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分子生物學(xué)討論三之,遺傳病的診斷與腫瘤基因治療,遺傳病的基因診斷,一、什么是遺傳病,遺傳病是指完全或部分由遺傳因素決定的疾病，常為先天性的，也可后天發(fā)病。,遺傳病的類(lèi)型,1、染色體病或染色體綜合征：遺傳物質(zhì)的改變?cè)谌旧w水平上可見(jiàn)，表現(xiàn)為數(shù)目或結(jié)構(gòu)上的改變。 2、單基因?。褐敢粚?duì)等位基因的突變導(dǎo)致的疾病，分別由顯性基因和隱性基因突變所致。 3、多基因?。荷婕岸鄠€(gè)基因起作用，與單基因病不同的是這些基因沒(méi)有顯性和隱性的關(guān)系，每個(gè)基因只有微效累加的作用，因此同樣的病不同的人由于可能涉及的致病基因數(shù)目上的不同，其病情嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)均可有明顯的不同，且表現(xiàn)出家族聚集現(xiàn)象，環(huán)境的影響較為顯著。,二、基因診斷,1.基因診斷概念 2.基因診斷特點(diǎn) 3. 基因診斷應(yīng)用范圍 4、基因診斷的發(fā)展過(guò)程 5、基因診斷遇到的問(wèn)題 6、遺傳病基因診斷的注意事項(xiàng),基因診斷定義,某些受精卵或母體受到環(huán)境或遺傳等的影響，引起的下一代基因組發(fā)生了有害改變，產(chǎn)生了疾病，為了有針對(duì)性的解決和預(yù)防，故需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的基因診斷、基因分析才能得到確認(rèn)。又稱(chēng)DNA診斷或分子診斷。,基因診斷的特點(diǎn),高特異性 高靈敏度 早期診斷性 應(yīng)用廣泛性,基因診斷應(yīng)用范圍,1.檢測(cè)病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病等 2.診斷先天遺傳性疾患，產(chǎn)前診斷——優(yōu)生學(xué) 3.檢測(cè)后天基因突變引起的疾病，如腫瘤 4.其他比如親子鑒定，法醫(yī)物證,基因診斷的發(fā)展過(guò)程,1976年美籍華裔科學(xué)家簡(jiǎn)悅威應(yīng)用液相DNA分子雜交技術(shù)成功地進(jìn)行了鐮形細(xì)胞貧血癥的基因診斷 ——標(biāo)志著人類(lèi)遺傳性疾病診斷開(kāi)始進(jìn)入基因診斷的新時(shí)代,發(fā)展過(guò)程,1、利用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析定位遺傳病致病基因； 2、利用分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷； 3、利用PCR技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷； 4、基因芯片用于基因診斷； 5、利用外顯子組捕獲技術(shù)診斷單基因遺傳??； 6、利用全基因組（GWAS）關(guān)聯(lián)分析定位及診斷多基因遺傳病易感基因,相關(guān)問(wèn)題,1、標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題：缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)程以及質(zhì)量認(rèn)證體系。各醫(yī)療機(jī)構(gòu)的操作方法不統(tǒng)一，質(zhì)量難保證； 2、倫理學(xué)問(wèn)題； 3、所用資源及信息安全問(wèn)題,需要相對(duì)明確臨床診斷 需要及時(shí)向患者及其家屬說(shuō)明基因診斷的重要性，以啟發(fā)上述成員的理解與主動(dòng)性 需要在基因診斷中建立家系觀(guān)點(diǎn) 需要注意基因診斷中的倫理問(wèn)題 需要正確理解基因診斷報(bào)告 需要充分理解產(chǎn)前基因診斷的風(fēng)險(xiǎn),遺傳病的基因診斷的注意事項(xiàng),三、基因診斷方法,1.核酸分子雜交 2.聚合酶鏈反應(yīng) 3.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 4.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性連鎖分析 5.DNA序列測(cè)定 6.單核苷酸多態(tài)性和全基因組關(guān)聯(lián)分析 7.生物芯片 8.WESTERN免疫印跡 9.環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù) 10.免疫組織化學(xué)診斷 11..外顯子組捕獲技術(shù),3.單鏈構(gòu)象多態(tài)性,單鏈DNA呈現(xiàn)一種由內(nèi)部分子相互作用形成的三維構(gòu)象，這種構(gòu)象由堿基順序決定。堿基變異則構(gòu)象改變。而構(gòu)象影響了DNA在非變性凝膠中的遷移率。相同長(zhǎng)度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝膠中的不同遷移率而被分離。遷移率不同的條帶可被銀染或者熒光標(biāo)記引物檢測(cè)，然后用DNA自動(dòng)測(cè)序進(jìn)行分析。,4.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,該技術(shù)是利用限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開(kāi)DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性。 如果重排、缺失或者核苷酸置換使內(nèi)切酶識(shí)別序列變成了不能識(shí)別序列或是這種差別使本來(lái)不是內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列變成了內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。這樣就導(dǎo)致了用限制性?xún)?nèi)切酶酶切該DNA序列時(shí)，就會(huì)少一個(gè)或多一個(gè)酶切位點(diǎn)，結(jié)果產(chǎn)生少一個(gè)或多一個(gè)的酶切片段。這樣就形成了用同一種限制性?xún)?nèi)切酶切割不同物種DNA序列時(shí)，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度大小、不同數(shù)量的限制性酶切片段這種變化即可作為診斷指標(biāo)。,6.單核苷酸多態(tài)性和全基因組關(guān)聯(lián)分析,單核苷酸多態(tài)性： 主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。,全基因組關(guān)聯(lián)分析——英文名字叫Genome-wide association study簡(jiǎn)稱(chēng)——GWAS,,全基因組關(guān)聯(lián)分析——是指在人類(lèi)全基因組范圍內(nèi)找出存在的序列變異，即單核苷酸多態(tài)性（SNP），從中篩選出與疾病/性狀相關(guān)的SNPs。,7.生物芯片,又稱(chēng)為基因芯片(gene chip)、DNA微陣列(DNA microarray) DNA芯片技術(shù)基礎(chǔ)是核酸分子雜交,應(yīng)用微電子加工工藝，在玻璃、塑料、硅片等材 料上制備用于生物樣品分離、反應(yīng)或分析的微細(xì)結(jié)構(gòu) 目前主要有兩大類(lèi)： 1. 生物活性微陣列 (bioactive microarray) 2. 基因芯片 (gene chip), DNA微陣列 (DNA microarray),,包括多肽、蛋白質(zhì)、病毒、 細(xì)胞等。 蛋白質(zhì)芯片可直接從體液中檢測(cè)生物分子（免疫芯片只需少量樣品可一次完成對(duì)成千上萬(wàn)種抗原或抗體等致病因素或生物樣品的檢測(cè)分析)。,為最重要的生物芯片，廣泛用于基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、疾病診斷、藥物篩選、基因測(cè)序等。,9.環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 種特異引物,利用一種鏈置換DNA?聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等溫條件(65 ℃左右) 保溫幾十分鐘,即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng),10.免疫組織化學(xué)診斷,對(duì)于某些基因表達(dá)水平發(fā)生改變的疾病可以采取免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行診斷，優(yōu)點(diǎn)是在不改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)的情況下，對(duì)基因表達(dá)終產(chǎn)物——蛋白質(zhì)水平及細(xì)胞中的部位進(jìn)行分析,外顯子捕獲(exon trapping) 是構(gòu)建一種載體，從其插入片段中識(shí)別和回收外顯子序列，從而克隆目的基因。,,,,,,遺傳病的基因診斷,————典型案例,主要內(nèi)容,甲型血友病 脆性X染色體綜合征 成年型多囊腎病 DMD/BMD的缺失型 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào),甲型血友病,血友病為一組遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病。其共同的特征是活性凝血活酶生成障礙，凝血時(shí)間延長(zhǎng)，終身具有輕微創(chuàng)傷后出血傾向，重癥患者沒(méi)有明顯外傷也可發(fā)生“自發(fā)性”出血。 血友病可分為甲型、乙型、丙型和血管性假血友病4種。其中甲型發(fā)病率占人類(lèi)先天性血液系統(tǒng)疾病的85%。甲型血友病，即因子Ⅷ促凝成分（Ⅷ：C）缺乏癥，也稱(chēng)AGH缺乏癥，是一種性聯(lián)隱性遺傳疾病，女性傳遞，男性發(fā)病。 甲型血友病的基因診斷主要鑒定患者家系中的攜帶者或?qū)ξ闯錾奶哼M(jìn)行產(chǎn)前診斷。,甲型血友病的基因診斷,1. 1.F Ⅷ基因到位的DNA印記分析： 1）將基因組用限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化 2）用特異探針雜交，放射自顯影分析 2. F Ⅷ基因突變直接檢測(cè)： 1）依賴(lài)于F Ⅷ基因內(nèi)或旁側(cè)的多態(tài)性的連鎖分析 2）RFLP連鎖分析 3）VNTR分析 4）STR連鎖分析 對(duì)于甲型血友病進(jìn)行基因診斷首先尋找有無(wú)基因到位，其次利用基因內(nèi)的遺傳標(biāo)志進(jìn)行連鎖分析，最后采用PCR—SSCP或PCR—DGGE分析。,脆性X染色體綜合征,脆性X染色體綜合征導(dǎo)致患者智障（Martin-Bell綜合征），脆性X綜合癥是由于在人體內(nèi)X染色體的形成過(guò)程中的突變所導(dǎo)致。在X染色體的一段DNA，由于遺傳的關(guān)系有時(shí)會(huì)發(fā)生改變。一種為完全改變，另一種為DNA過(guò)度甲基化。如果這兩種改變的程度較小，那么患者在臨床表現(xiàn)方面可以沒(méi)有特殊的癥狀或者只有輕微的癥狀。反之，如果這兩種改變的程度較大，就可能出現(xiàn)如下所述的脆性X綜合癥的種種癥狀。,脆性X染色體綜合征基因診斷,常用的方法： （1）PCR—ASO （2）DNA連鎖鏈分析 （3）Southern印跡雜交法 （4）PCR擴(kuò)增,成年型多囊腎病,成年型多囊腎病是一種常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率高，約1000人中有1名致病基因的攜帶者，起病較晚，多在30歲以后，主要為腎和肝中出現(xiàn)多發(fā)性囊腫，臨床表現(xiàn)為腰疼、蛋白尿、血尿、高血壓、腎盂腎炎、腎結(jié)石等，最終可導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。 診斷：本病基因定位在16p13，與α珠蛋白基因3’端相鄰，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明。因此，只能用連鎖分析來(lái)進(jìn)行基因的發(fā)病前診斷和產(chǎn)前診斷。由于通過(guò)家系分析，已證實(shí)APKD的致病基因與α珠蛋白基因3’端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列即3’HVR(3’ hypervariable region)緊密連鎖，而后者在人群中具有高度多態(tài)性，因此可以通過(guò)RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。,DMD/BMD的缺失型,DMD/BMD是一種Ⅹ連鎖隱性遺傳的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)受累的致死性遺傳病。DMD/BMD有70%左右為缺失型。 診斷：此基因很大，缺失可發(fā)生在不同部位，因此應(yīng)盡可能采用多對(duì)引物作PCR擴(kuò)增（多重PCR）來(lái)檢測(cè)。如擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后發(fā)現(xiàn)有帶紋的缺失，即可作出診斷并對(duì)缺失定位（圖13－9），在進(jìn)行產(chǎn)前診斷時(shí)，一般可先通過(guò)檢測(cè)家系中有關(guān)成員，即確定先證者的缺失區(qū)，然后有針對(duì)性地作PCR擴(kuò)增，包括缺失部分的兩端，以判斷胎兒或有關(guān)患兒是否也獲得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。,脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào),脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)是以小腦性共濟(jì)失調(diào)為主要癥狀的常染色體顯性遺傳性疾病，病理改變以小腦、脊髓、腦干變性為主，臨床主要特征為小腦性共濟(jì)失調(diào)，可伴有構(gòu)音障礙、震顫、錐體束征以及癡呆等。 診斷：依據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)臨床檢查的程序來(lái)判斷患者是否存在小腦及脊髓神經(jīng)失調(diào)的臨床體征，然后會(huì)查問(wèn)他的家族史（包括已故的親人），最后結(jié)合磁共振（MRI）及基因測(cè)試，排除其他累及小腦和腦干的變性病，才能判斷患者是否患上脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)。,遺傳病的基因診斷,以血紅蛋白病為例,血紅蛋白病,血紅蛋白?。╤emoglobinopathy）是由于血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)異常（異常血紅蛋白?。?，或珠蛋白肽鏈合成速率異常（珠蛋白生成障礙性貧血，又稱(chēng)海洋性貧血）所引起的一組遺傳性血液病。 臨床可表現(xiàn)溶血性貧血、高鐵血紅蛋白血癥或因血紅蛋白氧親和力增高或減低而引起組織缺氧或代償性紅細(xì)胞增多所致紫紺。,異常血紅蛋白病,鐮刀狀紅細(xì)胞貧血（Hbs） 不穩(wěn)定血紅蛋白?。╱nstable hemoglobinpathies） 血紅蛋白M?。℉bM） 氧親和力改變的血紅蛋白病,地中海貧血,α地中海貧血（α-thalassemia,簡(jiǎn)稱(chēng)α地貧） β地中海貧血（β梩halassemia,簡(jiǎn)稱(chēng)β地貧）,鐮刀狀紅細(xì)胞貧血（Hbs）,異常血紅蛋白β鏈的第6位谷氨酸被纈氨酸所代替。這個(gè)疏水氨基酸正好適合另一血紅蛋白分子β鏈EF角上的“口袋”，這使兩條血紅蛋白鏈互相“鎖”在一起，最終與其他血紅蛋白鏈共同形成一個(gè)不溶的長(zhǎng)柱形螺旋纖維束，使紅細(xì)胞扭旋成鐮刀形。,診斷方法,鐮刀形細(xì)胞性貧血癥的基因診斷可采用PCR-限制性?xún)?nèi)切酶譜分析法。 先用PCR從患者基因組DNA擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的珠蛋白基因片段。 再選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶水解PCR產(chǎn)物,根據(jù)酶切產(chǎn)物在電泳圖譜上的片段數(shù)量和大小做出判斷.也可與特意的寡核苷酸探針進(jìn)行Southern印記雜交分析,根據(jù)雜交圖譜做出判斷.,限制性?xún)?nèi)切酶,采集制備血液DNA 內(nèi)切酶MstⅡ消化 電泳 轉(zhuǎn)膜 P32標(biāo)記的β珠蛋白cDNA雜交 放射自顯影,PCR/限制性?xún)?nèi)切酶,設(shè)計(jì)引物 PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切 電泳 EB染色 直接觀(guān)察,β地中海貧血,β 地中海貧血(β-mediterranean anemia)是指β 鏈的合成受部分或完全抑制的一組血紅蛋白病。 患兒出生時(shí)無(wú)癥狀，多于嬰兒期發(fā)病，生后3～6 個(gè)月內(nèi)發(fā)病者占50%，偶有新生兒期發(fā)病者。發(fā)病年齡愈早，病情愈重。嚴(yán)重的慢性進(jìn)行性貧血，需依靠輸血維持生命，3～4 周輸血1 次，隨年齡增長(zhǎng)日益明顯。,β地中海貧血基因診斷,PCR/ASO斑點(diǎn)雜交法 合成兩對(duì)PCR引物 合成等位特異寡核苷酸探針 制備DNA樣品 PCR擴(kuò)增 斑點(diǎn)印跡雜交 RFLP分析法,腫瘤基因治療,,,,,,,,,,,,,,基本策略和常用方法,基本策略,(一)治療性基因的獲得 (二)基因載體的選擇 (三)靶細(xì)胞的選擇 (四)基因轉(zhuǎn)移方法 (五)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇鑒定 (六)回輸體內(nèi),（一）目的基因的選擇和制備 基因治療的首要問(wèn)題是選擇用于治療疾病的目的基因。 要求：在體內(nèi)僅有少量的表達(dá)就可顯著改善癥狀；該基因的過(guò)高表達(dá)不會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害。 在抗病毒和病原體的基因治療中。所選擇的靶基因應(yīng)在病毒和病原體的生活史和起重要的作用并且該序列是特異的。 　制備目的基因：正向表達(dá)的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是基因組DNA(genomic DNA)片段?？捎脗鹘y(tǒng)的方法（人工合成）獲取，也可采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction PCR)等新技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增。部分反義基因也可采用此法獲得，但多數(shù)情況下采用人工合成的方式制備。,（二）基因的轉(zhuǎn)運(yùn)　　目前已有多種基因轉(zhuǎn)運(yùn)的方式，其基本原則是將外源基因運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。已使用的有病毒載體和非病毒載體兩大類(lèi)。,病毒載體： 病毒具有一些獨(dú)特的性質(zhì)如多數(shù)病毒可感染特異的細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)不易降解；RNA病毒能整合到染色體以及基因水平較高等。因此病毒載體是良好的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。目前已被用作載體的病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)的病毒。皰疹病毒和肝炎病毒等。 【逆轉(zhuǎn)錄病毒用作載體時(shí)需進(jìn)行幾步改造 （1）將天然的野生型RNA前病毒轉(zhuǎn)變成DNA載體，并插入欲轉(zhuǎn)移的相關(guān)外源基因。其基本原則是用標(biāo)記基因和外源基因替代病毒的編碼基因示。 （2）制備輔助細(xì)胞為載體DNA提供其喪失的功能。 （3）將載體DNA導(dǎo)入輔助以產(chǎn)生病毒載體。 （4）病毒載體感染靶細(xì)胞，外源基因在細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)?！?非病毒載體： 這類(lèi)載體的發(fā)展較快，目前主要是脂質(zhì)體，,常見(jiàn)基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的優(yōu)缺點(diǎn),（三）靶細(xì)胞的選擇 　　理論上講，無(wú)論何種細(xì)胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治療中禁止使用生殖細(xì)胞作為靶細(xì)胞，而只能使用體細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)基因的體細(xì)胞必須取材方便，含量豐富，容易培養(yǎng)，壽命較長(zhǎng)?？蛇x擇的細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。在實(shí)際上應(yīng)用中應(yīng)具體根據(jù)目的條件選擇。,（四）細(xì)胞轉(zhuǎn)染 這是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專(zhuān)門(mén)技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類(lèi)途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過(guò)物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見(jiàn)的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。,（五）外源基因的表達(dá)及檢測(cè) 　　在篩選出轉(zhuǎn)化分子后還需要鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中外源基因的表達(dá)狀況。其中包括對(duì)目的基因和標(biāo)記基因表達(dá)的鑒定。常用方法有原位雜交，Northrn雜交，NRA打點(diǎn)雜交，免疫組織化學(xué)染色等，前幾項(xiàng)是檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，后者則是檢測(cè)外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。,常用方法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,補(bǔ)償性基因治療 補(bǔ)償性基因治療是指向缺失某種抑癌基因的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入正常的抑癌基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的表型、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以達(dá)到治療目的。 用基因替代等方法可恢復(fù)和增強(qiáng)腫瘤抑制基因的功能，如將克隆的抑癌基因Rb、p53、p16等導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞，可以逆轉(zhuǎn)其惡性行為，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 但是由于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種癌基因和抑癌基因的多步驟改變，因而難以通過(guò)拮抗某一種癌基因完全控制腫瘤的惡性行為。,抗腫瘤血管形成基因治療 腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與新生血管的形成密切相關(guān)，因此抗血管形成基因治療是非常有潛力控制腫瘤生長(zhǎng)的治療方法。抗腫瘤血管形成基因治療的研究主要包括：針對(duì)血管形成生長(zhǎng)因子及其受體的基因治療，血管形成抑制因子基因治療，針對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的自殺基因治療等。,腫瘤耐藥基因治療,即化療保護(hù)性基因治療，是指化療前向骨髓內(nèi)導(dǎo)入耐藥基 因，保護(hù)骨髓細(xì)胞不受抗腫瘤藥物的損害。 有實(shí)驗(yàn)表明，將藥物劑量提高5～10倍可以克服腫瘤細(xì)胞的抗藥性，但大劑量化療對(duì)人體正常組織及造血系統(tǒng)的損害較重，限制了化學(xué)藥物的用量。,多耐藥基因 (MDRl)編碼P糖蛋白的跨膜蛋白，它有抗腫瘤藥物位點(diǎn)和 ATP位點(diǎn)2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)ATP供能可將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出 從而保護(hù)正常細(xì)胞免受藥物損害。 目前，腫瘤耐藥基因治療的方案是轉(zhuǎn) 入MDRI基因、DHFR基因、MGMT基因等，或者聯(lián)合使用2 種或多種耐藥基因轉(zhuǎn)入造血干細(xì)胞，使造血干細(xì)胞獲得廣譜抗 藥性。,,自殺基因療法,自殺基因療法又稱(chēng)為病毒導(dǎo)向的酶解前藥療法 其原理是將一些病毒或細(xì)菌基因組中的前 藥轉(zhuǎn)換酶基因（也叫自殺基因)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，該基因 編碼特殊的酶可將原先對(duì)高等動(dòng)物無(wú)毒性的前藥在 腫瘤細(xì)胞中代謝為毒性產(chǎn)物，從而引起這些細(xì)胞自 殺。 其作用是：促進(jìn)免 疫效應(yīng)細(xì)胞的分化增殖、加強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷力；直接殺傷癌細(xì) 胞；增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性。,,,,,,,基因聯(lián)合治療,由于腫瘤是多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜疾病，依靠單一 方法并不能達(dá)到理想的抗腫瘤效果，因此多種治療聯(lián)合、針對(duì) 腫瘤的不同特征進(jìn)行治療已經(jīng)成為基因治療發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。,促細(xì)胞凋亡的基因療法,定義： 通過(guò)人為手段改變腫瘤細(xì)胞的某些相關(guān)基因來(lái)使其盡早啟動(dòng)凋亡程序，達(dá)到消滅腫瘤細(xì)胞的目的。 分類(lèi)：促細(xì)胞凋亡的基因治療主要包括通過(guò)反義核酸技術(shù)抑制凋亡抑制基因以及向癌細(xì)胞導(dǎo)入凋亡活化基因兩種方式。,一、通過(guò)反義核酸技術(shù)抑制凋亡抑制基因： Tietze用表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子的抑制子封閉KappaB的活性，使TNh介導(dǎo)的凋亡明顯增加。 由于Survivin是凋亡抑制劑，可用其反義基因腺病毒載體治療直腸癌模型，使癌細(xì)胞凋亡明顯增加，并使化療藥物敏感性上升,促細(xì)胞凋亡的基因療法,向癌細(xì)胞導(dǎo)入凋亡活化基因： 還有研究將VEGFR 2細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)與Fas受體的胞質(zhì)區(qū)聯(lián)合在一起形成復(fù)合受體VEGFR2 Fas，作為VEGF觸發(fā)的死亡受體，用VEGF治療可迅速導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，VEGFR2 Fas可有效地將VEGF的作用逆轉(zhuǎn)，發(fā)揮抗腫瘤的作用。 Fas和TNF均可誘導(dǎo)凋亡，用腺病毒載體輸送Fas配體GFP融合蛋白和TNF凋亡相關(guān)誘導(dǎo)配體轉(zhuǎn)染腦膜瘤細(xì)胞可使凋亡水平明顯升高。 還有其他利用端粒酶、IFN7、p53、IL24基因等進(jìn)行的誘發(fā)凋亡的治療。,抑制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)道路,定義： 抑制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)道路通過(guò)抑制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)道路可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。 信號(hào)傳導(dǎo)道路中酪氨酸激酶與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，主要有EG-FR、VEGFR、DDGFR、Scr、Bcr、Abl等。 如：Kim等采用表達(dá)c met核酶的腺病毒載體轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，Scr激酶活性明顯下降，并認(rèn)為靶向C met信號(hào)通路的治療對(duì)于控制前列腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有重要意義。 還有研究采用EGFR反義RNA治療膠質(zhì)瘤也取得明顯療效。 Bookout等通過(guò)抑制前列腺癌G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)道路而使腫瘤細(xì)胞死亡。,THANK YOU~,,