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1、蛋 白 質(zhì) 的 研 究 方 法 蛋 白 質(zhì) 的 分 離 、 定 性 定 量 以 及 測(cè) 序 每種細(xì)胞都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)。為了研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，需將其分離、純化，盡量除去不需要的和變性的蛋白質(zhì)。 所 有 的 分 離 和 純 化 過 程 都 必 須 在 溫 和 的 條 件 下 進(jìn) 行 。 實(shí)質(zhì)：蛋白與非蛋白分開，蛋白質(zhì)之間分開蛋 白 質(zhì) 分 離 純 化 的 一 般 原 則 分 離 純 化 蛋 白 質(zhì) 的 程 序 1）前處理（細(xì)胞或組織處理） 2）粗分級(jí)分離（除去雜蛋白） 3）細(xì)分級(jí)分離 4）結(jié)晶機(jī) 械 破 碎 溶 劑 抽 提 離 心鹽 析 、 等 電 點(diǎn) 沉 淀 等 粗 制 品 前

2、處理 以適當(dāng)方式將組織細(xì)胞破碎，使蛋白質(zhì)以溶解狀態(tài)釋放出來，并保持其天然構(gòu)象和原有生物活性。 動(dòng) 物 組 織 ： 組 織 搗 碎 機(jī) 、 勻 漿 器 和 超 聲 波 破 碎 法 ； 植 物 組 織 ： 研 磨 或 用 纖 維 素 酶 處 理 ； 微 生 物 細(xì) 胞 ： 超 聲 波 法 、 高 壓 擠 壓 或 溶 菌 酶 處 理 。 前 處 理 中 的 注 意 事 項(xiàng)n 組 織 破 碎 需 加 入 適 當(dāng) 緩 沖 液 并 在 低 溫 下 進(jìn) 行 ， 必 要 時(shí) 加入 蛋 白 酶 抑 制 劑 、 巰 基 試 劑 等 。 對(duì) 膜 蛋 白 需 加 入 去 垢 劑使 膜 結(jié) 構(gòu) 瓦 解 ， 再 用 適

3、當(dāng) 的 介 質(zhì) 提 取 。n 若 所 要 的 蛋 白 質(zhì) 主 要 存 在 于 某 一 細(xì) 胞 組 分 ， 如 線 粒 體 、葉 綠 體 、 細(xì) 胞 核 等 ， 可 先 用 差 速 離 心 法 將 其 分 開 ， 再 以該 細(xì) 胞 組 分 作 為 下 一 步 分 離 提 純 的 材 料 。 差 速 離 心 法 的 步 驟 ： n 粗分級(jí) n 通 常 用 鹽 析 、 等 電 點(diǎn) 沉 淀 、 超 濾 、 有 機(jī) 溶 劑 分 級(jí)等 簡 便 、 處 理 量 大 的 方 法 從 蛋 白 質(zhì) 混 合 液 中 除 去大 量 雜 質(zhì) ， 得 到 濃 縮 蛋 白 質(zhì) 溶 液 。n 細(xì)分級(jí) n 選 用 分 辨 率

4、高 的 方 法 進(jìn) 一 步 提 純 ， 如 凝 膠 過 濾 、吸 附 層 析 、 離 子 交 換 層 析 、 反 相 高 效 液 相 層 析 、親 和 層 析 以 及 凝 膠 電 泳 、 等 電 聚 焦 等 。 二 、 蛋 白 質(zhì) 分 離 純 化 的 方 法（一）根據(jù)分子大小不同的分離方法 1.透析和超過濾 透 析：利 用 蛋 白 質(zhì) 分 子 不 能 透 過 半 透 膜 ， 使 它 與 其 它 小分 子 化 合 物 ， 如 無 機(jī) 鹽 、 單 糖 、 雙 糖 、 氨 基 酸 、 小 肽 以 及表 面 活 性 劑 等 分 離 。 半 透 膜 ： 玻 璃 紙 或 高 分 子 合 成 材 料 超過濾

5、：利用壓力或離心力使小分子溶質(zhì)通過半透膜而蛋白質(zhì)被截留在膜上而分離。 2.密度梯度離心： 又稱：離心沉降法最常用的蛋白質(zhì)分離方法。 蛋 白 質(zhì) 顆 粒 在 具 有 密 度 梯 度 的 介 質(zhì) 中 離 心 時(shí) ， 質(zhì) 量 和 密 度大 的 顆 粒 比 質(zhì) 量 和 密 度 小 的 顆 粒 沉 降 得 快 ， 且 每 種 蛋 白 質(zhì)顆 粒 沉 降 到 與 其 自 身 密 度 相 等 的 介 質(zhì) 密 度 梯 度 時(shí) ， 即 停 止不 前 ， 最 后 各 種 蛋 白 質(zhì) 在 離 心 管 中 被 分 離 成 不 同 的 區(qū) 帶 。 超速離心也可用來測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比。

6、常 用 離 心 介 質(zhì) ： 蔗 糖 和 氯 化 銫 密 度 梯 度 離 心原 理 ： 在 強(qiáng) 離 心 力 作 用 下 ， 蛋 白 質(zhì) 分 子 會(huì) 發(fā) 生 沉 降 ，并 與 溶 液 分 離 。 利 用 物 質(zhì) 密 度 的 不 同 ， 經(jīng) 超 速 離心 后 ， 分 布 于 不 同 的 液 層 而 分 離 。 沉 降 速 率 取 決于 離 心 機(jī) 轉(zhuǎn) 速 、 蛋 白 質(zhì) 顆 粒 的 大 小 、 密 度 、 分 子的 形 狀 、 溶 液 的 密 度 和 性 質(zhì) 等 。方 法 ： 先 加 入 適 當(dāng) 的 沉 淀 劑 （ 如 中 性 飽 和 硫 酸 銨 溶 液 、 酸 、堿 等 ） ， 將 蛋 白 質(zhì) 溶

7、 液 轉(zhuǎn) 變 成 懸 浮 液 ， 在 不 同 的 離 心 速 度下 ， 使 不 同 大 小 和 密 度 的 蛋 白 質(zhì) 顆 粒 分 離 。 密 度 梯 度 離 心 的 步 驟 介質(zhì)：交 聯(lián) 葡 萄 糖 、 瓊 脂糖 或 聚 丙 烯 酰 胺 形 成 的 凝膠 顆 粒 。 凝 膠 顆 粒 的 內(nèi) 部是 多 孔 的 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 。3.凝 膠 過 濾 （ 分 子 篩 層 析 ） ： 原理：凝 膠 顆 粒 內(nèi) 部 為 多 孔 的 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 。 當(dāng) 大 小 不 同的 分 子 流 經(jīng) 凝 膠 層 析 柱 時(shí) ， 比 凝 膠 孔 隙 大 的 分 子 不 能 進(jìn)入 珠 孔 內(nèi) ， 從 顆 粒 間 隙

8、穿 過 ， 行 程 短 ， 被 先 洗 脫 下 來 ； 而 較 小 的 分 子 可 以 進(jìn) 入 凝 膠 顆 粒 內(nèi) 部 ， 路 徑 迂 回 曲 折 ，行 程 長 ， 后 洗 脫 下 來 。 這樣根據(jù)不同大小分子所經(jīng)的路徑不同而得到分離: 大分子最先流出層析柱，小分子后流出。凝 膠 過 濾 的 原 理 凝 膠 過 濾 的 步 驟 （ 二 ） 根 據(jù) 溶 解 度 差 別 的 分 離 方 法 等電點(diǎn)沉淀法： 蛋 白 質(zhì) 分 子 在 等 電 點(diǎn) 時(shí) ， 凈 電 荷 為 零 ， 分 子 之 間的 靜 電 排 斥 力 最 小 ， 因 而 容 易 聚 集 形 成 沉 淀 。 當(dāng) 蛋 白 質(zhì) 混 合 溶 液

9、pH被 調(diào) 到 某 一 成 分 等 電 點(diǎn) 時(shí) ，則 該 蛋 白 質(zhì) 大 部 或 全 部 將 沉 淀 出 來 。等 電 點(diǎn) 沉 淀 法 、 鹽 析 法 、 有 機(jī) 溶 劑 沉 淀 法 鹽析法： 蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中，由于水化層被破壞和表面電荷被中和，容易發(fā)生沉淀。 中 性 鹽 在 低 濃 度 時(shí) 可 增 加 蛋 白 質(zhì) 的 溶 解 度 ， 即 鹽 溶 。 原 因是 蛋 白 質(zhì) 分 子 吸 附 鹽 類 離 子 后 ， 而 與 水 分 子 相 互 作 用 加 強(qiáng)； 當(dāng) 離 子 強(qiáng) 度 增 大 到 足 夠 高 時(shí) ， 此 時(shí) 將 奪 取 與 蛋 白 質(zhì) 的 水化 層 ， 且 鹽 中 和 了

10、蛋 白 表 面 的 電 荷 ， 使 蛋 白 質(zhì) 凝 聚 沉 淀 。 不 同 的 蛋 白 質(zhì) 由 于 所 帶 的 電 荷 和 水 化 程 度 不 同 ， 鹽 析 時(shí)所 需 的 鹽 的 濃 度 也 不 相 同 ， 因 而 可 以 將 不 同 的 蛋 白 質(zhì) 加 以分 離 。 分 段 鹽 析 硫 酸 銨 有機(jī)溶劑沉淀法： 在 蛋 白 質(zhì) 溶 液 中 ， 加 入 一 定 量 的 與 水 互 溶 的 有 機(jī) 溶 劑 ，由 于 這 些 溶 劑 與 水 的 親 和 力 強(qiáng) ， 能 夠 破 壞 蛋 白 質(zhì) 的 水 化 層 ， 使 蛋 白 質(zhì) 的 溶 解 度 降 低 而 沉 淀 。 常 用 的 有 機(jī) 溶 劑

11、有 乙 醇 、 甲 醇 和 丙 酮 等 。 為 了 防 止 蛋 白 質(zhì) 在 分 離 過 程 中 發(fā) 生 變 性 ， 有 機(jī) 溶 劑 濃 度 不能 太 高 ， 而 且 需 要 在 低 溫 條 件 下 進(jìn) 行 。 1.電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。 帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動(dòng)。移動(dòng)的速率：fEqv E:電 場(chǎng) 強(qiáng) 度q: 所 帶 的 凈 電 荷f : 摩 擦 系 數(shù) 取 決 于 蛋 白 質(zhì) 顆 粒 的 大 小 同一pH 下，分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移率即異，在電泳時(shí)可以分開。(三 ) 根 據(jù) 電 性 質(zhì) 不 同 的 分 離 方 法 區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖

12、液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。 （1）紙上電泳：用 濾 紙 作 支 持 物 。 （2）凝膠電泳：用 凝 膠 作 支 持 物 , （ 淀 粉 、 瓊 脂 糖 、 聚 丙 烯 酰 胺 ）- + SDS（ 十 二 烷 基 磺 酸 鈉 ） ： 一 種 陰 離 子 型 表 面 活性 劑 ， 能 夠 與 蛋 白 質(zhì) 多 肽 鏈 中 的 氨 基 酸 殘 基 按 大約 1:2 比 例 結(jié) 合 。 這 樣 ， 每 一 個(gè) 蛋 白 質(zhì) 分 子 都 因 為 結(jié) 合 了 許 多 的SDS而 帶 有 大 量 的 負(fù) 電 荷 ， 而 蛋 白 質(zhì) 分 子 原 有 的電 荷 則 可 以 忽 略 。 因 此 ，

13、Eq值 接 近 一 個(gè) 常 數(shù) 。SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 法 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 的 方 法 SDS-PAGE ：利 用 SDS處 理 蛋 白 質(zhì) 后 ， 在 變 性 條 件 下 進(jìn) 行 的聚 丙 烯 酰 凝 膠 電 泳 。 即 “ 變 性 ” 電 泳 。 分離依據(jù)：蛋 白 質(zhì) 分 子 的 大 小 （ 質(zhì) 量 ） 。 基本原理和特點(diǎn) 1） 還 原 劑 處 理 后 ， 二 硫 鍵 斷 裂 ； 非 共 價(jià) 相 互 作 用 破 壞 ， 亞 基 分 離 ； 2） 經(jīng) SDS處 理 后 帶 大 量 負(fù) 電 荷 ， 掩 蓋 了 原 來 的 電 荷 差 異 。 3

14、） 凝 膠 中 的 泳 動(dòng) 速 度 僅 取 決 于 分 子 量 的 大 小 ， 小 的 快 ， 大 的 慢 。 在 1-20萬 范 圍 內(nèi) ， 遷 移 率 （ 移 動(dòng) 距 離 ） 與 分 子 量 的 對(duì) 數(shù) 呈 線 性 關(guān) 系 。 4） 可 測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 的 純 度 ， 分 子 量 及 分 子 中 的 亞 基 數(shù) 。 等電聚焦電泳：外加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有pH梯度的介質(zhì)中移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。+ + 5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度 通 電 5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度 + + + + + + + + 2. 離子交換色譜法 利 用 不 同 的 蛋

15、 白 質(zhì) 分 子 在 溶 液 中 所 帶 電 荷 不 同 ，因 而 與 離 子 交 換 樹 脂 有 不 同 之 吸 附 力 而 分 離 之 。 改 變 溶 液 的 pH值 和 鹽 離 子 濃 度 結(jié) 合 力 最 小 的 蛋 白 質(zhì) 先 洗 脫 下 來 。 常 用 的 是 陽 離 子 交 換 樹 脂 （ 如 羧 甲 基 纖 維 素 ） 層析（chromatography） 是一種利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)行分離分析的技術(shù)方法。 層 析 技 術(shù) 有 l凝膠層析l離子交換層析l吸附層析l親和層析 (四 ) 根 據(jù) 吸 附 性 質(zhì) 不 同 的

16、 分 離 方 法 吸附層析法（吸附色譜法）： 某 些 物 質(zhì) 對(duì) 不 同 種 類 的 蛋 白 質(zhì) 具 不 同 程 度 的 吸 附 能 力 。 利 用 這 種 吸 附 能 力 的 差 異 ， 可 以 將 蛋 白 質(zhì) 進(jìn) 行 分 離 。 蛋 白 質(zhì) 提 純 中 應(yīng) 用 最 廣 的 吸 附 劑 是 結(jié) 晶 磷 酸 鈣 。 洗 脫 液 為 不 同 濃 度 和 不 同 pH的 磷 酸 緩 沖 溶 液 。 (五 ) 根 據(jù) 配 體 特 異 性 的 分 離 親 和 層 析v親和色譜法（Affinity chromatography） 是一種高效分離純化蛋白質(zhì)的方法v 在 固 定 相 載 體 表 面 偶 聯(lián)

17、具 有 特 殊 親 和 作 用 的 配 基 ，這 些 配 基 可 以 與 流 動(dòng) 相 中 溶 質(zhì) 分 子 發(fā) 生 可 逆 的 特 異性 結(jié) 合 而 進(jìn) 行 分 離 的 一 種 方 法 ， 稱 之 為 親 和 層 析 。v 配 基 是 指 能 被 生 物 大 分 子 識(shí) 別 并 與 之 結(jié) 合 的 原 子 、原 子 團(tuán) 和 分 子 。 用 游 離 的 相 應(yīng) 配 體 溶 液 進(jìn) 行 洗 脫 。 親 和 層 析 法 的 原 理 將 某 種 配 基 與 載 體 共 價(jià) 連 接 。 當(dāng) 含 有 待 純 化 的 蛋 白 質(zhì) 溶 液通 過 色 譜 柱 時(shí) ， 該 蛋 白 質(zhì) 即 與 配 基 發(fā) 生 特 異

18、 性 結(jié) 合 而 被 吸附 在 色 譜 柱 上 ， 而 其 它 蛋 白 質(zhì) 則 流 出 柱 外 。 被 結(jié) 合 的 蛋 白 質(zhì) ， 可 以 用 適 當(dāng) 的 洗 脫 液 洗 。 常 用 配 基 ： 抗 體 、 抗 原 、 激 素 、 或 受 體 蛋 白 等 。 色 譜 柱 載 體 ： 瓊 脂 糖 凝 膠 等 。 親 和 層 析 法 的 步 驟 總 結(jié) ： 蛋 白 質(zhì) 的 分 離 純 化 的 方 法 1 、 透 析 、 超 濾n根 據(jù) 性 質(zhì) ： 分 子 大 小 2 、 鹽 析 （ salting out）n根 據(jù) 性 質(zhì) ： 蛋 白 質(zhì) 的 沉 淀n作 用 機(jī) 理 ： 中 性 鹽 中 和 表 面

19、 電 荷 ， 破 壞 水 化 層n影 響 因 素 ： 表 面 電 荷 、 水 化 層 、 溶 劑 性 質(zhì) 3 、 超 速 離 心 ： 分 子 大 小 及 形 狀 、 溶 液 特 性 4 、 電 泳 ：n 根據(jù)性質(zhì)：蛋白質(zhì)的兩性解離n 作用機(jī)理：異性電荷互相吸引n 影響因素：電荷種類及數(shù)量、分子大小及形狀、 溶液離子強(qiáng)度及pH 等 5 、 層 析 （ 1 ） 分 子 篩 （ 凝 膠 過 濾 層 析 ） ： 分 子 大 小 及 形 狀 （ 2 ） 離 子 交 換 層 析 ： 電 荷 、 分 子 量 、 分 子 形 狀 （ 3 ） 吸 附 層 析 ： 吸 附 特 性 （ 4 ） 親 和 層 析 ：

20、生 物 特 性 三 、 蛋 白 質(zhì) 的 分 析 測(cè) 定1.凱氏定氮法2.雙縮脲法3.福林-酚試劑法4.紫外吸收法凝膠電泳N-末端分析 等 含 量 測(cè) 定純 度 鑒 定 蛋 白 質(zhì) 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 的 測(cè) 定 化學(xué)測(cè)定法、超離心沉降速度法 凝膠過濾法、SDS-PAGE 1、化學(xué)組成法 利 用 化 學(xué) 分 析 ， 定 量 測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 中 某 一 特 殊 元 素 的 含 量 ，并 假 定 蛋 白 質(zhì) 中 ， 只 含 有 一 個(gè) 這 種 元 素 的 原 子 ， 即 可 算 出蛋 白 質(zhì) 的 最 低 分 子 量 ：55.84 1000.34 = 16700分 析 血 紅 蛋 白 中 含

21、鐵 量 為 0.34%， 則 血 紅 蛋 白 最 低 分 子 量 為 ：（ 55.84為 鐵 的 原 子 量 ）后 來 用 別 的 方 法 測(cè) 得 血 紅 蛋 白 實(shí) 際 分 子 量 為 67000，由 此 可 知 ， 血 紅 蛋 白 含 有 四 個(gè) 鐵 原 子 。 2、 超 離 心 沉 降 速 度 法 沉 降 系 數(shù) (sedimentation coefficient，S)： 一 種 顆 粒 在 單 位離 心 力 場(chǎng) 中 沉 降 速 率 為 恒 定 值 ， 用 s表 示 。 將 蛋 白 質(zhì) 溶 液 放 在 超 速 離 心 機(jī) 的 離 心 管 中 進(jìn) 行 超 速 離 心 。由 于 超 過 重

22、 力 幾 十 萬 倍 的 離 心 力 的 作 用 ， 而 使 蛋 白 質(zhì) 分 子沉 降 下 來 。 大 小 和 形 狀 都 相 同 的 蛋 白 質(zhì) 分 子 下 沉 速 度 相 同 ， 在 離 心 管中 產(chǎn) 生 一 個(gè) 明 顯 的 界 面 ， 利 用 光 學(xué) 系 統(tǒng) 可 以 觀 察 到 此 界 面的 移 動(dòng) ， 從 而 測(cè) 得 蛋 白 的 沉 降 速 度 。 3、凝膠過濾法： 在 層 析 柱 中 裝 入 葡 聚 糖 凝 膠 顆 粒 。 這 種 凝 膠 顆 粒 具 有 多 孔的 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 。 這 些 網(wǎng) 孔 只 允 許 較 小 的 分 子 進(jìn) 入 顆 粒 內(nèi) ， 而大 于 網(wǎng) 孔 的 分 子

23、 則 被 排 阻 。 當(dāng) 用 洗 脫 液 洗 脫 時(shí) ， 被 排 阻 的相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 大 的 分 子 先 被 洗 脫 下 來 ， 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 小 的分 子 后 下 來 。 凝膠過濾法測(cè)定蛋白質(zhì)M r 凝 膠 過 濾 法 的 計(jì) 算 方 法 將 3種 以 上 相 對(duì) 分 子 質(zhì)量 有 較 大 的 差 異 的 標(biāo) 準(zhǔn)蛋 白 質(zhì) 制 成 混 合 溶 液 ，經(jīng) 上 柱 和 洗 脫 ， 根 據(jù) 洗脫 峰 的 位 置 ， 量 出 各 種蛋 白 質(zhì) 的 洗 脫 體 積 。 此法僅適用于球狀分子的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。 4、SDS-凝膠電泳法： 蛋 白 質(zhì) 分 子 的 相 對(duì) 遷 移 率 與

24、 蛋 白 質(zhì) 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 的 對(duì) 數(shù)成 直 線 關(guān) 系 。 用 幾 種 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 質(zhì) 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 的 對(duì) 數(shù) ， 對(duì) 相 應(yīng) 的 相對(duì) 遷 移 率 作 圖 ， 得 到 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 。 根 據(jù) 測(cè) 得 的 樣 品 的 相 對(duì)遷 移 率 ， 從 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 上 可 以 查 出 樣 品 的 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 。 蛋 白 質(zhì) 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 測(cè) 定從 1953年 英 國 F.Sanger測(cè) 定 了 胰 島 素 的 兩 條 多 肽 鏈 的 氨 基 酸順 序 。 現(xiàn) 在 已 經(jīng) 有 上 千 種 不 同 蛋 白 質(zhì) 的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 被 測(cè) 定 。測(cè)定蛋白質(zhì)

25、的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求 樣 品 必 需 純 （ 97%以 上 ） ； 知 道 蛋 白 質(zhì) 的 分 子 量 ； 知 道 蛋 白 質(zhì) 由 幾 個(gè) 亞 基 組 成 ； 測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 的 氨 基 酸 組 成 ； 并 根 據(jù) 分 子 量 計(jì) 算 每 種 氨 基 酸的 個(gè) 數(shù) 。 測(cè) 定 水 解 液 中 的 氨 量 ， 計(jì) 算 酰 胺 的 含 量 。 片 段 重 疊 法 的 大 體 步 驟 ：1.肽 鏈 （ 亞 基 ） 的 拆 分 ；2.測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 中 氨 基 酸 組 成 ；3.進(jìn) 行 末 端 分 析 ， 確 定 其 肽 鏈 數(shù) 目 、 N-末 端 、 C-末 端 。（ 1） N-末 端 分 析

26、： DNFB法 、 PITC法 （ Edman法 ） 、 DNS法 、 氨 肽 酶 法（ 2） C-末 端 分 析 ： 肼 解 法 、 羧 肽 酶 法 ；4.應(yīng) 用 兩 種 或 兩 種 以 上 的 水 解 方 法 將 所 要 測(cè) 定 的 蛋 白 質(zhì) 肽 鏈斷 裂 ， 各 自 得 到 一 系 列 大 小 不 同 的 肽 段 ； （ 1） 溴 化 氰 裂 解 法 ：（ 2） 酶 水 解 法 ：胰 蛋 白 酶 ： 主 要 作 用 于 堿 性 氨 基 酸 （ Lys、 Arg） 羧 基 形 成 的 肽 鍵 ；胰 凝 乳 蛋 白 酶 (糜 蛋 白 酶 )： 專 一 性 水 解 疏 水 性 氨 基 酸 的

27、 羧 基 形 成 的 肽 鍵 ；胃 蛋 白 酶 ： 斷 裂 鍵 兩 側(cè) 的 氨 基 酸 都 是 疏 水 性 氨 基 酸 ， 如 Phe Phe；5.分 離 純 化 部 分 降 解 的 肽 片 段 ， 分 析 每 一 片 段 的 氨 基 酸 組 成 和排 列 順 序 ； Edman降 解 法 和 酶 水 解 法 。6.確 定 二 硫 鍵 的 位 置 ；7.根 據(jù) 重 疊 肽 的 氨 基 酸 順 序 ， 推 斷 出 完 整 肽 的 氨 基 酸 順 序 。 (1)亞基的拆分 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。 幾 條 多 肽 鏈 借 助 非 共 價(jià) 鍵 連 接 在 一 起 ， 稱 為 寡

28、 聚 蛋 白 質(zhì) ，如 ， 血 紅 蛋 白 為 四 聚 體 ， 烯 醇 化 酶 為 二 聚 體 ； 可 用 8mol/L尿 素 或 6mol/L鹽 酸 胍 處 理 ， 即 可 分 開 多 肽 鏈 (亞 基 ). (2)測(cè)定蛋白質(zhì)分子中亞基的數(shù)目。 通過測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。(3)二硫鍵的斷裂 Reduction or Oxadation :應(yīng)用過甲酸氧化法或-巰基乙醇還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。 巰基（-SH ）的保護(hù)(4)測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成 分 離 、 純 化 的 多 肽 鏈 一

29、部 分 樣 品 進(jìn) 行 完 全 水 解 ， 測(cè) 定它 的 氨 基 酸 組 成 ， 并 計(jì) 算 出 各 種 氨 基 酸 的 分 子 比 ；(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端 測(cè)定氨基酸組成 v Sanger Reagent。 O2N NO2F H2N+ CHR C 弱堿中 O2N NO2NH CHR COOHDNP氨基酸（黃色） O2N NO2NH CHR CO OH +H2O DNP-多肽+ 氨基酸(游離狀態(tài)) 溶劑抽提TLC,HPLC分離,分析鑒定 2. 蛋 白 質(zhì) 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 測(cè) 定 v 優(yōu) 點(diǎn) :是 丹 磺 酰 -氨 基 酸 有 很 強(qiáng) 的 熒 光 性 質(zhì) ， 檢 測(cè) 靈 敏度

30、 可 以 達(dá) 到 110-9mol。 DNS-氨 基 酸 不 需 提 取 ,直 接 用 紙電 泳 或 TLC鑒 定 。N(CH 3)2 SO2Cl H 2N CH CR O H N CH CR OSO2N(CH 3)2+水解 N(CH 3)2SO 2 H N CH CR O OH + 氨基酸丹磺酰氯 多肽N-端 丹磺酰N-端氨基酸 丹磺酰氨基酸 pH 8,9H+, 2. 蛋 白 質(zhì) 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 測(cè) 定 v 此 法 是 多 肽 鏈 C-端 氨 基 酸 分 析 法 。 多 肽 與 肼 在 無水 條 件 下 加 熱 ， C-端 氨 基 酸 即 從 肽 鏈 上 解 離 出 來 ，其 余 的 氨

31、 基 酸 則 變 成 肼 化 物 。 肼 化 物 能 夠 與 苯 甲醛 縮 合 成 不 溶 于 水 的 物 質(zhì) 而 與 C-端 氨 基 酸 分 離 。 H 2N CH CR O H N CH CR O ORn CCHH N OHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORn CCHH 2N OHH 2N CH CR O NH NH 2 +H +NH 2NH 2 氨基酸酰肼 C-端氨基酸 2. 蛋 白 質(zhì) 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 測(cè) 定 (6)多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段 可 采 用 兩 種 或 多 種 不 同 的 斷 裂 方 法 將 多 肽 樣 品 斷 裂 成 兩 套或 多 套 肽 段 或 肽 碎 片 ， 并 將

32、 其 分 離 開 來 。(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序 1 2 3 4 5 Edman(苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法 實(shí)際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。 (8)確定肽段在多肽鏈中的次序 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置 例 題 ： 第 一 套 肽 段 ： QGS PS EQVE RLA HQWT； 第 二 套 肽 段 ： SEQ WTQG VERL APS HQ； N末 端 H肽 段 ， C末 端 為 S肽 段 ； 則 多 肽 鏈 的 順 序 ：

33、HQWT QGS EQVE RLA PS； 層 析 法 是 利 用 被 分 離 樣 品 中 各 組 分 的 化 學(xué) 性 質(zhì) 的 差 別 ， 使各 組 分 以 不 同 比 例 分 布 在 兩 個(gè) 物 質(zhì) 相 中 ； 其 中 一 個(gè) 相 固 定 在 一 定 的 支 持 介 質(zhì) 上 ， 稱 為 固 定 相 ； 另一 個(gè) 是 移 動(dòng) 的 ， 稱 為 移 動(dòng) 相 ； 移 動(dòng) 相 攜 帶 樣 品 流 過 固 定 相 時(shí) ， 在 流 動(dòng) 過 程 中 由 于 各 組分 在 兩 相 中 分 配 比 例 不 同 ， 從 而 以 不 同 速 度 前 進(jìn) ， 達(dá) 到 分離 的 目 的 （ 產(chǎn) 生 分 離 效 果 ）

34、；氨 基 酸 的 分 離 技 術(shù) 層 析 法 的 原 理 原 理 ： 此 方 法 以 濾 紙 為 支 持 物 ， 以 濾 紙 纖 維 所 吸 附 的 水 為固 定 相 ， 以 水 飽 和 的 有 機(jī) 溶 劑 為 移 動(dòng) 相 .將 氨 基 酸 的 混 合樣 品 點(diǎn) 于 濾 紙 上 。 分配定律： 當(dāng)溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中分配，并在一定溫度下達(dá)到平衡時(shí)，溶質(zhì)在兩相中的濃度Cx（及溶解度）的比值為一常數(shù) - 分配系數(shù)（Kd）（ Kd） = Ca （ 溶 質(zhì) 在 溶 劑 A中 的 溶 解 度 ） Cb （ 溶 質(zhì) 在 溶 劑 B中 的 溶 解 度 ） 濾紙層析法 樣 品 混 合 液濾 紙以 水 飽 和 的有 機(jī) 溶 劑 非 極 性 氨 基 酸極 性 氨 基 酸酸 堿 性 氨 基 酸故 分 離 規(guī) 律 如 下 ： 濾 紙 從 上 至 下 氨 基 酸 的 分 離 制 備1.紙層析法2.柱層析法3.薄層層析法4.電泳法5.氨基酸自動(dòng)分析儀 作 業(yè) 題 列舉幾個(gè)根據(jù)分子大小不同的蛋白質(zhì)分離方法 列舉幾個(gè)根據(jù)溶解度差別的蛋白質(zhì)分離方法 簡述層析技術(shù)的原理；凝膠過濾、離子交換層析、親和層析的原理分別是什么？ 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)序的關(guān)鍵步驟