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項目名稱： 應用納米技術解決胃癌預警與早期診斷中的關鍵科學問題首席科學家： 崔大祥 上海交通大學起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 教育部 上海市科委一、研究內(nèi)容主要研究內(nèi)容：①1① 納米粒子制備及其與胃癌標志物間的相互作用① 納米粒子可控合成與仿生構建利用高分子化學和有機合成化學的方法和原理，設計水溶性好、靶向性強、生物安全性高、環(huán)境友好型 納米粒子材料，如 樹形分子修飾的金納米棒、二氧化硅包裹的熒光磁性納米粒子與熒光碳納米管，并對其結構進行表征。① 胃癌分子標志物的制備、活性 鑒定與表征利用分子克隆與蛋白表達分離純化等技術手段，設計并制備一批胃癌相關基因寡核苷酸探針，然后與納米材料組裝在一起，制備出系列納米胃癌基因探針；制備出一系列胃癌相關蛋白的抗體，獲取抗體 Fab 功能片段，制備成胃癌抗體探針；然后對活性進行鑒定并表征；利用納米顆粒本身的結構特點，利用細胞生物學等技 術， 篩選出高效、靶向的胃癌分子探 針，并對胃癌分子探針組裝方式、性質進行研究。 ③胃癌相關分子標志物的 篩選與納米探針的制備與表征：選擇的胃癌相關分子標志物如 brcaa1,ndr2,UAG4,gcys-20,HAI-178，等。納米載體選擇羧基化的樹形分子修飾的金納米棒，熒光磁性納米粒子，熒光碳納米管等，把分子標志物與納米載體連接，制備成納米探針；采用高分辨電鏡、原子力學顯微鏡、Zeta 電 位、免疫共沉淀方法進行表征。④ 納米探針 與胃癌相關分子 標志物相互作用調(diào)查表面基團種類、性質、密度對固定探針特異性與靈敏度的影響，采用原子力學顯微鏡測量納米粒子與胃癌相關分子標志物之間結合力，以及與待測靶分子之間的親和力，研究可能的影響因素；研究增強制備的探針可溶性與分散性問題，研究不同 PH 值的胃酸條件下胃癌分子探 針的 穩(wěn)定性條件及可能影響因素，研究胃癌探針的靶向性與可能途徑；研究胃癌納米探針的選擇性與特異性的條件。①2① 增強胃癌標志物檢測的敏感度與特異性的納米技術①納米粒子對 胃癌 PCR 的靈敏度與特異性影響② 納米粒子 對胃癌血清抗原抗體 結合的免疫反應 的靈敏度與特異性影響③碳納米管與量子點自 組 裝基礎上的超敏感檢測胃癌相關 標志物的原理、技 術與方法④基于金納米粒子淬 滅熒 光分子的信號與待測抗原的 濃度對數(shù)成線性關系，來建立 URG4,BRCAA1,IPO-38，Ndr2 等做為預警胃癌標志物的超敏感檢測方法，并通過對大樣本的統(tǒng)計學分析，確立早期癌的預警值，從而更好的利用URG4、BRCAA1 抗原的胃癌預警作用， 識別、區(qū)分早期癌和高危、低危癌前期病變，為臨床提供客觀、有力的診斷依據(jù)。⑤研究納米粒子探 針對活 檢組織檢測與免疫組化結 果的影響。①3① 胃癌分子探針在體定位定量可視化① 建立胃癌 動物模型，進行下列研究：（1）充分利用 3.0T MRI 的優(yōu)勢，合理使用快速 T1 /T2 /T2*加權、并行采集和動物表面線圈技術，設計開發(fā)自動或半自動圖象分析軟件，獲得高信號-噪聲比、高的空間和時間分辨率的圖像，并對信號改變做定量或半定量的分析。（2）用拉曼光譜儀和 IVIS 熒光成像系統(tǒng)觀察納米探針進入動物體內(nèi)后的分布、聚集、消除過程，獲取動態(tài)圖像。（3）利用內(nèi)窺鏡共聚焦成像系統(tǒng)獲取納米探針在胃癌組織中的分布圖像。（4）利用超聲成像獲取納米探針在胃癌組織中的圖像。② 在多模態(tài)成像系統(tǒng)下，胃癌納米探針在胃癌組織中成像理論與建模：（1）建立胃癌模型，采用胃癌納米探針對其標記，研究不同的光、聲作用 誘導產(chǎn)生的光（波長、振幅、偏振、熒光壽命、非線性效應）和聲信號的改變，探尋所產(chǎn)生的信號與腫瘤細胞之間的對應關系。（2）考慮到癌細胞在多層胃組織的侵及程度，構建典型的胃癌模型，其中癌變部分用胃癌分子探針來標記，以此來模擬在體胃癌的情況。（3）利用多種模式包括拉曼光譜儀、超聲成像等分子成像技術對模型動物組織樣品開展成像檢測?？疾焖玫降男盘柵c單純胃癌模型所得信號的異同，探討復雜生物組織結構和邊界對分子成像性能的影響；建立不同光、聲信號在組織中的遷移--- 激發(fā)--- 發(fā)射---遷移的理 論模型。③ 胃癌分子的在體定位、定量及可視化：根據(jù)具有熒光磁性特征的胃癌納米探針，通過 MRI 技術對胃癌早期發(fā)生的部位進行宏觀成像與預警，并在 MRI 影像引導下，通過光學內(nèi)窺鏡技術對胃部早期病變部位通過誘發(fā)熒光進行精確的局部定位，達到胃癌的早期預警。利用多種模式包括拉曼光譜儀、超聲成像等分子成像技術對模型動物組織樣品開展成像檢測，獲 取胃癌分子探針的信號強度分布，建立 魯棒有效的三維算法， 對胃組織內(nèi)部胃癌早期預警部位進行實時圖像標記，結合內(nèi)窺鏡所獲得的二維光學熒光信號與 MRI 三維信號，進 行胃癌病變部位信號強度分布的定位定量分析，實現(xiàn)多模態(tài)二維（光學熒光信號、超聲）、三維（MRI 信號）的可視化。①4① 納米粒子和納米探針的體內(nèi)外生物學行為和安全性研究① 納米粒子的 細胞安全性研究巨噬細胞、樹突狀細胞、T 細胞等免疫細胞對不同納米顆粒的反應、作用過程和機制，揭示納米 顆粒對抗原呈遞的作用，對樹突狀細胞成熟， 對免疫細胞趨化運動，對 Thl／Th2 細胞平衡和 CD4＋CD25 ＋Tr 細胞（regulator T，Tr）功能的影響；研究不同納米顆粒以及不同納米特性（如不同尺寸）對轉錄因子（NF-kB 等）、細胞因子和 趨化因子（如白介素-1 、腫 瘤壞死因子）以及炎癥反應相關酶等的影響；揭示納米顆粒誘發(fā)特殊免疫反應的機制。② 胃癌納米探 針的組織 安全性（器官特殊免疫反應 ）擬 通 過 病 理 觀 察 研 究 納 米 顆 粒 所 引 發(fā) 的 可 能 炎 癥 反 應 、刺 激 性 或 過 敏 反 應 ，利 用免 疫 組 化 、蛋 白 質 組 學 等 方 法 研 究 與 炎 癥 相 關 蛋 白 表 達 譜 的 變 化 ，歸 納 和 總 結 納 米 顆 粒誘 發(fā) 特 殊 炎 癥 反 應 ，引 發(fā) 特 殊 免 疫 應 答 的 特 點 與 規(guī) 律 。③ 胃癌納米探 針動物體內(nèi)的 藥代動力學和組織分布研究采用模型動物（小鼠、大鼠）和體外模擬相結合，研究胃癌納米探針在動物體內(nèi)可能環(huán)境中的動力學行為，重點考察納米探針的特殊性質對其在體內(nèi)的分布特性及藥代動力學特征的影響，評價胃癌分子探針在不同體內(nèi)環(huán)境中的導向效果。建立納米材料及其胃癌 納米探針生物效應的數(shù)值分析方法，構建特定納米材料安全性評價的半經(jīng)驗模型。④ 胃癌納米探 針活體安全性的系 統(tǒng)研究研究胃癌納米探針在正常動物體內(nèi)的的急性毒性、長期毒性、特殊毒性及一般藥理包括對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系 統(tǒng)的影響及量效關系，評價包括胃癌分子標志物、納米粒子、胃癌納米探針對生物體的安全程度和進一步作為納米探針開發(fā)的可能性。（a）納米材料本身粒度與 動 物毒性的關系，在 納米材料的粒度均一性和 穩(wěn)定性前提下，測定納米物質的急性毒性、亞急性毒性、慢性毒性；（b）納米探針、納米材料對人正常胃粘膜細胞與胃癌細胞的影響及分子機理；（c）納米材料 經(jīng)不同途徑進 入動物體內(nèi)吸收、分布、生物轉化以及在不同臟器組織中的沉積和排泄、到達靶點并在靶點聚集的過程；（d）納米顆粒對于心血管系統(tǒng)的影響及其與血液系統(tǒng)中細胞成分的相互作用；（e）納米顆粒 對于免疫系統(tǒng) 、神經(jīng)系統(tǒng)的影響；（f）納米物 質對亞細胞結構和生物大分子活性的干擾。測定納米材料對于細胞線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、溶酶體、高爾基體和細胞核等亞細胞 結構的影響，對于細胞膜的立體結構的影響以及對于酶等生物大分子的活性影響。根據(jù)研究結果，對納米粒子、納米探針進行評價，確定胃癌納米探針用于胃癌預警與分子影像診斷的安全有效的方案，解決它們的穩(wěn)定性與生物兼容性問題，并提出安全性評價標準。二、預期目標1、總體目標本項目從我國發(fā)展納米生物學和納米醫(yī)學的需求出發(fā)，應用納米技術研究胃癌早期診斷與預警系統(tǒng)所 涉 及 的 基 本 科 學 問 題 ，以增強胃癌分子檢測的靈敏度與特異性以及胃癌分子在胃局部組織定位定性定量可視化為主要研究內(nèi)容，探索納米材料的生物安全性、靶 標導向性， 為推進我國 納米生物學和納米醫(yī)學的快速發(fā)展、提高我國在這一前沿 領域的競爭力提供技術保障。通過項目的組織實施，促進納米技術、腫瘤診斷學、分子生物學、 藥物化學、藥理學等學科的交叉與融合，培養(yǎng)一批能夠進行創(chuàng)新性研究的交叉學科人才。項 目 的 完 成 將 有 望 為 胃 癌 預警 系 統(tǒng) 這 一 具 有 挑 戰(zhàn) 性 的 科 學 前 沿 問 題 提 供 關 鍵 理 論 與 技 術 支 撐 。2、 五 年 預 期 目 標1．篩選出 3-5 種生物相容性好、相對特異、高生物活性的胃癌分子探針，建立靈敏度高與特異性強的納米技術和方法；建立高效胃癌分子成像的納米技術和新方法；2．完成 2-3 種具有自主知識產(chǎn)權的胃癌標志物超敏感檢測的納米技術方法系統(tǒng)研究，為臨床應用奠定基礎；3．完成 1-2 種具有自主知 識產(chǎn)權的胃癌納米探針 的系統(tǒng)的分子影像研究，為開發(fā)胃癌分子影像探針的臨床前研究奠定基礎；4．建立納米粒子與胃癌納米探針的安全性評價體系；5．促進我國材料學、生物醫(yī)學、藥物化學、 藥理毒理學等學科與 納米醫(yī)學的交叉融合，在胃癌預警的國際前沿領域取得重大創(chuàng)新成果；在本項目結束時，至少獲得一項能應用到臨床的研究成果；6．培養(yǎng)一支高水平的研究團隊，尤其是培養(yǎng)一批在交叉學科領域具有綜合知識和研究能力的人才，通過項目協(xié)作組合形成一支在相關領域有影響的學術梯隊；培養(yǎng)學科帶頭人 4-6 名，碩士研究生 50 名以上，博士研究生 25－30 名，博士后 8－10 名；7． 取得本領域具有國際影響力的重要基礎研究成果，在國際一流刊物上(包括 Nature 系列雜志) 發(fā)表一批高水平的學術論文, 申請 8－10 項專利，發(fā)表 100 篇以上高質量 SCI 學術論文。三、研究方案總體研究方案1．學術思路納米生物學領域取得的進展為胃癌預警與早期診斷研究提供了新的方法。本申請項目以解決應用納米技術研究胃癌早期診斷與預警關鍵科學問題為目標，以研究基于納米粒子的胃癌早期標志物超敏感特異性檢測技術與多模式動態(tài)成像技術，以及 納米探針的制造與安全性評價為研究內(nèi)容，在新一代 熒光超順磁納米粒子、熒光納米晶及其復合納米粒子的制備、性能測試與表征、胃癌早期靶分子特異性分子探針的篩選、靶分子與 納米粒子的復合探針制備、超敏感與特異性的檢測方法與多模式成像技術方法、生物兼容性與安全性以及影像學評價，納米探針等方面做出原創(chuàng)性成果；應用這些理論技術方法，進行源頭創(chuàng)新，開發(fā)出具有我國自主知識產(chǎn)權和國際先進水平的、超敏感的 腫瘤標志物檢測方法，安全性好且針對于胃癌的分子顯像的納米探針，為臨床應用奠定基礎。2．技術方案與途徑根據(jù)上述總體思路，本項目圍繞胃癌預警這個長遠目標，從納米材料改善探針理化性質、生物利用度以及作為分子影像探針出發(fā)，采用“ 在細胞水平上觀測生物效應，在分子水平上揭示作用機理，在動物模型上驗證可行性， 總結胃癌納米探針的特性與胃癌發(fā)生發(fā)展的規(guī)律”的策略，將 納 米技術與腫瘤診斷學、藥物化學、毒理藥理學等學科結 合起來，并 應用于胃癌預 警與早期診斷的研究。 項目設置 4 個課題，項目總體研究方案見圖 1。圖 1. 課題總體研究方案具體研究方案和技術路線如下：1．胃癌相關分子標志物的篩選與探針設計1.1 胃癌相關分子標志物的篩選 采用生物信息學方法從 Genebank 庫中篩選出與胃癌相關基因與蛋白；根據(jù)文獻，篩選出與胃癌早期狀態(tài)密切相關的基因與蛋白，設計寡核苷酸片段探針，設計胃癌相關蛋白的抗體 Fab 片段探針；根據(jù)腫瘤血管與缺氧等特征，設計相關抗體 Fab 片段探針。1.2 胃癌相關基因與抗體的探針制備 根據(jù)設計的胃癌相關基因探針序列，采用DNA 合成儀制備胃癌相關寡核苷酸探針；利用抗體篩選技術平臺，制 備具有生物活性功能的胃癌相關抗體；采用水解法等技術制備抗體 Fab 片段；根據(jù)腫瘤血管與缺氧靶點，在 brcaa1、ndr2、UAG4、gcys-20、gcys-1、HAI-178、survivin、VEGF、av?3、HIF 等中選擇相應的靶點，制備相應抗體 Fab 片段，最終篩選出合適的探針。2．納米粒子的合成與表征2.1 新型納米材料的合成與表征a) 熒光磁性 納米粒子的可控合成利用高溫溶劑前驅體分解法合成磁性納米粒子，采用低溫法合成量子點，利用等離子鍍膜技術，可控地把磁性納米粒子與量子點組裝在一起，然后在表面包裹上二氧化硅，設計實驗并制 備出不同粒徑的熒光磁性納米粒子，研究溫度、溶劑、反應 條件等對最終產(chǎn)物的影響，對產(chǎn)物進行表征 。b) 樹形分子修飾的金納米棒的合成設計不同長徑比的金納米棒，并可控合成；用第 5 代樹形分子取代金米棒表面的 CTAB 分子，制 備出 樹形分子修飾的金納米棒；通 過化學反應，使得樹形分子表面氨基團變成羧基，顯 著增強生物相容性。然后進行表征。c) 熒 光碳納米管的合成利用等離子鍍膜技術，在碳納米管表面鍍上一層膜，然后與量子點連接，在復合物表面包敷上二氧化硅，并進行表征。d) 包裹 ICG 的納米氣泡的合成利用 MEMS 技術可控合成包裹 ICG 的納米氣泡，利用粒度儀進行表征。也可利用全反射熒光顯微鏡進行表征。3．胃癌納米探針的制備及其與生物分子相互作用的機理3.1 胃癌納米探針制備利用羧基與氨基偶聯(lián)或醛基縮合反應，把制備的納米粒子與胃癌相關寡核苷酸探針或抗體片段探針結合，制備成胃癌納米基因探針與胃癌抗體片段探針，研究不同條件下制備的胃癌納米探針的生物活性并進行表征。3.2 分子水平上將胃癌納米探針偶聯(lián)至 AFM 探針上，利用 AFM 檢測不同種類、不同濃度的樣品，通 過實時測定胃癌 納米探針與靶基因或靶蛋白分子之間的相互作用力，來揭示制備的胃癌納米探針的生物活性；利用納米探針的熒光信號與全反射熒光顯微鏡， 進行直接觀察納米探 針與固定的靶基因或靶蛋白之間的相互作用動力學過程，并對測定的信號進行分析。3.2 細胞水平上與靶分子相互作用的研究培養(yǎng)胃癌 SGC7901 細胞株與胃粘膜 GES-1 細胞株，分別加入不同濃度、不同種類的胃癌納米基因探針或胃癌抗體探針作為測試組 ，實驗同時設立細胞對照組及基因及抗體對照組， 納米粒子對照組。利用全反射熒光顯微鏡，采集相互作用動態(tài)圖像，然后分析，揭示在不同條件下胃癌納 米探 針與靶分子相互作用的機理。4．納米粒子對 PCR 靈敏度與特異性的影響4.1 熒光磁性納米粒子對 PCR 的影響以我們報道的檢測胃癌相關基因表達水平的多重 PCR 為模型，調(diào)查修飾與未修飾的熒光磁性納米粒子在胃癌 PCR 過程中，熒光信號的變化規(guī)律，發(fā)展定量PCR 新原理；研究熒光磁性納米粒子對 PCR 特異性的影響規(guī)律，為消除胃癌PCR 檢測的假陽性結果提供理論依據(jù)。4.2 樹形分子修飾的金納米棒對 PCR 的影響以我們報道的檢測胃癌相關基因表達水平的多重 PCR 為模型，調(diào)查樹形分子修飾的金納米棒對胃癌 PCR 的靈敏度與特異性的影響，測定在 PCR 過程中拉曼光譜變化的規(guī)律，闡明其增強 PCR 效率的機理。4.3 熒光碳納米管對 PCR 的影響我們報道過碳納米管增強 PCR 效率，此研究中，深入研究熒光碳納米管在胃癌PCR 檢測過程中熒光信號強度變化的規(guī)律，對靈敏度與特異性的影響機理。5．納米粒子對免疫反應的靈敏度與特異性的影響我們首次報道了金納米粒子熒光淬滅現(xiàn)象基礎上的超敏感抗原定量檢測原理與方法。其原理是：一種抗體修飾磁性納米粒子，另一種抗體修飾納米金粒子，當抗原存在時，抗原抗體反應，形成夾心結構，離心去除夾心復合物，上清中殘余的納米金粒子，可以淬滅 FITC 熒光分子信號，在 516nm 處的熒光淬滅強度與抗原量呈正比。此技術獲得了專利授權（ZL200310109350.3）。我們利用胃癌相關抗原BRCAA1（AF208045）作為檢測 的靶分子，利用 2 個單克隆抗體分別標記熒光磁性納米粒子與金納米粒子（或金納米棒），研究在免疫反應前后，熒光信號強度變化，是否具有規(guī)律性，力求發(fā)展新的靈敏特異的檢測原理與方法。6 胃癌相關分子在體定位定量可視化研究6.1 建立胃癌動物模型，進行下列研究：（1）充分利用 3.0T MRI 的優(yōu)勢，合理使用快速 T1 /T2 /T2*加權、并行采集和動物表面線圈技術，設計開發(fā)自動或半自動圖象分析軟件，獲得高信號-噪聲比、高的空間和時間分辨率的圖像，并對信號改變做定量或半定量的分析。（2）用拉曼光譜儀和 IVIS 熒光成像系統(tǒng)觀察納米探針進入動物體內(nèi)后的分布、聚集、消除過程，獲取動態(tài)圖像。（3）利用內(nèi)窺鏡共聚焦成像系統(tǒng)獲取納米探針在胃癌組織中的分布圖像。（4）利用超聲成像獲取納米探針在胃癌組織中的圖像。6.2 在多模態(tài)成像系統(tǒng)下，胃癌分子探針在胃癌組織中分子成像理論與建模：（1）建立胃癌模型，采用胃癌納米探針對其標記，研究不同的光、聲作用 誘導產(chǎn)生的光（波長、振幅、偏振、熒光壽命、非線性效應）和聲信號的改變，探尋所產(chǎn)生的信號與腫瘤細胞之間的對應關系。（2）考慮到癌細胞在多層胃組織的侵及程度，構建典型的胃癌模型，其中癌變部分用胃癌納米探針來標記，以此來模擬在體胃癌的情況。（3）利用多種模式包括拉曼光譜儀、超聲成像等分子成像技術對模型動物組織樣品開展成像檢測。考察所得到的信號與單純胃癌模型所得信號的異同，探討復雜生物組織結構和邊界對分子成像性能的影響；建立不同光、聲信號在組織中的遷移--- 激發(fā)--- 發(fā)射---遷移的理 論模型。6.3 胃癌分子的在體定位、定量及可視化：根據(jù)具有熒光磁性特征的胃癌納米探針，通過 MRI 技術對胃癌早期發(fā)生的部位進行宏觀成像與預警，并在 MRI 影像引導下，通過光學內(nèi)窺鏡技術對胃部早期病變部位通過誘發(fā)熒光進行精確的局部定位，達到胃癌的早期預警。利用多種模式包括拉曼光譜儀、超聲成像等分子成像技術對模型動物組織樣品開展成像檢測，獲取胃癌分子探針的信號強度分布，建立魯棒有效的三維算法，對胃組織內(nèi)部胃癌早期預警部位進行實時圖像標記，結合內(nèi)窺鏡所獲得的二維光學熒光信號與 MRI 三維信號， 進行胃癌病變部位信號強度分布的定位定量分析，實現(xiàn) 多模態(tài)二維（光學 熒光信號、超聲）、三維（ MRI 信號）的可視化。7．納米探針的生物學效應與安全性7.1 納米探針的藥效學和安全性（毒理學）研究采用 MTT 法研究胃癌納米探針對胃癌細胞株、正常胃粘膜細胞株的生長抑制作用。結合我們過去已建立的胃黏膜癌變模型，考察納米探針的體內(nèi)分布和動力學特征，以國家食品藥品 監(jiān)督管理局藥物評價指南為基礎和指導，參照國際藥物檢測和評價機構所制定的藥理學的評價方法對納米顆粒的生物學效果和毒性進行系統(tǒng)性評價。4.2 胃癌納米探針跨膜轉運機制和細胞器定位特性對納米探針加入細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用流式細胞儀快速定量地測定細胞內(nèi)納米探針的動態(tài)變化，研究 納米探針跨膜轉運能力和胞內(nèi)蓄積特性。運用細胞器熒光探針標記技術結合熒光免疫染色技術研究納米探針在細胞核（Hoechst33342）、溶酶體（LysoTracker Green DND-26）、高爾基體(Brefeldin A)、內(nèi)質網(wǎng)(DiOC 6(3))及線粒體 (MitoTracher Green FM)等亞細胞器定位和分布情況。通過抑制與細胞內(nèi)吞相關蛋白或脂的活性，觀察是否與它們介導的納米探針跨膜轉運有關，如抑制脂筏介導的內(nèi)吞（Cyclodextrin or nystatin）、抑制小窩蛋白介導的內(nèi)吞（Filipin ）、抑制網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞（Chlorpromazine）、抑制肌動蛋白介導的內(nèi)吞（Cytochalasin D）、抑制 細胞粘附分子介 導的內(nèi)吞（amiloride ）和抑制微管的活性（Nocodazole）。7.3 納米探針的細胞內(nèi)運輸機制由選擇性抑制劑或利用基因操作技術對與細胞內(nèi)囊泡生成、轉運、融合有關的信號通路進行抑制，確定 納米探針是否存在亞細胞器間的轉運。如 Brefeldin A抑制囊泡從內(nèi)質網(wǎng)到高爾基體的轉運；Wortmannin 抑制 PI3K 介導的內(nèi)涵體與溶酶體的囊泡融合，并運用全反射熒光顯微鏡、 HR-MAS 核磁共振等技術研究活細胞與納米探針的共存體系以解析納米探針與生物膜的相互作用及其跨膜轉運和胞內(nèi)運輸機制。7.4 納米粒子及其納米探針的活體安全性評價采用模型動物（小鼠、大鼠）分別研究納米粒子與納米探針在動物體內(nèi)的組織分布和動力學行為；研究不同體液環(huán)境的納米粒子及其納米探針在生物體內(nèi)的代謝動力學；研究在正常動物體內(nèi)納米粒子的急性，亞急性及可能的長期毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性和免疫原性；研究納米探針的分子及細胞安全性。為進一步納米探針的應用奠定安全性評價標準。四、年度計劃年度計劃內(nèi)容和目標：第一年度計劃內(nèi)容：1．胃癌相關分子標志物的篩選與探針設計胃癌相關分子標志物的篩選 采用生物信息學方法從 Genebank 庫中篩選出與胃癌相關基因與蛋白；根據(jù)文獻，篩選出與胃癌早期狀態(tài)密切相關的基因與蛋白，設計寡核苷酸片段探針，設計胃癌相關蛋白的抗體 Fab 片段探針；根據(jù)腫瘤血管與缺氧等特征，設計相關抗體 Fab 片段探針。部分胃癌相關基因與抗體的探針制備 根據(jù)設計的胃癌相關基因探針序列，采用DNA 合成儀制備胃癌相關寡核苷酸探針；利用抗體篩選技術平臺，制 備具有生物活性功能的胃癌相關抗體；采用水解法等技術制備抗體 Fab 片段；根據(jù)腫瘤血管與缺氧靶點，在 brcaa1、ndr2、UAG4、gcys-20、gcys-1、HAI-178、survivin、VEGF、av?3、HIF 等中選擇相應的靶點，制備相應抗體 Fab 片段。2．納米粒子的合成與表征熒光磁性納米粒子的可控合成利用高溫溶劑前驅體分解法合成磁性納米粒子，采用低溫法合成量子點，利用等離子鍍膜技術，可控地把磁性納米粒子與量子點組裝在一起，然后在表面包裹上二氧化硅，設計實驗并制備出不同粒徑的熒光磁性納米粒子，研究溫度、溶 劑、反應條件等對最終產(chǎn)物的影響，對產(chǎn)物進行表征。樹形分子修飾的金納米棒的合成設計不同長徑比的金納米棒，并可控合成；用第 5 代樹形分子取代金米棒表面的CTAB 分子，制 備出樹形分子修 飾的金納米棒；通過 化學反應，使得樹形分子表面氨基團變成羧基，顯著增強生物相容性。然后 進行表征。熒光碳納米管的合成利用等離子鍍膜技術，在碳納米管表面鍍上一層膜，然后與量子點連接，在復合物表面包敷上二氧化硅，并進行表征。氧化鋅納米材料的合成利用 CVD 等技術，合成氧化鋅納米材料，并 進行表征。3．納米粒子對 PCR 靈敏度與特異性的影響以我們報道的檢測胃癌相關基因表達水平的多重 PCR 為模型，調(diào)查修飾與未修飾的熒光磁性納米粒子在胃癌 PCR 過程中，熒光信號的變化規(guī)律，發(fā)展定量PCR 新原理；研究熒光磁性納米粒子對 PCR 特異性的影響規(guī)律，為消除胃癌PCR 檢測的假陽性結果提供理論依據(jù)；調(diào)查樹形分子修飾的金納米棒對胃癌PCR 的靈敏度與特異性的影響，測定在 PCR 過程中拉曼光譜變化的規(guī)律，闡明其增強 PCR 效率的機理；深入研究熒光碳納米管在胃癌 PCR 檢測過程中熒光信號強度變化的規(guī)律，對靈敏度與特異性的影響機理。4．建立胃癌動物模型，為活體分子影像研究奠定基礎。5．對部分納米材料進行生物學效應與安全性評價采用 MTT 法研究合成的納米粒子對胃癌細胞株、正常胃粘膜細胞株的生長抑制作用。結合我們過去已建立的胃黏膜癌變模型，考察納米探針的體內(nèi)分布和動力學特征，以國家食品藥品監(jiān)督管理局藥物評價指南為基礎和指導，參照國際藥物檢測和評價機構所制定的藥理學的評價方法對納米顆粒的生物學效果和毒性進行系統(tǒng)性評價。目標：制備出高質量的不同粒徑的熒光磁性納米粒子、量子點、金納米棒等納米材料；篩選、設計并制備出胃癌相關基因探針與抗體探針，然后與納米粒子復合，制 備成胃癌納米探針；闡明納米粒子對胃癌 PCR 的靈敏度與特異性影響的原理；建立胃癌動物模型，為分子影像研究奠定基礎；對部分納米粒子進行安全性評價研究。第二年度計劃內(nèi)容：1．部分胃癌相關基因與抗體的探針制備 根據(jù)設計的胃癌相關基因探針序列，采用 DNA 合成儀制備胃癌相關寡核苷酸探針；利用抗體篩選技術平臺，制 備具有生物活性功能的胃癌相關抗體；采用水解法等技術制備抗體 Fab 片段；根據(jù)腫瘤血管與缺氧靶點，在 brcaa1、ndr2、UAG4、gcys-20、gcys-1、HAI-178、survivin、VEGF、av?3、HIF 等中選擇相應的靶點，制備相應抗體 Fab 片段，最終篩選出合適的探針。2．納米粒子對免疫反應的靈敏度與特異性的影響我們首次報道了金納米粒子熒光淬滅現(xiàn)象基礎上的超敏感抗原定量檢測原理與方法。其原理是：一種抗體修飾磁性納米粒子，另一種抗體修飾納米金粒子，當抗原存在時，抗原抗體反應，形成夾心結構，離心去除夾心復合物，上清中殘余的納米金粒子，可以淬滅 FITC 熒光分子信號，在 516nm 處的熒光淬滅強度與抗原量呈正比。此技術獲得了專利授權（ZL200310109350.3）。我們利用胃癌相關抗原BRCAA1（AF208045）作為檢測 的靶分子，利用 2 個單克隆抗體分別標記熒光磁性納米粒子與金納米粒子（或金納米棒），研究在免疫反應前后，熒光信號強度變化，是否具有規(guī)律性，力求發(fā)展新的靈敏特異的檢測原理與方法。3．MRI 等多模式分子影像研究充分利用 3.0T MRI 的優(yōu)勢，合理使用快速 T1 /T2 /T2*加權、并行采集和動物表面線圈技術，設計開發(fā)自動或半自動圖象分析軟件，獲得高信號-噪聲比、高的空間和時間分辨率的圖像，并對信號改變做定量或半定量的分析。用拉曼光譜儀和 IVIS 熒光成像系統(tǒng)觀察納米探針進入動物體內(nèi)后的分布、聚集、消除過程，獲取動態(tài)圖像。利用內(nèi)窺鏡共聚焦成像系統(tǒng)獲取納米探針在胃癌組織中的分布圖像。利用超聲成像獲取納米探針在胃癌組織中的圖像。4. 胃癌納米探針跨膜轉運機制和細胞器定位特性對納米探針加入細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用流式細胞儀快速定量地測定細胞內(nèi)納米探針的動態(tài)變化，研究 納米探針跨膜轉運能力和胞內(nèi)蓄積特性。運用細胞器熒光探針標記技術結合熒光免疫染色技術研究納米探針在細胞核（Hoechst33342）、溶酶體（LysoTracker Green DND-26）、高爾基體(Brefeldin A)、內(nèi)質網(wǎng)(DiOC 6(3))及線粒體 (MitoTracher Green FM)等亞細胞器定位和分布情況。通過抑制與細胞內(nèi)吞相關蛋白或脂的活性，觀察是否與它們介導的納米探針跨膜轉運有關，如抑制脂筏介 導的內(nèi)吞（Cyclodextrin or nystatin）、抑制小窩蛋白介導的內(nèi)吞（Filipin ）、抑制網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞（Chlorpromazine）、抑制肌動蛋白介導的內(nèi)吞（Cytochalasin D）、抑制 細胞粘附分子介 導的內(nèi)吞（amiloride ）和抑制微管的活性（Nocodazole）。目標：篩選、設計并制備出胃癌相關基因探針與抗體探針，然后與納米粒子復合，制備成胃癌納米探針；揭示納米粒子對胃癌血清抗原抗體結合的免疫反應的靈敏度與特異性影響的機理；獲取基于熒光磁性納米粒子、金納米棒等基礎上的MRI、超聲成像、表面增強拉曼、IVIS 熒光成像、內(nèi)窺鏡下激光共聚焦分子成像的信號強度分布資料；研究納米探針跨膜轉運能力和胞內(nèi)蓄積特性。第三年研究內(nèi)容：1．胃癌納米探針與生物分子相互作用的機理分子水平上與生物分子相互作用將胃癌納米探針偶聯(lián)至 AFM 探針上，利用 AFM 檢測不同種類、不同濃度的樣品，通 過實時測定胃癌 納米探針與靶基因或靶蛋白分子之間的相互作用力，來揭示制備的胃癌納米探針的生物活性；利用納米探針的熒光信號與全反射熒光顯微鏡， 進行直接觀察納米探 針與固定的靶基因或靶蛋白之間的相互作用動力學過程，并 對測定的信號進 行分析。細胞水平上與靶分子相互作用的研究培養(yǎng)胃癌 SGC7901 細胞株與胃粘膜 GES-1 細胞株，分別加入不同濃度、不同種類的胃癌納米基因探針或胃癌抗體探針作為測試組 ，實驗同時設立細胞對照組及基因及抗體對照組， 納米粒子對照組。利用全反射熒光顯微鏡，采集相互作用動態(tài)圖像，然后分析，揭示在不同條件下胃癌納 米探 針與靶分子相互作用的機理。2．系統(tǒng)研究碳納米管與量子點自組裝基礎上的超敏感檢測胃癌相關標志物的原理、技術與方法；3 在多模態(tài)成像系統(tǒng)下，胃癌分子探針在胃癌組織中分子成像理論與建模：（1）建立胃癌模型，采用胃癌納米探針對其標記，研究不同的光、聲作用 誘導產(chǎn)生的光（波長、振幅、偏振、熒光壽命、非線性效應）和聲信號的改變，探尋所產(chǎn)生的信號與腫瘤細胞之間的對應關系。（2）考慮到癌細胞在多層胃組織的侵及程度，構建典型的胃癌模型，其中癌變部分用胃癌納米探針來標記，以此來模擬在體胃癌的情況。（3）利用多種模式包括拉曼光譜儀、超聲成像等分子成像技術對模型動物組織樣品開展成像檢測?？疾焖玫降男盘柵c單純胃癌模型所得信號的異同，探討復雜生物組織結構和邊界對分子成像性能的影響；建立不同光、聲信號在組織中的遷移--- 激發(fā)--- 發(fā)射---遷移的理 論模型。4 納米粒子及其納米探針的活體安全性評價采用模型動物（小鼠、大鼠）分別研究納米粒子與納米探針在動物體內(nèi)的組織分布和動力學行為；研究不同體液環(huán)境的納米粒子及其納米探針在生物體內(nèi)的代謝動力學；研究在正常動物體內(nèi)納米粒子的急性，亞急性及可能的長期毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性和免疫原性；研究納米探針的分子及細胞安全性。為進一步納米探針的應用奠定安全性評價標準。目標：研究制備的納米探針的生物活性并進行表征；研究胃癌相關基因探針與納米材料之間的相互作用；系統(tǒng)研究碳納米管與量子點自組裝基礎上的超敏感檢測胃癌相關標志物的原理、技術與方法；實現(xiàn)各種成像模式相互補充，最后獲取完整的胃癌病理生理信息；對納米材料、納米探針在體內(nèi)的吸收、分布、代 謝過程，以及對細胞、組織、器官、神經(jīng)系統(tǒng)及遺傳物質的影響 進行評估。第四年研究內(nèi)容：1．研究納米探針與納米材料之間相互作用的機理，提出納米材料對胃癌分子探針生物活性影響的理論模型；2．研究基于金納米粒子淬滅熒光分子的信號與待測抗原的濃度對數(shù)成線性關系，來建立 URG4,BRCAA1,IPO-38，Ndr2 等做為預警胃癌標志物的超敏感檢測方法，3 胃癌分子的在體定位、定量及可視化：根據(jù)具有熒光磁性特征的胃癌納米探針，通過 MRI 技術對胃癌早期發(fā)生的部位進行宏觀成像與預警，并在 MRI 影像引導下，通過光學內(nèi)窺鏡技術對胃部早期病變部位通過誘發(fā)熒光進行精確的局部定位，達到胃癌的早期預警。利用多種模式包括拉曼光譜儀、超聲成像等分子成像技術對模型動物組織樣品開展成像檢測，獲取胃癌分子探針的信號強度分布，建立魯棒有效的三維算法，對胃組織內(nèi)部胃癌早期預警部位進行實時圖像標記，結合內(nèi)窺鏡所獲得的二維光學熒光信號與 MRI 三維信號， 進行胃癌病變部位信號強度分布的定位定量分析，實現(xiàn) 多模態(tài)二維（光學 熒光信號、超聲）、三維（ MRI 信號）的可視化。4．研究納米材料引發(fā)特殊免疫反應的特點與規(guī)律；采用模型動物（小鼠、大鼠）研究納米探針在動物體內(nèi)的組織分布、動力學行為、 動物毒性和毒理學機制。目標：提出納米材料對胃癌分子探針生物活性影響的理論模型，提出胃癌納米探針活性的評價標準；研究基于金納米粒子淬滅熒光分子的信號與待測抗原的濃度對數(shù)成線性關系，來建立 HAI178,BRCAA1,IPO-38，Ndr2 等做為預警胃癌標志物的超敏感檢測方法，并通過對大樣本的統(tǒng)計學分析，確立早期癌的預警值；對胃組織內(nèi)部胃癌早期預警部位進行實時圖像標記，進行二維（光學熒光信號、超聲）、三維（MRI 信號）的可視化處理；研究納米材料引發(fā) 特殊免疫反應的特點與規(guī)律；采用模型動物（小鼠、大鼠）研究納米探針在動物體內(nèi)的組織分布、動力學行為、動物毒性和毒理學機制。第五年研究內(nèi)容：1．特別闡明納米材料對胃癌分子探針生物活性影響的關鍵途徑和機制，提出胃癌納米探針生物活性的評價標準。2．通過對大樣本的統(tǒng)計學分析，確立早期癌的預警值，從而更好的利用HAI178、BRCAA1 等抗原的胃癌 預警作用， 識別、區(qū)分早期癌和高危、低危癌前期病變，為臨床提供客觀、有力的診斷依據(jù)。3．基于 vtk 圖像軟件包對腫 瘤進行圖像重建，建立完善的二維、三維可視化體系。對體內(nèi)的腫瘤部位進行有效的定位配準，建立有效的分析系統(tǒng)，實現(xiàn)數(shù)據(jù)分析與處理的統(tǒng)一計算框架與算法平臺，在分子水平上實現(xiàn)生物有機體生理、病理變化的實時、無創(chuàng)、動態(tài)連續(xù)在體成像， 實現(xiàn)二維三維可 視化的定量分析研究。4.完善并總結胃癌納米探針的安全性評價數(shù)據(jù)，確立納米材料及其特定的納米探針生物效應分析方法等，給出明確結論；5．完善并整理胃癌預警數(shù)據(jù)庫及分析軟件，完善胃癌信息網(wǎng)。目標：闡明納米材料對胃癌分子探針生物活性影響的關鍵途徑和機制，提出胃癌納米探針生物活性的評價標準；確立胃癌標志物超敏感的檢測原理方法，確立早期癌的預警值，從而更好的利用 BRCAA1 等抗原的胃癌預警作用， 識別、區(qū)分早期癌和高危、低危癌前期病變， 為臨床提供客觀、有力的診斷依據(jù)；實現(xiàn)各種成像模式相互補充，最后獲取完整的胃癌病理生理信息；采用模型動物（小鼠、大鼠）研究納米探針在動物體內(nèi)的組織分布、動力學行為、動物毒性和毒理學機制；確立納米材料及其特定納米探針生物效應分析方法等；最終篩選出具有應用前景的安全性胃癌納米探針，完善胃癌預警數(shù)據(jù)庫與胃癌信息網(wǎng)，為臨床胃癌患者提供直接咨詢服務。