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1、尿 樣 中 氧 氟 沙 星 的 含 量 測(cè) 定 實(shí) 驗(yàn) 目 的 ： 1.分 析 臨 床 上 廣 泛 用 于 治 療 泌 尿 系 統(tǒng) ， 呼吸 系 統(tǒng) 感 染 的 藥 物 氧 氟 沙 星 。 2.比 較 LC-UV與 LC-熒 光 分 析 氧 氟 沙 星 的 區(qū)別 。 背 景 資 料 ： 氧 氟 沙 星 是 第 三 代 喹 諾 酮 類 新 型 廣 譜 抗 菌藥 ,并 具 分 布 廣 ,吸 收 好 ,半 衰 期 長(zhǎng) 等 特 點(diǎn) ,臨 床 廣 泛 應(yīng) 用 具 有 廣 譜 抗 菌 作 用 。 尿 樣 采 集 ： 受 試 者 空 腹 飲 水 200ml排 尿 , 留 取 1h后尿 樣 作 空 白 ,一

2、次 口 服 OFLX片 600 mg, 收集 1， 2， 3， 4， 5小 時(shí) 后 的 尿 樣 ， 做 好 標(biāo)記 。 LC-UV法 分 析 尿 樣 中 氧 氟 沙 星 的 含 量一、實(shí)驗(yàn)條件：1.1 實(shí) 驗(yàn) 儀 器 Agilent高 效 液 相 色 譜 儀 ， G1314B-VWD紫 外檢 測(cè) 器 ， 色 譜 柱 ， 量 瓶1.2 實(shí) 驗(yàn) 試 劑 氧 氟 沙 星 片 劑 ， 甲 醇 (色 譜 純 )， 尿 樣 ， 空白 尿 樣 ， HAc溶液 1.3色 譜 條 件 色 譜 柱 :C18 5 m (250 mm 416 mm) 流 動(dòng) 相 : 甲 醇 /0.05 %HAC=80： 20 流 速

3、:1ml/min 進(jìn) 樣 量 ： 20 l 柱 溫 ： 室 溫 檢 測(cè) 波 長(zhǎng) ： 在 250 400nm處 掃 描 ， 選 取 有 最 大 吸收 度 處 作 為 檢 測(cè) 波 長(zhǎng) 。 實(shí) 際 過 程 中 選 用 294nm作 為檢 測(cè) 波 長(zhǎng) 。 二 、 實(shí) 驗(yàn) 方 法2.1 尿 液 的 預(yù) 處 理 取 空 白 尿 樣 和 尿 樣 ， 13000r/min離 心10min， 取 上 清 液 經(jīng) 0.45 m的 水 相 濾 膜 過濾 ， 保 留 濾 液 。 2.2 氧 氟 沙 星 標(biāo) 準(zhǔn) 液 的 配 制 精 密 稱 取 氧 氟 沙 星 片 劑 200 mg ,置 50ml容 量 瓶 中 ,以 流

4、 動(dòng) 相 稀 釋 至 刻 度 ,配 成 4.0 mg/ml的 儲(chǔ) 備 液 ， 用 流 動(dòng) 相 稀 釋 400倍 ， 吸取 20 l作 為 進(jìn) 樣 品。 2.3 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 的 制 作 測(cè) 定 時(shí) ， 取 標(biāo) 準(zhǔn) 液 0.5， 1， 1.5， 2，2.5ml,用 流 動(dòng) 相 稀 釋 于 10ml量 瓶 ， 吸 取20 l作 為 進(jìn) 樣 品 ， 記 錄 色 譜 圖 ， 以 氧 氟 沙星 標(biāo) 準(zhǔn) 濃 度 對(duì) 峰 面 積 進(jìn) 行 回 歸 ， 得 到 回 歸方 程 。 2.4 空 白 尿 樣 的 配 制 取 空 白 尿 液 濾 液 1ml,用 流 動(dòng) 相 稀 釋 20倍 ，吸 取 20 l作 為 進(jìn)

5、 樣 品 。2.5 尿 樣 的 配 制 取 尿 液 濾 液 1ml,用 流 動(dòng) 相 稀 釋 20倍 ， 吸 取20 l作 為 進(jìn) 樣 品 。 2.6 進(jìn) 樣 先 進(jìn) 1針 標(biāo) 準(zhǔn) 品 觀 察 流 動(dòng) 相 配 置 是 否 合 適 ,合 適 后 ,進(jìn) 1針 空 白 尿 樣 觀 察 有 無 雜 質(zhì) 在 測(cè)定 波 長(zhǎng) 處 影 響 左 氧 氟 沙 星 的 吸 收 ,然 后 進(jìn) 樣標(biāo) 準(zhǔn) 品 與 待 測(cè) 樣 品 ,標(biāo) 準(zhǔn) 品 進(jìn) 樣 5針 來 檢 驗(yàn)儀 器 精 密 度 。 2.7回 收 率 實(shí) 驗(yàn) 取 濃 度 為 0.5， 1， 1.5 g/ml的 氧 氟 沙星 尿 樣 ， 稱 取 氧 氟 沙 星 標(biāo) 準(zhǔn)

6、 品 ， 配 置 為 相同 濃 度 ， 通 過 峰 面 積 比 值 ， 測(cè) 定 回 收 率 。 2.8精 密 度 實(shí) 驗(yàn) 取 濃 度 為 0.5 2.5 g/ml的 氧 氟 沙 星 標(biāo) 準(zhǔn)品 ， 1d內(nèi) 重 復(fù) 測(cè) 定 5次 ,測(cè) 得 日 內(nèi) RSD， 隔 日測(cè) 定 5 次 , 測(cè) 得 日 間 RSD。 紫 外 檢 測(cè) 測(cè) 定 尿 液 中 左 氧 氟 沙 星 的含 量 紫 外 檢 測(cè) 測(cè) 定 尿 液 中 左 氧 氟 沙 星 的 含 量 ，實(shí) 驗(yàn) 操 作 方 法 除 檢 測(cè) 器 設(shè) 定 與 熒 光 檢 測(cè) 器不 同 外 （ 檢 測(cè) 波 長(zhǎng) ： 294nm） ， 其 余 設(shè) 置 和操 作 均 與

7、熒 光 檢 測(cè) 時(shí) 相 同 。 三 、 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 熒 光 法 測(cè) 定 尿 樣 中 左 氧 氧 氟 沙 星 濃 度 標(biāo) 準(zhǔn)曲 線 圖 紫 外 法 測(cè) 定 尿 樣 中 左 氧 氟 沙 星 濃 度標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 圖 精密度日 內(nèi) 、 日 間 RSD 測(cè) 量熒 光 法 日 內(nèi) RSD=2.6% 日 間 RSD=3.3%紫 外 法 日 內(nèi) RSD=0.8% 日 間 RSD=2.9% 回 收 率 實(shí) 驗(yàn)回 收 率 熒 光 98.7%、 101.4%、 101.2%； 紫 外 99.6%、 98.4%、 99.1%。 熒 光 法 測(cè) 定 尿 樣 中 排 出 左 氧 氟 沙 星量 （ g） -時(shí) 間 曲

8、 線 紫 外 檢 測(cè) 測(cè) 定 尿 樣 中 排 出 左 氧 氟 沙星 量 （ g） -時(shí) 間 曲 線 熒 光 法 測(cè) 定 尿 樣 中 排 出 左 氧 氟 沙 星的 累 計(jì) 量 （ g） -時(shí) 間 曲 線 紫 外 檢 測(cè) 測(cè) 定 尿 樣 中 排 出 左 氧 氟 沙星 的 累 計(jì) 量 （ g） -時(shí) 間 曲 線 討論 1、 采 用 LC-UV法 與 LC-熒 光 法 分 別 測(cè) 定 尿樣 中 氧 氟 沙 星 的 含 量 ， 并 且 比 較 兩 種 方 法測(cè) 量 結(jié) 果 的 不 同 ， 因 此 要 求 測(cè) 量 過 程 具 有對(duì) 照 性 ： 待 測(cè) 樣 品 ， 標(biāo) 準(zhǔn) 品 ， 空 白 樣 品 的濃 度

9、兩 者 均 相 同 ， 流 動(dòng) 相 也 相 同 ， 都 采 用外 標(biāo) 法 ， 但 因 為 分 析 方 法 的 不 同 ， 檢 測(cè) 波長(zhǎng) 不 同 。 2、 實(shí) 驗(yàn) 中 所 采 用 的 尿 液 因 為 新 鮮 尿 液 ，如 果 無 法 做 到 這 點(diǎn) ， 因 在 尿 液 中 加 入 二 甲苯 等 防 腐 劑 ， 避 免 尿 液 因 細(xì) 菌 繁 殖 造 成 混濁 ， 影 響 試 驗(yàn) 效 果 。 而 且 尿 樣 中 的 藥 物 會(huì)分 解 ， 影 響 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 ， 因 而 最 好 是 現(xiàn) 取 ，實(shí) 驗(yàn) 過 程 中 不 使 用 時(shí) 放 入 冰 箱 保 存 3、 由 于 沒 有 標(biāo) 準(zhǔn) 品 對(duì) 照 ，

10、 在 測(cè) 定 時(shí) 以 左氧 氟 沙 星 片 作 為 標(biāo) 準(zhǔn) 品 使 用 。 而 事 前 沒 有對(duì) 其 中 左 氧 氟 沙 星 的 實(shí) 際 含 量 進(jìn) 行 過 標(biāo) 定 ，也 不 能 排 除 片 劑 中 的 其 他 成 分 （ 如 輔 料 中的 抗 氧 化 劑 等 ） 對(duì) 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 的 影 響 。 4、 實(shí) 驗(yàn) 本 來 應(yīng) 該 統(tǒng) 計(jì) 每 次 的 尿 液 量 ， 計(jì)算 出 每 次 排 尿 中 含 有 的 左 氧 氟 沙 星 的 含 量 ，然 后 制 的 排 出 藥 物 量 -時(shí) 間 曲 線 ， 因 為 本 次實(shí) 驗(yàn) 中 沒 有 精 密 的 容 器 量 尿 液 體 積 ， 只 能大 概 估 計(jì)

11、 尿 液 量 ， 測(cè) 算 出 尿 液 中 藥 物 的 量 。 5、 實(shí) 驗(yàn) 中 考 慮 到 出 峰 時(shí) 間 和 分 離 度 以 及 實(shí) 際 操 作的 便 利 程 度 ， 最 終 選 擇 的 流 動(dòng) 相 甲 醇 ： 0.05%冰 醋酸 溶 液 =80： 20， 但 是 還 是 有 脫 尾 現(xiàn) 象 ， 在 熒 光 檢測(cè) 中 特 別 明 顯 。 6、 從 實(shí) 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) ， 我 們 可 以 認(rèn) 為 熒 光 檢 測(cè) 器 作 為 檢測(cè) 裝 置 ， 靈 敏 度 、 專 屬 性 好 （ 沒 有 雜 質(zhì) 峰 ） ， 較紫 外 檢 測(cè) 器 優(yōu) 。 標(biāo)準(zhǔn)品中左氧氟沙星出峰圖（紫外檢測(cè)器檢測(cè)） min0 0.5 1

12、 1.5 2 2.5 mAU 050 100150 200250 300 VWD1 A, 波長(zhǎng)=294 nm (20080524DOX000028.D) 1.045 尿樣中左氧氟沙星出峰圖（紫外檢測(cè)器檢測(cè)） min0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 mAU 05 1015 2025 3035 VWD1 A, 波長(zhǎng)=294 nm (20080524DOX000033.D) 1.116 2.363 標(biāo)準(zhǔn)品中左氧氟沙星出峰圖（熒光檢測(cè)法） min0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 LU 05 1015 2025 FLD1 A, Ex=295, Em=505 (STU20080523DOX000097.D) 1.165 尿樣中左氧氟沙星出峰圖（熒光檢測(cè)器） min0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 LU 0.250.5 0.751 1.251.5 1.752 FLD1 A, Ex=295, Em=505 (STU20080523DOX000119.D) 1.189