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蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用研究方法 蛋白質(zhì)與DNA相互作用研究方法,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的研究方法,酵母雙雜交系統(tǒng)Yeast Two-Hybrid Systerm 免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down 技術 熒光共振能量轉移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET） 雙分子熒光互補（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC 蛋白質(zhì)芯片技術 其它方法,酵母雙雜交系統(tǒng),1.1 酵母雙雜交技術的原理 酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉錄調(diào)控中建立。他的產(chǎn)生是基于對酵母轉錄因子GAL4性質(zhì)的研究. 基因轉錄不僅需要有特定的DNA順式序列結構，而且也需要有反式轉錄激活因子的參與。 轉錄激活因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成,其中有DNA結合結構域(DNA binding domain, DB)和轉錄激活結構域(activation domain, AD), 它們都是轉錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的BD或AD都不能激活基因轉錄，但不同轉錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能。,如果要研究兩個蛋白之間有無相互作用，可以把這兩 個蛋白分別與DB和AD形成的融合蛋白。 與DB 融合的蛋白稱為“誘餌”(bait)， 與AD融合的蛋白稱為“獵物”(prey)。 如果這兩個蛋白能發(fā)生相互作用, 這兩個融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的轉錄激活因子, 從而激活 報告基因(reporter gene)的轉錄與表達。 通過檢測報告基因的表達產(chǎn)物, 可判別“誘餌”和“獵物” 這兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。,1.1 酵母雙雜交技術的原理,同時將上述兩種載體轉化改造后的酵母，這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。,1.2 酵母雙雜交操作主要流程 1. 分別構建BD和AD融合蛋白載體 2. 分別將重組載體轉化酵母菌細胞 3. 對酵母轉化子進行自激活檢測 4. 將重組載體共轉化酵母菌細胞 5. 檢測報告基因表達產(chǎn)物 6. 分析酵母雙雜交實驗結果,,,BD,AD,BD,AD,,,,,,,,,,,BD,AD,,,,,,,,,,,,x,Y,Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex,實例,Method： For yeast two hybrid studies we generated the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (transcript variant 1) and FAM124B-1,2-pGADT7 (transcript variant 2) FAM124B-1,3-pGBKT7 (transcript variant 1, FAM124B-1,2-pGBKT7 (transcript variant ),,These both plasmids were co-transformed into Y2HGold strain cells together with either the CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181) or the CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302) plasmids.,Tserendulam Batsukh, Yvonne Schulz,et.al.Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex.PLoS One. 2012; 7(12): e52640,Yeast two hybrid assay. Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and the CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2. (C) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, FAM124B transcript variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed.,酵母雙雜交系統(tǒng)是一種在酵母細胞內(nèi)分析蛋白質(zhì)相互作用的技術。主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含Transcription-activating domain的載體。另外還需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。,1.3 應用,它可用于： 檢驗蛋白質(zhì)間的相互作用； 分析蛋白質(zhì)相互作用的結構域； 發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)。,1.4 酵母雙雜交技術的優(yōu)點： 是一種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究技術，比體外的蛋白質(zhì)相互作用技術更接近生物體內(nèi)的真實情況。 基于基因重組技術和分子遺傳學的原理，更便于觀察和檢測實驗結果。 酵母菌是一種低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命現(xiàn)象和規(guī)律。 4. 酵母菌生長迅速、容易培養(yǎng)，便于進行高通量、大規(guī)模的組學研究。,1.5 酵母雙雜交技術的弱點： 1. 假陽性：自激活、多因子參與…… 假陰性：毒性蛋白、膜蛋白、難表達的蛋白…… 低等真核細胞不能完全等同于高等真核生物的情況 酵母雙雜交實驗的結果必須經(jīng)過多方面的驗證，包括： 體外相互作用驗證 體外親和純化（GST pull-down）、體外免疫共沉淀…… 哺乳動物細胞內(nèi)驗證 亞細胞共定位、體內(nèi)免疫共沉淀……,優(yōu)點：生理條件下的結合 缺點：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用,二、免疫共沉淀,2.1 定義及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。,2.2 方法 1) 收獲培養(yǎng)的細胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次 2）細胞裂解液裂解細胞，冰浴30min 3) 12000rpm 離心 30min 4）收集上清并加入適量抗體，4oC搖動1h～過夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(瓊脂糖凝膠)懸液， 4oC搖動1h 6）細胞裂解液洗滌ProteinA/G-Sepharose混合液 7）離心棄上清 8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min 9）離心，上清液跑SDS-PAGE 膠 10）考馬氏亮蘭染色、銀染 Western Blot 質(zhì)譜分析,3.注意事項 1）細胞裂解 采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。 不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種蛋白酶酶抑制劑，如商品化的cocktailer。 2）使用明確的抗體，有的抗體不適宜做免疫共沉淀。 3) 對照實驗的設計。,Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex,實例,,(A) Using the anti-CHD8 (abcam, ab84527) or the anti-CHD7 (abcam, ab31824) antibody for precipitation, we detected with the anti-HA antibody (Roche) an approximately 51 kDa band corresponding to the estimated size of FAM124B transcript variant 1. Lane 1: co-transfected Co-IP, lane 2: untransfected HeLa cells as negative control.,三、GST pull—down技術,3.1 定義及原理 —定義：該技術是通過以適當標簽 和目的基因進行融合表達作為誘餌．從細胞提取物中釣出與目的蛋白相互作用的蛋白。多組分蛋白質(zhì)復合物的分離主要利用固定在瓊脂糖樹脂的反標簽系統(tǒng)完成。 —原理：將誘餌蛋白質(zhì)和用谷胱甘肽-s-轉移酶(glutathione-transferase，GST）標簽融合表達，一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液進行孵育．利用谷胱甘肽瓊脂糖球珠將GST-融合蛋白-目的蛋白復合物沉淀下來，然后進行聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS—PAGE) 鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì),兩種應用： 1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用 2）證實探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用,3.2 方法： 1） GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a, 單一明確的重組蛋白；b，細胞裂解蛋白混合液；c, 體外翻譯cDNA表達得到的未知蛋白） 2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應 4oC 2h 3）離心棄上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，離心 5）取上清進行SDS-PAGE電泳， 6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進一步做質(zhì)譜分析確定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做Western Blot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意：該實驗設立GST對照，反應均在4oC進行,,右邊為GST對照,3.3 GST 融合蛋白沉降實驗結果,CK2α′,GST-TP1,GST,Fig 10 GST pull down assay M: protein molecular weight standard Lane 1: GST Lane 2: GST-TP1+ CK2α′ Lane 3: CK2α＇,3.4 GST pull-down技術優(yōu)缺點,優(yōu)點： 融合蛋白親具有高通量性、高選擇性的特點，由于融合蛋白的多樣性以及表達系統(tǒng)的多樣性(如細菌、果蠅、哺乳動物)，該方法能夠研究蛋白質(zhì)在復雜體系中的相互作用。 缺點： 該方法的成功應用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質(zhì)活性的重組融合蛋白，以及如何避免內(nèi)源性誘餌蛋白的干擾。,四、熒光共振能量轉移（FRET） Fluorescence resonance energy transfer,4.1 熒光信號的產(chǎn)生 熒光基團在某波長的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個更長波長的發(fā)射光。,4.2 什么是FRET? 熒光能量共振轉移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉移現(xiàn)象。當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強（敏化熒光）實際相當于將短波長熒光基團釋放的熒光屏蔽。,4.3 綠色熒光蛋白 60年代，Shimomura等首先從水母（Aequoria Victoria ）中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結合后可產(chǎn)生藍色熒光。然而水母中提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍色熒光，GFP在藍光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光 。,人們在GFP基因的基礎上已經(jīng)制造出藍色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，青色熒光蛋白，又發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。,其中蘭色熒光蛋白和綠色熒光蛋白， 青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白之間可以發(fā)生熒光共振能量轉移,,Tsien & Miyawaki采用FRET技術檢測細胞內(nèi)Ca2+的濃度變化。他們將CFP和YFP分別于鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結合肽融合表達于同一個細胞內(nèi)。當細胞內(nèi)具有高的Ca2+濃度時，鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結合肽結合，可誘發(fā)FRET，使受體蛋白YFP發(fā)出黃色熒光，因此細胞呈黃色。當細胞內(nèi)Ca2+濃度低時，F(xiàn)RET幾乎不發(fā)生，因此檢測時CFP被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，細胞呈綠色。,4.4 應用,在生命科學領域，F(xiàn)RET技術是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，可用于檢測某一細胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。正如前述，當供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團分子的吸收光譜重疊，并且兩個探針的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。而在生物體內(nèi)，如果兩個蛋白質(zhì)分子的距離在10nm之內(nèi)，一般認為這兩個蛋白質(zhì)分子存在直接相互作用。,五、雙分子熒光互補技術（BiFC） (Bimolecular Fluorescence Complementation),基本原理：方法利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突變體的特性作為報告基因，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接.如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團而發(fā)出熒光.在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時間、位置、強弱等情況。,,將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段,分別與目標蛋白連接. 如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團而發(fā)出熒光,Identification of the SIRTUIN1 (SIRT1)-binding domain of BMAL1.,Binding of SIRT1 to BMAL1 deletion mutants was analyzed by bimolecular fluorescence complementation (BiFC). COS7 cells were transfected with plasmids encoding SIRT1-N-terminal of Venus (VN) and BMAL1-C-terminal of Venus (VC) wildtype (WT) or its various mutants (Δnuclear localization sequence [NLS], BMAL1 without a functional nuclear localization signal; Δbasic-helix-loop-helix [bHLH], encoding BMAL1 Δ71 to 140; ΔPer-Arnt-Sim [PAS]-A, BMAL1 Δ210 to 320; ΔPAS-B, BMAL1 Δ350 to 480; Δtranscriptional activation domain [TAD], BMAL1 Δ553 to 625). The images were captured by fluorescence imaging microscopy using specific filter sets for yellow fluorescent protein and red fluorescent protein.,六、蛋白質(zhì)芯片技術 蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結合的蛋白后，可以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點 。,Gong W. et al. (2008) Molecular Plant 1: 27-41.,其它蛋白互作技術,串聯(lián)親和純化（TAP） 表面等離子共振（SPR） 噬菌體展示技術(phage display approach) 融合蛋白親和色譜法(protein fusion affinity chromatography) 原子作用力顯微技術(atomic force microscopy, AFM ),蛋白質(zhì)與DNA相互作用 （一）酵母單雜交系統(tǒng)（Yeast one-hybrid system） 該技術是上世紀90年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術，在酵母細胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。,基本原理：將順式作用元件與最基本啟動子（minimal promoter，Pmin）相連并將報告基因連到Pmin下游，將待測轉錄因子cDNA與酵母轉錄激活結構域（transcription-activating domain, AD）融合表達載體導入酵母細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結合，就激活Pmin啟動子，報告基因表達。,從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結合的轉錄因子示意圖。,（二）噬菌體展示技術,基本原理：將已知的啟動子DNA片段與固相支持物結合； 以改構的噬菌體為載體，把待選基因片段（編碼啟動子DNA結合蛋白的cDNA）定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū)，形成的融合蛋白表達在噬菌的表面，不影響噬菌體的生活周期及天然構型。外源蛋白或多肽表達于噬菌體的表面，與固定或固相支持物結合，通過適當?shù)奶韵?，洗去非特異性結合的噬菌體(即親和富集法)，選出目的噬菌體，而編碼基因作為病毒基因組的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序得知.,（三）DNAase I 足跡實驗,足跡試驗不僅能找到與特異性DNA結合的目標蛋白，而且能告知目標蛋白結合在哪些堿基部位，足跡試驗的方法較多，常用的有DNase Ⅰ足跡試驗、硫酸二甲酯足跡試驗(dimethylsulfate，DMS)，二者原理基本相同.,DNase Ⅰ足跡試驗的基本原理為: 蛋白結合在DNA片段上，保護結合部位不被DNase破壞，這樣，蛋白質(zhì)在DNA片段上留下了“足跡”，在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應于蛋白質(zhì)結合的部位沒有放射性標記條帶。,技術流程為： (1)待檢雙鏈DNA分子用P32作末端標記，通常只標記一端; (2)蛋白質(zhì)與DNA混合，等二者結合后，加入適量的DNase Ⅰ，消化DNA分子，控制酶的用量，使之達到每個DNA 分子只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂，同時設未加蛋白質(zhì)的 對照; (3)從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA加樣在測序凝膠中 作電泳和放射性自顯影，與對照組相比后解讀出足跡部 位的核苷酸序列.,（四）CHIP (Chromatin Immunoprecipitation),染色質(zhì)免疫沉淀技術, 一種可用來確定與某一特定蛋白結合或蛋白定位所在的特異性DNA序列的技術,（五）EMSA (電泳遷移率實驗),