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項目名稱： 卵巢衰老及相關重大疾病的發(fā)生機理首席科學家： 韓際宏 南開大學起止年限： 2010年 1月-2014 年 8月依托部門： 天津市科委 教育部一、研究內容擬解決的關鍵科學問題以小鼠、猴和患者組織標本為研究對象，揭示卵巢衰老機理及其誘發(fā)的不孕不育、生殖系統(tǒng)疾病、心血管疾病、乳腺癌等重大疾病生理、病理改變的分子網(wǎng)絡及其信號轉導通路。闡明卵巢衰老機制，為尋找推遲卵巢衰老措施、發(fā)現(xiàn)治療相關疾病新藥靶點和有效途徑提供理論依據(jù)。、、卵巢衰老的發(fā)生機理1、卵子與卵泡衰老的分子信號通路A. 不同年齡層次原始卵泡、腔前卵泡相關分子的變化：采用基因芯片及蛋白組學技術對各種動物模型中的原始卵泡、腔前卵泡相關分子的變化展開研究。B. 不同年齡層次卵子及顆粒細胞衰老相關分子變化：通過定量蛋白質組學方法等對不同年齡段卵子進行蛋白差異表達譜進行分析。重點考察與染色體穩(wěn)定、濃縮、分離以及組蛋白修飾、DNA 損傷修復等事件相關的蛋白，篩選和克隆卵子老化相關的新基因。C. 卵泡凋亡在卵巢衰老中的分子機制：衰老與相關蛋白相互作用決定著衰老過程的發(fā)展。因此，研究蛋白質的表達變化是研究衰老過程的關鍵。思路 為：收集卵巢(腔前卵泡、有腔卵泡和整個卵巢)樣品，用免疫組化、原位雜交鑒定相關分子其RNA 和蛋白質的表達。2、端粒和端粒酶在卵子與顆粒細胞衰老中的重要作用端粒變短引起干細胞功能受損并引發(fā)心血管疾病、高血壓等其它早衰綜合癥。端粒的長短由端粒酶活性來維持。端粒酶通過調控 DNA 甲基化來穩(wěn)定 Dnmt1 的活性和基因組甲基化來阻止細胞凋亡(Dnmt1 活性與基因組甲基化是延長生命的關鍵條件，但卻隨年齡增加而下降)。端粒 酶還可促 進干細胞的產(chǎn)生。我 們將分析不同年齡層次卵子和顆粒細胞中的端粒功能和端粒酶活性，揭示其在抗衰老中的重要作用。3、活性氧自由基(ROS) 造成機體 DNA 損傷研究卵巢衰老過程中 ROS 的產(chǎn)生、 DNA 損傷 與基因突變。通 過適當?shù)匮a充有效的抗氧化劑手段，達到降解過量 ROS 的目的。探索以抗氧化方式延 緩卵泡凋亡、延長生殖年齡的新途徑。4、卵子與 顆粒 細胞衰老過程中鈣動力學與鈣處理蛋白的變化建立卵子與顆粒細胞衰老的細胞模型，比較體外衰老過程中鈣動力學和鈣處理蛋白的變化。研究鈣處理蛋白及鈣動力學是如何參與卵子及顆粒細胞的凋亡過程。、、卵巢衰老誘發(fā)女性生殖系統(tǒng)疾病的分子機理1、卵巢早衰分子機制的研究對中國漢族 POF 患者全基因組關聯(lián)分析，找到與卵巢早衰相關的基因；篩查POF 患者中卵子發(fā)生關鍵基因 PTEN、FOXO3a、FOXO1a 的突變情況; 研究卵子發(fā)生關鍵基因 PTEN、FOXO3a、FOXO1a 與卵巢早衰的相關性; 采用直接測序法篩查 POF 患者 PTEN、FOXO3a、FOXO1a 基因突變情況并進一步地探討突變蛋白的功能改變。2、發(fā)育相關基因和女性不孕不育等生殖疾病的分子聯(lián)系 利用卵巢切除模擬的生殖衰老模型和多種條件性基因敲除小鼠模型，探討發(fā)育相關基因，重點是 Wnt 基因家族在胎盤發(fā)育中的 調節(jié)作用，揭示 Wnt 信號通路異常和胎盤功能障礙等妊娠疾病的分子聯(lián)系；探討 Wnt 信號通路的相關分子在不同妊娠階段胎盤中的表達模式；分析妊娠小鼠著床位點及胎盤中總 β-catenin 和活化的 dephospho β-catenin 的水平變化；研究 Wnt 信號對小鼠胎盤發(fā)生及滋養(yǎng)層細胞增殖分化等的影響；鑒定 Wnt 信號通路不同成 員在滋養(yǎng)層干細胞不同的增殖或分化階段的表達水平與變化，探討 Wnt 通路相關成 員對滋養(yǎng)層細胞增殖分化等特性的影響。3、卵巢衰老引起的子宮疾病(子宮脫垂) 的發(fā)病機理A. 與子 宮中 彈性纖維合成有關的基因表達分析 : 研究與子宮彈性纖維合成有關的主要是 LOX 家族基因在小鼠和猴子個體出生、 發(fā)育、成熟，特別是衰老過程中在子宮中的表達進行分析。B. 利用基因敲除技術研究 LOXL2 和 LOXL3 在子宮中的功能: 對基因敲除小鼠表型進行分析，以發(fā)現(xiàn) LOXL2 和 LOXL3 在子宮中的功能與子宮脫垂的關系。C. 雌激素 對 LOX 家族基因表達的調控: 研究雌激素對于 LOX 家族基因表達的調控, 證實 LOX 的表達是否受到雌激素的 調控；檢測雌激素處理過的子宮中 LOX家族各成員的表達水平；檢測卵巢切除與雌激素喂食對 LOX 家族成員表達的影響；檢測 LOX 家族基因調控區(qū)有無雌激素受體結合位點。D. 子 宮脫垂疾病干預措施的初步探討：利用遺傳 工程小鼠尋找可能的治療方案，如嘗試使用雌激素提高某種 LOX 家族成員的水平，看能否糾正子宮脫垂癥狀。、、女性更年期誘發(fā)心血管疾病的分子機理1、雌激素、選擇性雌激素受體調控劑對祖細胞分化與平滑肌細胞表型轉化的作用機制A. 比較 收縮表型和合成表型血管平滑肌細胞基因表達的差異，研究雌激素與選擇性雌激素受體調控劑對兩種表型平滑肌細胞增殖和表型轉化作用的分子機制B. 雌激素在促進外周血中祖細胞向血管平滑肌細胞分化中的作用 2、選擇 性雌激素受體 調控劑在血管細胞中的作用與機理的研究A. 選擇 性雌激素受體 調控 劑對巨噬細胞吸收膽固醇的負調控作用: 側重于選擇性雌激素受體調控劑對巨噬細胞清道夫式受體(SR)表達的調控作用與機制的研究。B. 選擇性雌激素受體調控劑對巨噬細胞膽固醇外流分子表達的正向調控作用：研究選擇性雌激素受體調控劑對巨噬細胞膽固醇外流通道分子 ABCA1 表達的影響，探討此一作用的轉錄因子的調控機制。C. 選擇性雌激素受體調控劑對內皮細胞和平滑肌細胞的作用與機制的研究: 確定選擇性雌激素受體調控劑對內皮和平滑肌祖細胞分化、遷移及其他功效的影響，闡明選擇性雌激素受體調控劑對維持血管組成細胞的增殖與凋亡的動態(tài)平衡，保持血管結構的完整性、修復受損血管、防止血管再狹窄以及減緩血管老化等方面的功能。D. 選擇性雌激素受體調控劑對雌激素受體功能的作用：有關選擇性雌激素受體調控劑對雌激素受體異構體表達、同位或異位二聚體的形成、與輔助激活因子或輔助抑制因子結合能力等；選定巨噬細胞、平滑肌細胞與內皮細胞對上述問題展開研究，確定分子水平上選擇性雌激素受體調控劑的作用機理。E. 卵巢衰老過程中雌激素受體異構體、 選擇性雌激素受體調控劑對雌激素受體作用以及與動脈粥樣硬化相關基因變化的研究。、、女性更年期誘發(fā)乳腺癌的分子機理1、卵巢衰老中雌激素調控基因的表達與乳腺癌的發(fā)生以雌激素為中心，利用小鼠和猴子的卵巢衰老研究模型，系統(tǒng)地調查性腺衰老過程中，雌激素合成及其關鍵下游基因 AGR2、LMO4 及 GAB2 的表達模式；分析腫瘤細胞的標志物端粒酶的表達，探討它們與乳腺組織癌變的關系；研究AGR2、LMO4 及 GAB2 等基因在乳腺腫瘤細胞的耐藥性和轉移中的調節(jié)，并利用基因芯片分析這些基因引起的基因表達的變化，較全面地了解雌激素信號的具體調控作用和分子機制，確認治療乳腺癌的基因靶點。A. 研究卵巢衰老過程中芳香化 酶、端粒酶、AGR2、 LMO4 及 GAB2 在乳腺組織中的表達，評價他們的表達與卵巢衰老誘發(fā)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關系。B. 研究 AGR2、LMO4 及 GAB2 在不同階段的乳腺癌 組織樣品中的表達， 評價AGR2、LMO4 及 GAB2 的表達與乳腺癌發(fā)展的關系。C. 體外研究 AGR2、LMO4 及 GAB2 對乳腺腫瘤細胞生物功能的影響: 利用雌激素受體陽性的乳腺癌細胞, 建立讓 AGR2、LMO4 及 GAB2 蛋白高表達, 或者用RNA 干擾技術讓蛋白低表達的細胞株, 在雌激素 處理或不處理的情況下， 觀察細胞增殖、入侵、遷移是否受蛋白表達程度的影響。D、研究 AGR2、LMO4 及 GAB2 對體內乳腺腫瘤形成、生長和擴散的影響: 將建立的分別表達不同水平的 AGR2、LMO4 及 GAB2 蛋白的乳腺癌細胞株, 注射移植到裸鼠體內, 在雌激素處理或不處理的情況下, 觀察腫瘤的生長擴散是否受上述基因的調節(jié)。 E、研究 AGR2、LMO4 及 GAB2 影響雌激素功能的機制: 基于雌激素信號傳導途徑, 研究 AGR2、LMO4 及 GAB2 對受體的表達及目的基因的轉錄兩方面的影響。F. 研究 AGR2、LMO4 及 GAB2 調控相關聯(lián)的基因和信號網(wǎng)絡: 基于這些基因的生物功能，選擇合適的細胞系，用基因芯片檢測它們各自過表達或不表達時引起的基因表達變化，用生物信息學的方法分析這些基因相關聯(lián)的基因或信號網(wǎng)絡。2、乳腺及其上皮干細胞發(fā)育與乳腺癌發(fā)生的相關性A. Wnt 信號通路在乳腺發(fā)育中精確調控的分子機理研究: 多種可以轉導 Wnt 信號的 LEF1/Tcf3 家族的轉錄調控因子在乳腺發(fā)育中的表達及功能界定; ?-catenin依賴和非依賴的 Wnt 信號通路間在乳腺發(fā)育中和乳腺癌 發(fā)生與遷移中相互作用的調查; Wnt 信號通路與普遍存在于上皮 細胞中的增殖抑制機制如 Hippo 信號網(wǎng)絡間的相互調控及其在乳腺癌發(fā)生中的作用。B. 上皮細胞間的粘連以及上皮細胞與胞外基質間的粘連在乳腺上皮干細胞的發(fā)生與自我更新中的作用機理研究: 同時參與 Cadherin 和 Integrin 信號通路轉導的 Ras 超家族 GTPases 如 Rap1/2、Rho 亞家族成員在乳腺上皮干細胞中的功能研究; Cadherin 在乳腺上皮細胞中表達翻譯后的調控機理及其在乳腺癌發(fā)生中的機理研究; Cadherin 和 Integrin 在維持乳腺上皮的特征結構和特征表型遺傳身份的相關性研究。二、預期目標總體目標：本項目針對卵巢衰老研究領域的熱點課題展開基礎研究，將揭示卵巢衰老的發(fā)生機制、由卵巢衰老引起的生殖與相關重大疾病的病理生理改變的分子網(wǎng)絡、信號轉導通路，為推遲生殖衰老、防治相關重大疾病、提高生殖健康與人口 質量、改善中老齡女性的生活質量提供新的理論依據(jù)。本項目將在卵巢衰老研究領域的關鍵科學問題上取得若干突破性的成果，在我國建立較完善的卵巢衰老領域的實驗研究體系和一支高水平、在國際上具有一定影響力的研究團隊。五年預期目標：1、闡明 氧化應 激、端粒、端粒酶、 鈣離子動力學在卵巢衰老及相關疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制。2、以小鼠、猴為模式動物建立卵子老化與卵泡凋亡的蛋白差異表達譜并對其表觀遺傳學變化進行研究，發(fā)現(xiàn)與卵巢衰老相關的蛋白并選擇性地研究某些蛋白功能，揭示卵巢衰老的發(fā)生機制和規(guī)律。系 統(tǒng)地比較卵巢衰老在小鼠、猴子、人類中的異同及相關因素，并尋找人類卵巢早衰的新分子信號通路。通過對延緩小鼠生殖衰老的研究，為延 遲女性絕經(jīng)期到來提供科學依據(jù)。3、闡明卵子 發(fā) 生關鍵基因 PTEN、FOXO3a、FOXO1a 與卵巢早衰的關系，并利用全基因組掃描找到新的卵巢早衰相關基因，揭示卵巢早衰發(fā)病機制。4、闡明 Wnt 信號通路在生殖衰老 進程中對子宮潛在的調節(jié)作用，以及 該信號通路對胎盤發(fā)生發(fā)育的生理病理調節(jié)機制，揭示 Wnt 信號通路與女性妊娠疾病如胎盤功能異常的分子網(wǎng)絡聯(lián)系。5、闡明 LOX 基因家族維持正常子宮功能的分子機理和卵巢衰老過程中雌激素下降對 LOX 家族基因表達的影響。6、闡明卵巢衰老與雌激素下降對心血管疾病的發(fā)生發(fā)展的分子機制，通過選擇性雌激素受體調控劑對巨噬細胞膽固醇的吸收、內吞和外流的影響，闡明其抑制動脈粥樣硬化的機制；進一步地揭示選擇性雌激素受體調控劑對損傷血管修復、防止血管再狹窄與減緩血管老化的積極作用與機制。闡明動物、人類血管平滑肌的鈣動力學與鈣處理蛋白變化與衰老的關聯(lián)性。7、用小鼠及猴子 為研究模式，調查卵巢衰老過程中，雌激素及其下游基因的表達，以端粒酶為標志，明確它們與乳腺組織癌變的關系；并通過對雌激素下游基因功能的研究, 找出調控乳腺腫瘤不同發(fā)展階段的關 鍵調節(jié)基因，從而確立有效的方法和藥物去精確地防治乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。8、闡明 Wnt 信號通路的關 鍵轉導因子 LEF1/Tcf3 家族成員在乳腺發(fā)育及乳腺癌的發(fā)生中對基因組功能的調控；?-catenin 依賴 或非依賴型 Wnt 信號通路間在乳腺上皮細胞分化和乳腺癌細胞遷移中的協(xié)同和拮抗的分子機制；闡明 Wnt 和Hippo 通路間 的相互調控及他們在乳腺上皮細胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)育和癌變中的分子機制；建立 GPCR 在乳腺上皮細胞發(fā)育中的表達圖譜，揭示他們在控制 Cadherin 分子的翻譯后調控的作用。9、培養(yǎng)和 鍛煉一批從事卵巢衰老與相關重大疾病等領域研究的高層次人才。研究成果主要以研究論文和獨立開發(fā)的技術成果(專利)形式公布，五年內爭取在國際專業(yè)學術期刊發(fā)表高水平研究論文 50 篇以上，其中影響因子大于 5 的論文20 篇左右、并申報專利 10 項以上， 培養(yǎng)碩士、博士各 30-40 名，主辦 1 次卵巢衰老與相關重大疾病的國際性學術研討會，獲得國家、省部級科技獎勵數(shù)項。三、研究方案一、學術思路卵巢衰老引起一系列亞健康問題，誘發(fā)女性不孕不育、新生兒遺傳疾病上升、生殖系統(tǒng)疾病、乳腺癌、心血管疾病等，從而嚴重地危害女性特別是中老年女性的身心健康和生活質量。這些問題多發(fā)生在女性絕經(jīng)期前后，同時與體內的關鍵物質如雌激素等緊密相連。本研究學術思路可歸納為： 一、針對卵巢衰老自身發(fā)生的機制進行深入系統(tǒng)的研究；二、對卵巢衰老及雌激素下降導致心血管疾病、生殖系統(tǒng)疾病及乳腺癌的發(fā)生機制進行研究。在研究內容方面，集中于雌激素信號通路、鈣信號通路、Wnt 信號通路、端粒與端粒酶活性、氧化應激等在卵巢衰老和相關疾病發(fā)生中的內在聯(lián)系和作用。在研究對象方面，通過對特有的小鼠、猴子模型和人類標本的共同使用，充分利用實驗材料，更重要的是可以極大限度地降低由于動物材料差異造成的實驗差異性，保證課題的整體性、系統(tǒng)性，提高研究效率。我們這一學術思路及各課題之間的密切關系如以下兩個簡圖所示：圖一、課題之間相互關聯(lián)性 圖二、課題實驗模式二、技術途徑本項目將采取多種生命科學與生物醫(yī)學尖端技術手段，重點圍繞著卵巢衰老與相關重大疾病發(fā)生發(fā)展的機制進行研究。在研究的對象和使用的技術手段上，對各種相關的基因從細胞、組織、 動物整體以及病人組織標本中，擬采用蛋白質組學、 鈣離子熒光成像技術、 電生理學方法、表觀遺傳學方法、染色體免疫共沉淀技 術、細 胞組織化學、免疫學的方法及其基因功能研究方法等，對卵巢衰老及其相關疾病的分子機制進行系統(tǒng)研究，采用生物信息學方法，對小鼠、猴子及人卵巢衰老的機制進行系統(tǒng)比較，建立相應的數(shù)據(jù)庫，尋找并建立致病的分子網(wǎng)絡和網(wǎng)絡模型。功能與結構的研究緊密結合。在找到相互作用新分子和新機制的情況下，充分利用正在建立的基因敲除平臺，分析多種基因在卵巢衰老引起相關疾病中的作用，為研究開發(fā)具有鮮明特點、高效防治藥物提供相關的理論依據(jù)。三、創(chuàng)新點1、選題 方面：開展 對生殖衰老及其相關的不孕不育、生殖系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、乳腺癌等重大疾病 進行系統(tǒng)研究，既是國 際 相關領域的前沿和熱點，也是我國健康事業(yè)的重大社會需求。2、研究模型的 選擇與創(chuàng)建：用猴子為模型進行卵巢衰老、以及卵巢衰老相關疾病進行系統(tǒng)的研究，在國 際上尚無先例。將 嚙齒類動物小鼠和臨床材料進行比較，揭示卵巢衰老及相關疾病發(fā)生的共性和差異性，明顯優(yōu)于用低等生物研究衰老得到的數(shù)據(jù)。另外除了使用現(xiàn)有的衰老動物模型，還在研究中建立新的模型，例如子宮脫垂小鼠模型。這 些模型不僅可以在本研究中使用，而且可以用于篩選針對這些疾病的特效藥物及臨床治療。3、研究內容：各 課題具有多方面的創(chuàng)新，如：A、通 過 抗氧化手段尋找延緩卵巢衰老的新手段；B、系統(tǒng) 研究鈣動力學和鈣處理蛋白在卵巢衰老及相關疾病 發(fā)生中的機制，拓寬鈣生物學在新領域中的應用；C、 絕經(jīng)導致雌激素下降與心血管疾病發(fā)生幾率上升表明雌激素在該系統(tǒng)的重要性，研究選擇性雌激素受體調控劑防治心血管疾病具有普適性；D、卵巢衰老引起乳腺雌激素效應局部增強是導致乳腺癌發(fā)生發(fā)展的主要因素之一，研究其下游關鍵基因在乳腺腫瘤細胞的生長和轉移中的角色，能全面了解雌激素信號的分子調控機制，為治療乳腺癌提供基因靶點；E 、乳腺及其上皮干 細胞發(fā)育與乳腺癌的 發(fā)生相關性研究，將著重揭示兩大重要信號調控網(wǎng)絡 Wnt 通路和細胞粘連分子通路在乳腺干 細胞中的功能，以及他們在乳腺癌發(fā)生與發(fā)展中的作用與調制。四、研究特色：1、卵子 發(fā)生、卵泡發(fā)育與卵巢衰老是一個有機的整體，單方面研究卵子不能完整地揭示卵巢功能，所以我們將卵子與體細胞作為一個整體對象來研究。首次對模式動物、猴及人類卵巢衰老的分子機理 進行系統(tǒng)的比較研究；將由小鼠模型得到的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)結合猴子和人的臨床標本進行對照，找到生殖衰老的共同規(guī)律及人生殖衰老的特點。2、體內和體外、結構和功能的緊密結合，從多個層次和多個角度進行卵巢衰老及相關疾病發(fā)生機制的基礎研究。3、多學科聯(lián)合攻關和多研究手段綜合運用。本項目重點圍繞卵巢衰老與相關疾病發(fā)生的詳細分子機制，各疾病之 間的相互關系以及如何防治等關鍵科學問題，組建來自生殖發(fā)育生物學、 腫瘤生物學、 細胞生物學、生物化學與分子生物學、電生理學等多學科結合和交叉的 優(yōu)秀研究隊伍，綜合運用多種最新的技術手段，從多個角度闡明上述幾個關 鍵的科學問題。所 設 置的課題相互滲透、 緊密聯(lián)系，可相互借鑒與互補，相信會取得 創(chuàng)新性的研究成果。五、可行性分析本項目的總體方案切實可行。首先，本項目提出的主要科學問題和研究目標不僅具有理論和實際依據(jù)，而且都是該領域前沿性和關鍵性的問題。我們在生殖發(fā)育與衰老、心血管疾病、乳腺癌等領域進行了多年的研究，已具有一定的基 礎。研究方案建立在項目組成員大量的相關研究工作基礎上, 設計合理周密。研究課題所用的方法和材料都是本項目各組成員多年所應用, 被證明行之有效的; 而且, 我們的成員積累大量的關鍵研究材料, 如不同種類的卵巢衰老動物模型、轉基因動物、乳腺癌細胞系、裸鼠、RNA 干擾技術及表達 載體等, 可為本研究提供強力的支持，使各項研究得以順利進行。其次，人才隊伍方面，承擔本項目研究工作的中堅力量都是近期從海外留學歸來、成 績卓著的中青年科學家(部分成員曾在國外擁有自己獨立的實驗室、研究經(jīng)費和研究團隊)， 擁有豐富的研究成果，多次在國際著名雜志上發(fā)表論文。 研究課題組成員具有深厚的理論知識與豐富的實踐經(jīng)驗, 熟悉當前的研究現(xiàn)狀及方法手段, 對本課題的研究具有較強的掌控與應變 能力, 能保證課題的順利完成。第三，各承擔單位有良好的研究條件和基礎，具 備了相當規(guī)模并取得了很好的科研成果。擁有完善的各種生物學技術平臺(如小鼠胚胎干細胞基因敲除技術平臺等) ，已建立兩個小鼠衰老模型。此外，我 們與廣西雄森靈 長類動物養(yǎng)殖開發(fā)有限公司簽訂合同，可保障 實驗用猴供應。六、課題設置課題一：卵巢衰老的分子機理研究目標 揭示卵子生長過程染色體之間粘連的變化；闡明卵子衰老發(fā)生的時期與發(fā)生的原因；探索延緩卵巢衰老與延長生育年齡新途徑；揭示卵泡衰老中鈣動力學與鈣處理蛋白的作用及機制；培養(yǎng) 11-15 名博士。發(fā)表 SCI 期刊論文 18 篇左右，其中影響因子大于 5 的 8 篇以上。研究內容1. 卵子與卵泡衰老的分子信號通路：不同年齡層次原始卵泡、腔前卵泡相關分子（如 Wnt、PTEN、PI3K、GDF9 等）的變化, 卵子及顆粒細胞衰老相關分子變化；卵泡凋亡在卵巢衰老中的分子機制。2. 端粒和端粒酶在卵子與顆粒細胞衰老中的重要作用：衰老過程中端粒長度、端粒酶活性的變化；不同年齡層次卵子和顆粒細胞中的端粒功能和端粒酶活性。 3. 抗氧化劑對延緩卵泡凋亡、延長生殖年齡作用與機理：通過添加抗氧化劑等手段，考察雌鼠受孕年齡是否延長以相關機理，提出延緩卵巢衰老新理論。4. 卵子與顆 粒細胞衰老過程中鈣動力學與鈣處理蛋白的變化：通過比較體外衰老過程中鈣動力學和鈣處理蛋白的變化，建立卵子與顆粒細胞衰老的細胞模型。研究鈣處理蛋白及鈣動力學在卵子及顆粒細胞的凋亡過程的功能與機理。承擔單位：南開大學課題負責人：唐向東學術骨干：劉林、吳際經(jīng)費比例：35%課題二：卵巢衰老誘發(fā)女性生殖系統(tǒng)疾病的分子機理研究目標1．詳細 地闡明卵子 發(fā)生關鍵基因 PTEN、FOXO3a、FOXO1a 與卵巢早衰的關系，通過全基因組掃描手段找出新的卵巢早衰相關基因，進一步地揭示卵巢早衰發(fā)病機制。2．通過對 Wnt 信號通路在生殖衰老 進程中對子宮潛在的調節(jié)作用的研究，揭示該信號通路對胎盤發(fā)生發(fā)育的生理病理調節(jié)機制，女性妊娠疾病如胎盤功能異常的分子網(wǎng)絡聯(lián)系。3．通過對 LOX 基因家族成員在子宮脫垂等方面功能的研究，揭示 LOX 基因家族在維持正常子宮功能的分子機理以及卵巢衰老過程中雌激素下降對 LOX 家族基因表達的影響。4．培養(yǎng) 8-10 名博士。 發(fā)表 SCI 期刊論文 13 篇左右，影響因子>5 的 6 篇以上。研究內容利用基因芯片對 POF 患者及正常對照人群進行全基因組掃描，以期發(fā)現(xiàn)新 POF的相關基因，并找到卵巢早衰與卵子發(fā)生關鍵基因 PTEN、FOXO3a、FOXO1a的關系。初步闡明 Wnt 信號通路在生殖衰老 進程中 對子宮潛在的調節(jié)作用，以及該信號通路對胎盤發(fā)生發(fā)育的生理病理調節(jié)機制，同時揭示 Wnt 信號通路與女性妊娠疾病如胎盤功能異常等生殖疾病的內在聯(lián)系。尋找 LOX 基因家族維持正常子宮功能的分子機理，以期發(fā)現(xiàn)生殖衰老引起女性子宮疾病(子宮脫垂)的發(fā)病機理，以及女性激素與 LOX 家族基因表達和子宮脫垂的關系，為治防這類疾病提供依據(jù)。通過這幾方面的工作，闡明卵巢衰老誘發(fā)的女性生殖系統(tǒng)疾病的機制，為保障人類的生殖健康提供理論支持。承擔單位：山東大學課題負責人：高建剛學術骨干：王海濱、陳子江經(jīng)費比例：25%課題三、女性更年期誘發(fā)心血管疾病的分子機理研究目標1．通過選擇 性雌激素受體調控劑對巨噬細胞膽固醇的吸收、內吞和外流的影響，闡明其抑制動脈粥樣硬化的機制。2. 揭示 選擇性雌激素受體調控劑對損傷血管修復、防止血管再狹窄與減緩血管老化的積極作用與機制。3. 卵巢衰老 過程對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展相關基因的影響，揭示二者的關聯(lián)性；4. 闡明動物、人類血管平滑肌的鈣動力學與鈣處理蛋白變化與衰老的關聯(lián)性。5. 培養(yǎng) 6-8 名博士，發(fā)表 SCI 期刊論文 10 篇，其中影響因子大于 5 的 4 篇以上。研究內容1. 利用巨噬 細胞株進行體外實驗， 測試選擇性雌激素受體調控劑對巨噬細胞膽固醇內吞與外流的作用。其作用機制將從選擇性雌激素受體調控劑對這些相關分子表達的轉錄因子，如 PPAR?，LXR???、RXR?的功效、構象變化(如磷酸化)等方面展開研究，并進一步地對這些分子的啟動因子作分析測試、找出與雌激素受體的相互作用。一些關鍵實驗將用原代細胞如從小鼠腹水中分離的巨噬細胞和采用人血中單核細胞自然分化而成的巨噬細胞加以驗證。2. 利用大鼠原代內皮 細胞和平滑肌細胞或采用從臍帶中分離的細胞，構筑二者共生環(huán)境，測試選擇性雌激素受體調控劑對二者的增殖、凋亡、遷移的作用與相關機制。通過體內實驗測試選擇性雌激素受體調控劑對內皮祖細胞和平滑肌祖細胞生成的影響，通過體外實驗測試選擇性雌激素受體調控劑對這些祖細胞分化與功能的影響。3. 利用不同 動物模型研究雌激素、選擇性雌激素受體調控劑對平滑肌細胞轉型、雌激素受體結構與功能等方面的作用，揭示卵巢衰老過程中血管細胞的表觀遺傳學。結合在在動脈粥樣硬化模型鼠(高膽固醇/脂肪食物喂養(yǎng)的低密度脂蛋白受體或前脂蛋白 E 缺陷鼠)中的功能，為新的藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。承擔單位：南開大學課題負責人：韓際宏學術骨干：張琚經(jīng)費比例：23%課題四、女性更年期誘發(fā)乳腺癌的分子機理研究目標1． 確立卵巢衰老過程中乳腺組織內雌激素下游基因與端粒酶對乳腺組織癌變的作用與機理。2．通過對 雌激素下游基因功能的研究, 找出調控乳腺腫瘤不同發(fā)展階段的關鍵調節(jié)基因，從而為確立有效防治乳腺癌發(fā)生與發(fā)展藥物和手段提供精確的理論基礎。3．闡明 Wnt 信號通路的關 鍵轉導因子 LEF1/Tcf3 家族成員在乳腺發(fā)育及乳腺癌的發(fā)生中對基因組功能的調控；揭示?-catenin 依賴 或非依賴型 Wnt 信號通路間在乳腺上皮細胞分化和乳腺癌細胞遷移中的協(xié)同和拮抗的分子機制。4．闡明 Wnt 和 Hippo 通路間的相互調控及他們在乳腺上皮細胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)育和癌變中的分子機制；建立 GPCR 在乳腺上皮細胞發(fā)育中的表達 圖譜。5. 培養(yǎng) 5-7 名博士。發(fā)表 SCI 期刊論文 9 篇左右，影響因子>5 的 4 篇左右。研究內容以不同年齡小鼠和猴子為模型模擬性腺衰老，研究芳香化酶、端粒酶、AGR2、LMO4 及 GAB2 在乳腺組織中蛋白表達，評價他們的表達與性腺衰老誘發(fā)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關系；并以體外培養(yǎng)的多種乳腺癌細胞系為基礎，結合實驗動物模型，研究 AGR2、LMO4 及 GAB2 等幾個關鍵的雌激素下游基因在乳腺腫瘤細胞的耐藥性和轉移中扮演的角色，較全面地了解雌激素信號的具體調控作用和分子機制，提供治療乳腺癌的基因靶點。癌癥的發(fā)生在某種程度上是器官發(fā)育遺傳控制異常的一種表現(xiàn)，是相關細胞失去維持穩(wěn)定生理功能或者不能實現(xiàn)正常衰老和凋亡的結果。多種在乳腺癌中表達異常的信號網(wǎng)絡包括 Wnt 通路和細胞粘連分子通路 對于乳腺上皮細胞的正常發(fā)育增殖，分化與衰老中也有至關重要的功能。以了解乳腺上皮細胞在胚胎及女性青春期的發(fā)育、成熟、分化和凋亡的基礎生物學問題為切入點，必將大大地加深乳腺穩(wěn)態(tài)發(fā)育及癌變的分子機制的了解，從而為診斷、預防和治療乳腺癌提供前瞻性的方案。承擔單位：廈門大學課題負責人：呂忠顯學術骨干：陶慶華經(jīng)費比例：17%四、年度計劃年度研究內容 預期目標第一年1. 研究不同年齡層次原始卵泡、腔前卵泡相關分子、卵子及顆粒細胞衰老相關分子變化；研究卵泡凋亡在卵巢衰老中的分子機制。2. 利用卵巢切除模擬的生殖衰老模型和雌激素受體(ER?)和孕激素受體(PR)敲除小鼠模型，探討 Wnt 信號通路在生殖衰老 進程中對子宮潛在的調節(jié)作用。3. 以 500 名卵巢早衰患者 為研究對象，采用 Affymetrix SNP6 完成 雜交試驗。3. 對 LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3 和LOXL4 在哺乳動物個體出生、成熟及衰老過程中，特別在妊娠各個階段的子宮中的表達進行分析。4. 利用巨噬 細胞株進行體外實驗， 測試選擇性雌激素受體調控劑對巨噬細胞膽固醇內吞與外流的作用。5. 研究卵巢衰老過程中芳香化酶、端粒 酶及雌激素主要靶基因、Wnt 信號通路基因等在乳腺組織中的表達特征。1. 揭示卵子與卵泡衰老的分子信號通路。2. 闡 明 Wnt 信號通路在生殖衰老進程中對子宮潛在的調節(jié)作用，以及該信號通路對胎盤發(fā)生發(fā)育的生理病理調節(jié)機制。3. 找出卵巢早衰的新基因。揭示 LOX 基因表達與卵巢發(fā)育之間的關聯(lián)性。4. 闡明雌激素受體調控劑抑制動脈粥樣硬化的作用。5. 初步揭示部分基因對乳腺正常或癌細胞上的生物功能(如增殖)的調 控。6. 完成 SCI 論文 5-8 篇。第二年1. 研究在衰老過程中端粒長度、端粒 酶活性的變化；分析不同年齡層次卵子和顆粒細胞中的端粒功能和端粒酶活性，揭示其在抗衰老中的重要作用。2. 利用 Genotyping Console2.1 軟件分析數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有意義的卵巢早衰 SNP 位點，并借助 Real- time PCR 等驗證。3. 以正常妊娠小鼠為動物模型，探討 Wnt信號通路的相關分子在不同妊娠階段胎盤中的表達模式。4. 研究選擇性雌激素受體調控劑對動脈粥樣硬化發(fā)生過程中關鍵轉錄因子如PPAR?，LXR???、RXR?的功效、構象變化(如磷酸化) 等方面的作用；測試卵巢衰老過程中動脈粥樣硬化發(fā)生基因的變化。5. 研究雌激素主要靶基因、Wnt 信號通路基因等在乳腺癌組織中的表達模式，在乳腺乳腺組織中的表達特征。1. 揭示端粒和端粒酶在卵子與顆粒細胞衰老中的重要作用。2. 闡明部分基因突變對卵巢早衰的作用與機理。3. 揭示 Wnt 通路在胎盤發(fā)生中的功能。4. 闡明雌激素受體調控劑抑制動脈粥樣硬化的機理，揭示卵巢衰老與冠心病的部分關聯(lián)性。5. 明確雌激素主要靶基因、Wnt 信號通路基因對乳腺正常或癌細胞上的生物功能的調控及其分子機制。6. 完成 SCI 論文 8-10 篇。申報專利 2-3 項。第三年1. 通過對雌鼠食物中添加抗氧化劑等手段，考察雌鼠受孕年齡是否延長以及相關機理。2. 利用 β-catanin-TCF/LEFLacZ 轉基因報告小鼠來檢測妊娠不同妊娠階段胎盤中1. 提出延緩 卵巢衰老新理論。2. 揭示 Wnt 信號對妊娠發(fā)生的作用與機理。3. 揭示 LOX2、3 在子宮中的功能及與子宮脫垂的關系。經(jīng)典 Wnt 信號通路活性。3. 創(chuàng)建 LOX2、3 基因敲除小鼠。4. 利用大鼠原代內皮細胞和平滑肌細胞或采用從臍帶中分離的細胞，構筑二者共生環(huán)境，測試選擇性雌激素受體調控劑對二者的增殖、凋亡、遷移的作用與相關機制。5. 深入研究雌激素主要靶基因AGR2、Shp2、AGR2、LMO4 等對基礎或雌激素誘導的體內或體外乳腺癌細胞生物功能的調控；研究 Cadherin 和 Integrin 信號通路轉導的 Ras 超家族 GTPases 成員在乳腺上皮干細胞中的功能研究。4. 闡明選擇性雌激素受體調控劑對內皮祖細胞和平滑肌祖細胞生成、分化與功能的影響。5. 明確雌激素主要靶基因AGR2、Shp2、AGR2、LMO4等對基礎或雌激素誘導的體內或體外乳腺癌細胞生物功能的調控；明確 Cadherin 和Integrin 信號通路轉導的 Ras超家族 GTPases 成員在乳腺上皮干細胞中的功能。6. 完成 SCI 論文 10-12 篇。申報專利 2-3 項。第四年1. 通過比較體外衰老過程中鈣動力學和鈣處理蛋白的變化，建立卵子與顆粒細胞衰老的細胞模型。研究鈣處理蛋白及鈣動力學在卵子及顆粒細胞的凋亡過程的功能與機理。2. 利用胎盤特異性 Tpbp-Cre 和 Cyp19-Cre 小鼠和 Wnt9a-loxp、Fzd5-loxp 小鼠制作組織選擇性基因敲除小鼠模型，研究Wnt 信號對小鼠胎盤發(fā)生及滋養(yǎng)層細胞增殖分化等的影響。3. 研究雌激素對 LOX 家族成員表達的調1. 明確卵子與顆粒細胞衰老過程中鈣動力學與鈣處理蛋白的變化。2. 確定 Wnt 信號對胎盤發(fā)生及滋養(yǎng)層細胞增殖分化作用的相關通路。3. 揭示卵巢衰老及雌激素下降對 LOX 分子在子宮脫垂發(fā)生中的作用與機理。4. 揭示卵巢衰老過程中血管細胞的表觀遺傳學。5. 揭示雌激素主要靶基因控及與子宮脫垂的關聯(lián)。4. 利用不同動物模型研究雌激素、選擇性雌激素受體調控劑對平滑肌細胞轉型、雌激素受體結構與功能等方面的作用。5. 研究雌激素主要靶基因AGR2、Shp2、AGR2、LMO4 等在乳腺癌細胞中表達與生物功能的調控，Cadherin在乳腺上皮細胞中表達翻譯后的調控及其在乳腺癌發(fā)生中的作用。AGR2、Shp2、AGR2、LMO4等乳腺癌細胞生物功能的調控機制及相關的基因和信號的網(wǎng)絡；明確 Cadherin 在乳腺上皮細胞中表達翻譯后的調控及其對乳腺癌發(fā)生的影響。6. 完成 SCI 論文 10-12 篇。申報專利 2-3 項。第五年1. 研究卵巢衰老過程中相關的粘連蛋白、新穎粘附分子 STPB-C、新 轉運蛋白Oocyte-G1 等的 變化。2. 通過體外功能實驗確定PTEN、FOXO3A、FOXO1A 等基因的突變。3. 以滋養(yǎng)層干細胞為體外模型，鑒定 Wnt信號通路不同成員在滋養(yǎng)層干細胞不同的增殖或分化階段的表達水平和變化。4. 體內外實驗研究選擇性雌激素受體調控劑等對 LOX 成員表達的調控， 尋找可能的子宮脫垂疾病干預措施。5. 比較不同年 齡小鼠、猴以及人類標本的血管內皮細胞及血管平滑肌鈣動力學及鈣處理蛋白變化情況及對雌激素與選擇性雌激素受體調控劑的反應性。比較不同年齡小鼠心臟巨噬細胞及心肌成纖維細胞在纖1. 揭示粘連分子與卵巢衰老的分子關聯(lián)性。2. 進一步闡明卵巢早衰的分子機制。3. 探 討 Wnt 通路相關成員對滋養(yǎng)層細胞增殖分化的功能與機理。4. 為防治子宮脫垂提供理論依據(jù)。5. 確定鈣動 力學和鈣處理蛋白在衰老過程中對心血管疾病的作用與機理。6. 完整揭示雌激素主要靶基因 AGR2、 Shp2、 AGR2、LMO4 等調控乳腺癌細胞生物功能的基因和信號網(wǎng)絡； 揭示 Cadherin 和 Integrin 在維持乳腺上皮的特征結構和特征表型遺傳身份的相關性, 為預防和治療生殖衰老過程中的乳腺癌提供依據(jù)和方法。維化重構中的作用。6. 分析和驗證雌激素主要靶基因AGR2、Shp2、AGR2、LMO4 等調控乳腺癌細胞生物功能的基因和信號；研究Cadherin 和 Integrin 在維持乳腺上皮的特征結構和特征表型遺傳身份的相關性研究；總結和概括這些基因或信號在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的功能和調控機制7. 完成 SCI 論文 8-10 篇。申報專利 1-2 項。