù)性 第三步 延伸合成 70℃～75℃ 將反應(yīng)體系升溫至70℃～75℃，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補的單個核苷酸加到引物所提供的3 7一OH上，使DNA鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補的DNA鏈。 (6)結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2”的形式增加。PCR的反應(yīng)過程都是在PCR擴增儀中完成的。 【例2】2008年5月20日，民政部制訂汶川大地震遇難人員遺體處理意見時指出，無法確認遇難者身份的，由公安部門提取可供DNA檢驗的檢材以便后身份辨認。事后的遺體辨認可借助于DNA雜交技術(shù)，即從遺體細胞與死者家屬提供的死者生前生活用品中分別提取DNA，然后借助DNA雜交技術(shù)對遺體進行確認。請回答下列問題： (1)為了確保辨認的準確性，需要克隆出較多的DNA樣品，這需要借助PCR技術(shù)。使用PCR技術(shù)的具體實驗操作順序是：按配方準備好各組分 離心使反應(yīng)液集中在離心管底部一設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序一進行PCR反應(yīng)。在該操作過程中應(yīng)特別注意的問題是 (2)如表所示為分別從死者遺體和死者生前的生活用品中 提取的三條相同染色體上的同一區(qū)段DNA單鏈的堿基序列，根據(jù)堿基互補配對情況進行判斷，A、B、C三組DNA中不是同一人的是 A組 B組 C組 遺體中的DNA堿基序列 ACTGACGGTT GGCTTATCGA GCAATCGTGC 家屬提供的DNA堿基序列 TGACTGCCAA CCGAATAGCA CGGTAAGACG (3)為什么從死者體細胞與死者家屬提供的其生前生活用品中分別提取的DNA可以完全互補配對? 解析：從遺體細胞和死者家屬提供的死者生前的生活用品中分別提取DNA，在一定溫度下，水浴共熱，使DNA氫鍵斷裂，雙鏈打開。若兩份DNA樣本來自同一個體，在溫度 降低時，兩份樣本中的DNA單鏈通過氫鍵連接在一起，若不是來自同一個體，則兩份樣本中的DNA單鏈在一定程度上不能互補，DNA雜交技術(shù)就是通過這一過程對面目全非 的死者進行辨認的。 答案： (1)用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分PCR實驗使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌 (2)B、C (3)人體所有體細胞均由一個受精卵經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生，其細胞核中均含有相同的遺傳物質(zhì) 三、血紅蛋白的提取和分離 1．實驗原理 (1)蛋白質(zhì)各種特性(如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等)的差異，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。 (2)有效方法——凝膠色譜法：根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)。 ①凝膠是由多糖類化合物構(gòu)成的微小的多孔球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。 ②相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 (3)電泳：蛋白質(zhì)等生物大分子都具有可解離的基團，在一定的pH下會帶上正電或負電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。故電泳可利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 2．實驗操作程序 (2)粗分離——透析 將盛有1 mL血紅蛋白溶液的透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mm01／L的磷酸緩沖液中透析12 h，去除樣品中的小分子雜質(zhì)。 (3)純化——采用凝膠色譜法對血紅蛋白進行分離和純化 (4)純度鑒定：一般用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，來測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，即對血紅蛋白進行純度鑒定。 【例3】紅細胞含有大量的血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題： (1)以上所述的過程即是樣品處理，它包括 、 、分離血紅蛋白溶液。 (2)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。 ①透析的目的是 。 ②透析的原理是 。 (3)然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經(jīng)SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。 ①樣品純化的目的是 。 ②血紅蛋白有什么特點? 。這一特點對進行蛋白質(zhì)的分離有什么意義? 解析：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑檸檬酸鈉。透析可以去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液，透析袋一般是用硝酸纖維素(又稱玻璃紙)制成的，能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內(nèi)。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液，使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 答案： (1)紅細胞的洗滌血紅蛋白的釋放 (2)①去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) ②透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內(nèi) (3)①通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜蛋白除去 ②血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液 使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作 【實戰(zhàn)訓(xùn)練】 （09江蘇卷）23．下列關(guān)于DNA和蛋白質(zhì)提取與分離實驗的敘述，正確的有 A．提取細胞中的DNA和蛋白質(zhì)都需用蒸餾水漲破細胞 B．用不同濃度NaCl溶液反復(fù)溶解與析出DNA可去除蛋白質(zhì) C．蛋白質(zhì)提取和分離過程中進行透析可去除溶液中的DNA D．蛋白質(zhì)和DNA都可以用電泳的方法進行分離純化 答案：BD 解析：A選項，在提取DNA時，如果是用動物的細胞需要用蒸餾水漲破，如果用植物細胞則不需要，而是用洗滌劑溶解細胞膜；用2 mol／L的NaCl溶液溶解DNA，然后過濾出蛋白質(zhì)，再降低NaCl溶液的濃度，析出DNA。DNA和蛋白質(zhì)樣品都是帶負電荷的，從負極向正極移動，移動的距離都和樣品的分子量有關(guān)。C中透析用以出去小分子物質(zhì)，DNA是大分子物質(zhì)，D是常規(guī)方法比如用十二烷基磺酸鈉，可以根據(jù)其分子大小及所帶電荷性質(zhì)進行分離純化 【名師點撥】 關(guān)鍵解讀PCR技術(shù)中的變性、復(fù)性與延伸 (1)變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解旋為單鏈，如圖： (2)復(fù)性：當(dāng)溫度下降至50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合，如圖： (3)延伸：當(dāng)溫度上升至72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，如圖：