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專(zhuān)題1 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用 課題1 果酒和果醋的制作 實(shí)驗(yàn)案例 制作葡萄酒和葡萄醋 建議將實(shí)驗(yàn)安排在秋季的9月或10月進(jìn)行。在這段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）正值收獲季節(jié)，葡萄的價(jià)格便宜，品種多樣；（2）此時(shí)葡萄上的酵母菌數(shù)量多且生活力強(qiáng)，發(fā)酵釀酒的效果好；（3）溫度適宜，發(fā)酵現(xiàn)象非常明顯。實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下。 1.對(duì)發(fā)酵瓶、紗布、榨汁機(jī)、盛葡萄汁的器皿等實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行清洗并消毒。先用溫水反復(fù)沖洗幾次,再用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。 2. 取葡萄500 g，去除枝梗和腐爛的子粒。 3. 用清水沖洗葡萄1～2遍除去污物，注意不要反復(fù)多次沖洗。 4. 用榨汁機(jī)榨取葡萄汁后，將其裝入發(fā)酵瓶中（裝置參見(jiàn)教材圖1-4b），或?qū)⑵咸汛虺蓾{后，用潔凈的紗布過(guò)濾至發(fā)酵瓶中，蓋好瓶蓋。如果沒(méi)有合適的發(fā)酵裝置，可以用500 mL的塑料瓶替代，但注入的果汁量不要超過(guò)塑料瓶總體積的2/3。 5. 將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度下發(fā)酵。 6. 由于發(fā)酵旺盛期CO2的產(chǎn)量非常大，因此需要及時(shí)排氣，防止發(fā)酵瓶爆裂。如果使用簡(jiǎn)易的發(fā)酵裝置，如瓶子（最好選用塑料瓶），每天要擰松瓶蓋2～4次，進(jìn)行排氣。 7. 10 d以后，可以開(kāi)始進(jìn)行取樣檢驗(yàn)工作。例如，可以檢驗(yàn)酒味、酒精的含量、進(jìn)行酵母菌的鏡檢等工作。 8. 當(dāng)果酒制成以后，可以在發(fā)酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后將裝置轉(zhuǎn)移至30～35 ℃的條件下發(fā)酵，適時(shí)向發(fā)酵液中充氣。如果找不到醋酸菌菌種或醋曲，可嘗試自然接種，但效果不是很好。如果沒(méi)有充氣裝置，可以將瓶蓋打開(kāi)，在瓶口蓋上紗布，以減少空氣中塵土等的污染。 課題成果評(píng)價(jià) （一）果酒的制作是否成功 發(fā)酵后取樣，通過(guò)嗅味和品嘗進(jìn)行初步鑒定。此外，還可用顯微鏡觀察酵母菌，并用重鉻酸鉀檢驗(yàn)酒精的存在。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，請(qǐng)學(xué)生分析失敗原因，然后重新制作。 （二）果醋的制作是否成功 首先通過(guò)觀察菌膜的形成、嗅味和品嘗進(jìn)行初步鑒定，再通過(guò)檢測(cè)和比較醋酸發(fā)酵前后的pH作進(jìn)一步的鑒定。此外，還可以通過(guò)在顯微鏡下觀察發(fā)酵液中是否有醋酸菌，并統(tǒng)計(jì)其數(shù)量作進(jìn)一步鑒定。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.你認(rèn)為應(yīng)該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？為什么？ 答：應(yīng)該先沖洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗時(shí)引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機(jī)會(huì)。 2.你認(rèn)為應(yīng)該從哪些方面防止發(fā)酵液被污染？ 提示：需要從發(fā)酵制作的過(guò)程進(jìn)行全面的考慮。例如，榨汁機(jī)、發(fā)酵裝置要清洗干凈；每次排氣時(shí)只需擰松瓶蓋、不要完全揭開(kāi)瓶蓋等。 3.制葡萄酒時(shí)，為什么要將溫度控制在18～25 ℃？制葡萄醋時(shí)，為什么要將溫度控制在30～35 ℃？ 答：溫度是酵母菌生長(zhǎng)和發(fā)酵的重要條件。20 ℃左右最適合酵母菌繁殖。因此需要將溫度控制在其最適溫度范圍內(nèi)。而醋酸菌是嗜溫菌，最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃，因此要將溫度控制在30～35 ℃。 4.制葡萄醋時(shí)，為什么要適時(shí)通過(guò)充氣口充氣？ 答：醋酸菌是好氧菌，在將酒精變?yōu)榇姿釙r(shí)需要氧的參與，因此要適時(shí)向發(fā)酵液中充氣。 （二）［資料］發(fā)酵裝置的設(shè)計(jì)討論題 請(qǐng)分析此裝置中的充氣口、排氣口和出料口分別有哪些作用。為什么排氣口要通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身連接？結(jié)合果酒、果醋的制作原理，你認(rèn)為應(yīng)該如何使用這個(gè)發(fā)酵裝置？ 答：充氣口是在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵進(jìn)行充氣用的；排氣口是在酒精發(fā)酵時(shí)用來(lái)排出CO2的；出料口是用來(lái)取樣的。排氣口要通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身連接，其目的是防止空氣中微生物的污染，其作用類(lèi)似巴斯德的鵝頸瓶。使用該裝置制酒時(shí)，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制醋時(shí)，應(yīng)將充氣口連接氣泵，輸入氧氣。 （三）練習(xí) 2.提示：大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)需要進(jìn)行更為全面周詳?shù)目紤]，如原料的來(lái)源與選擇、菌種的培育與選擇、發(fā)酵的設(shè)備、發(fā)酵條件的自動(dòng)化控制，以及如何嚴(yán)格控制雜菌污染；等等。此外，無(wú)論是葡萄酒或葡萄醋，實(shí)驗(yàn)時(shí)所檢測(cè)的發(fā)酵液，并非商品意義上的產(chǎn)品。在實(shí)際生產(chǎn)中還需沉淀過(guò)濾、滅菌裝瓶等獲得成品酒或醋。葡萄酒還需在一定設(shè)施和條件下（如橡木桶和地窖）進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵，以獲得特定的風(fēng)味和色澤。 3.提示：需考慮廠房、設(shè)備投資、原材料采購(gòu)、工人人數(shù)及工資、產(chǎn)品種類(lèi)、生產(chǎn)周期、銷(xiāo)售渠道、利潤(rùn)等問(wèn)題。 課題2 腐乳的制作 實(shí)驗(yàn)案例 制作腐乳 實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下。 1.將豆腐切成3cm3cm1cm的若干塊。所用豆腐的含水量為70％左右，水分過(guò)多則腐乳不易成形。水分測(cè)定方法如下。 精確稱(chēng)取經(jīng)研缽研磨成糊狀的樣品5～10 g (精確到0.02mg )，置于已知重量的蒸發(fā)皿中，均勻攤平后，在100～105 ℃電熱干燥箱內(nèi)干燥4 h，取出后置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫后稱(chēng)重，然后再烘30 min，直至所稱(chēng)重量不變?yōu)橹埂? 樣品水分含量（%）計(jì)算公式如下。 (烘干前容器和樣品質(zhì)量-烘干后容器和樣品質(zhì)量)/烘干前樣品質(zhì)量 2.將豆腐塊平放在鋪有干粽葉的盤(pán)內(nèi)，粽葉可以提供菌種，并能起到保溫的作用。每塊豆腐等距離排放，周?chē)粲幸欢ǖ目障?。豆腐上面再鋪上干凈的粽葉。氣候干燥時(shí)，將平盤(pán)用保鮮膜包裹，但不要封嚴(yán)，以免濕度太高，不利于毛霉的生長(zhǎng)。 3.將平盤(pán)放入溫度保持在15～18 ℃的地方。毛霉逐漸生長(zhǎng)，大約5 d后豆腐表面叢生著直立菌絲。 4.當(dāng)毛霉生長(zhǎng)旺盛，并呈淡黃色時(shí)，去除包裹平盤(pán)的保鮮膜以及鋪在上面的粽葉，使豆腐塊的熱量和水分能夠迅速散失，同時(shí)散去霉味。這一過(guò)程一般持續(xù)36 h以上。 5.當(dāng)豆腐涼透后，將豆腐間連接在一起的菌絲拉斷，并整齊排列在容器內(nèi)，準(zhǔn)備腌制。 6.長(zhǎng)滿毛霉的豆腐塊（以下稱(chēng)毛坯）與鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為5∶1。將培養(yǎng)毛坯時(shí)靠近平盤(pán)沒(méi)長(zhǎng)直立菌絲的一面統(tǒng)一朝向玻璃瓶邊，將毛坯分層盤(pán)立擺放在容器中。分層加鹽，并隨層加高而增加鹽量，在瓶口表面鋪鹽厚些，以防止雜菌從瓶口進(jìn)入。約腌制8 d。 7.將黃酒、米酒和糖，按口味不同而配以各種香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成鹵湯。鹵湯酒精含量控制在12％左右為宜［注］。 ［注］酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短有很大關(guān)系。酒精含量越高，對(duì)蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長(zhǎng)；酒精含量過(guò)低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。 8.將廣口玻璃瓶刷干凈后，用高壓鍋在100 ℃蒸汽滅菌30 min。將腐乳咸坯擺入瓶中，加入鹵湯和輔料后，將瓶口用酒精燈加熱滅菌，用膠條密封。在常溫情況下，一般六個(gè)月可以成熟。 課題成果評(píng)價(jià) （一）是否完成腐乳的制作 學(xué)生是否完成腐乳的制作依據(jù)是：能夠合理地選擇實(shí)驗(yàn)材料與用具；前期發(fā)酵后豆腐的表面長(zhǎng)有菌絲，后期發(fā)酵制作基本沒(méi)有雜菌的污染。 （二）腐乳質(zhì)量的評(píng)價(jià) 制作成功的腐乳應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：色澤基本一致、味道鮮美、咸淡適口、無(wú)異味、塊形整齊、厚薄均勻、質(zhì)地細(xì)膩、無(wú)雜質(zhì)。 （三） 能否總結(jié)不同條件對(duì)腐乳風(fēng)味和質(zhì)量的影響。 學(xué)生能從鹽、酒的用量、發(fā)酵的溫度、發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短，以及香辛料等因素中的某一因素來(lái)說(shuō)明其對(duì)腐乳風(fēng)味或質(zhì)量的影響。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.你能利用所學(xué)的生物學(xué)知識(shí)，解釋豆腐長(zhǎng)白毛是怎么一回事？ 答：豆腐上生長(zhǎng)的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴(yán)格地說(shuō)是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。 2.王致和為什么要撒許多鹽，將長(zhǎng)毛的豆腐腌起來(lái)？ 答：鹽能防止雜菌污染，避免豆腐腐敗。 3.我們平常吃的豆腐，哪種適合用來(lái)做腐乳？ 答：含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量過(guò)高的豆腐制腐乳，不易成形。 4.吃腐乳時(shí)，你會(huì)發(fā)現(xiàn)腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢？它對(duì)人體有害嗎？它的作用是什么？ 答：“皮”是前期發(fā)酵時(shí)在豆腐表面上生長(zhǎng)的菌絲（匍匐菌絲），它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形。“皮”對(duì)人體無(wú)害。 （二）練習(xí) 1.答：越接近瓶口，雜菌污染的可能性越大，因此要隨著豆腐層的加高增加鹽的用量，在接近瓶口的表面，鹽要鋪厚一些，以有效防止雜菌污染。 課題3 制作泡菜并檢測(cè)亞硝酸鹽含量 課題成果評(píng)價(jià) （一）泡菜腌制的質(zhì)量如何 可以根據(jù)泡菜的色澤和風(fēng)味進(jìn)行初步的評(píng)定，還可以在顯微鏡下觀察乳酸菌形態(tài)，比較不同時(shí)期泡菜壇中乳酸菌的含量。 （二）亞硝酸鹽含量的測(cè)定 配制的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣品液顯色后，目測(cè)比色效果如何，是否與標(biāo)準(zhǔn)液的濃度相吻合。如果不吻合，還應(yīng)在已知濃度范圍內(nèi)，改變濃度梯度，進(jìn)一步配制標(biāo)準(zhǔn)使用液。 （三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，應(yīng)及時(shí)對(duì)泡菜中亞硝酸鹽含量進(jìn)行鑒定，比較不同時(shí)期亞硝酸鹽含量的變化及其對(duì)泡菜質(zhì)量的影響。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.為什么含有抗生素的牛奶不能發(fā)酵成酸奶？ 答：酸奶的制作依靠的是乳酸菌的發(fā)酵作用?？股啬軌驓⑺阑蛞种迫樗峋纳L(zhǎng)，因此含有抗生素的牛奶不能發(fā)酵成酸奶。 2.為什么日常生活中要多吃新鮮蔬菜，不吃存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、變質(zhì)的蔬菜？ 答：有些蔬菜，如小白菜和蘿卜等，含有豐富的硝酸鹽。當(dāng)這些蔬菜放置過(guò)久發(fā)生變質(zhì)（發(fā)黃、腐爛）或者煮熟后存放太久時(shí)，蔬菜中的硝酸鹽會(huì)被微生物還原成亞硝酸鹽，危害人體健康。 3.為什么泡菜壇內(nèi)有時(shí)會(huì)長(zhǎng)一層白膜？你認(rèn)為這層白膜是怎么形成的？ 答：形成白膜是由于產(chǎn)膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厭氧微生物，泡菜發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)豐富，其表面氧氣含量也很豐富，適合酵母菌繁殖。 （二）練習(xí) 2.答：果酒的制作主要利用的是酵母菌的酒精發(fā)酵，果醋的制作利用的是醋酸菌將酒精轉(zhuǎn)變?yōu)榇姿岬拇x，腐乳的制作利用的主要是毛霉分泌的蛋白酶等酶類(lèi)，泡菜的制作利用的是乳酸菌的乳酸發(fā)酵。 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)都巧妙地利用了天然菌種，都為特定的菌種提供了良好的生存條件，最終的發(fā)酵產(chǎn)物不是單一的組分，而是成分復(fù)雜的混合物。 專(zhuān)題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用 課題1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 課題成果評(píng)價(jià) （一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2 d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無(wú)菌要求 如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說(shuō)明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說(shuō)明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。 （三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？ 答：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。 2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手 答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。 （二）倒平板操作的討論 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？ 提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。 2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？ 答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。 3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。 （三）平板劃線操作的討論 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ 答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。 2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？ 答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？ 答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。 （四）涂布平板操作的討論 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作？ 提示：應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周?chē)?；等等? （五）練習(xí) 1.提示：可以從微生物生長(zhǎng)需要哪些條件的角度來(lái)思考。例如，微生物的生長(zhǎng)需要水、空氣、適宜的溫度，食品保存可以通過(guò)保持干燥、真空的條件，以及冷藏等方法來(lái)阻止微生物的生長(zhǎng)。 2.提示：可以從這三種培養(yǎng)技術(shù)的原理、操作步驟等方面分別進(jìn)行總結(jié)歸納。例如，這三種培養(yǎng)技術(shù)都需要為培養(yǎng)物提供充足的營(yíng)養(yǎng)，但無(wú)土栽培技術(shù)的操作并不需要保證無(wú)菌的條件，而其他兩種技術(shù)都要求嚴(yán)格的無(wú)菌條件。 3.提示：這是一道開(kāi)放性的問(wèn)題，答案并不惟一，重點(diǎn)在于鼓勵(lì)學(xué)生積極參與，從不同的角度思考問(wèn)題。例如，正是由于證明了微生物不是自發(fā)產(chǎn)生的，微生物學(xué)才可能發(fā)展成為一門(mén)獨(dú)立的學(xué)科；巴斯德實(shí)驗(yàn)中用到的加熱滅菌的方法導(dǎo)致了有效的滅菌方法的出現(xiàn)，而這一滅菌原理也適用于食品的保存等。 課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)案例 土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下。 1.土壤取樣 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 2.制備培養(yǎng)基 準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒(méi)有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基，5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8個(gè)滅菌的試管和1個(gè)滅菌的移液管。 3.微生物的培養(yǎng)與觀察 參考課本中圖2-7的實(shí)驗(yàn)流程示意圖，將10 g土樣加入盛有90 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250 mL），充分搖勻，吸取上清液1 mL，轉(zhuǎn)移至盛有9 mL的生理鹽水的無(wú)菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1 mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。 將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 ℃溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。 挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中圖2-10的顏色反應(yīng)。 4.細(xì)菌的計(jì)數(shù) 當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。 課題成果評(píng)價(jià) （一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。 （二）樣品的稀釋操作是否成功 如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。 （三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致 如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，教師需要引導(dǎo)學(xué)生一起分析產(chǎn)生差異的原因。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？ 答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。 2.為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝?lèi)微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。因此，為獲得不同類(lèi)型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。 （二）練習(xí) 2.提示：反芻動(dòng)物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會(huì)死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準(zhǔn)備選擇培養(yǎng)基外，還應(yīng)參照厭氧菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。 課題3 分解纖維素的微生物的分離 實(shí)驗(yàn)案例 土壤中纖維素分解菌的分離 實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下。 1.土樣采集 土樣采集的方法與本專(zhuān)題課題2類(lèi)似。土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因?yàn)樵诶w維素含量豐富的環(huán)境，通常會(huì)聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過(guò)一個(gè)月左右也會(huì)有能分解纖維素的微生物生長(zhǎng)。 2.選擇培養(yǎng) 選擇培養(yǎng)需要的儀器有：250 mL錐形瓶、無(wú)菌稱(chēng)量瓶、藥匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、搖床、溫度計(jì)等。 培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在250 mL錐形瓶中裝入30 mL培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙（或報(bào)紙），用線繩扎緊，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。 選擇培養(yǎng)的操作：稱(chēng)取土樣20 g，在無(wú)菌條件下加入裝有30 mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30 ℃下振蕩培養(yǎng)1～2 d，至培養(yǎng)基變混濁。此時(shí)可以吸取0.1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板，也可以按課本中所述，重復(fù)選擇培養(yǎng)的步驟一次，然后再進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。 3.剛果紅染色法分離 纖維素分解菌這一步所需要的儀器有：無(wú)菌培養(yǎng)皿、涂布器、1 mL移液管，裝有9mL無(wú)菌水的20 mL大試管，溫箱等。 培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)基，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。 倒平板操作：將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無(wú)菌操作的要求，在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中倒入15～20 mL培養(yǎng)基，凝固后待用。 制備菌懸液：按照本專(zhuān)題課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋?zhuān)♂屪畲蟊稊?shù)至106。 涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1 mL，滴加在平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30 ℃倒置培養(yǎng)，至菌落長(zhǎng)出。每個(gè)稀釋度下需涂布3個(gè)平板，并注意設(shè)置對(duì)照。剛果紅染色的具體操作步驟參照課本［資料三］。 課題成果評(píng)價(jià) （一）培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)則說(shuō)明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說(shuō)明可能獲得了分解纖維素的微生物。 （二）分離的結(jié)果是否一致：由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學(xué)生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？ 答：本實(shí)驗(yàn)流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為惟一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過(guò)選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。 2.為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？ 答：由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對(duì)提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。 3.將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？ 答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對(duì)聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10 cm左右腐殖土壤中。 4.想一想，這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？你打算選用哪一種方法？ 提示：參看本課題參考資料的內(nèi)容。 5.為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？ 答：在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。 （二）練習(xí) 2.答：流程圖表示如下。 土壤取樣→選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來(lái)確定）→梯度稀釋→將菌懸液涂布到有特定選擇作用的培養(yǎng)基上→挑選單菌落→發(fā)酵培養(yǎng) 專(zhuān)題3 植物的組織培養(yǎng)技術(shù) 課題1 菊花的組織培養(yǎng) 課題成果評(píng)價(jià) （一）對(duì)接種操作中污染情況的分析 接種3～4 d后，在接種操作中被雜菌污染的培養(yǎng)物會(huì)表現(xiàn)出被污染的現(xiàn)象。請(qǐng)學(xué)生適時(shí)統(tǒng)計(jì)污染率，分析接種操作是否符合無(wú)菌要求。 （二）是否完成了對(duì)植物組織的脫分化和再分化 觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，看看是否培養(yǎng)出了愈傷組織，記錄多長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)出愈傷組織。統(tǒng)計(jì)更換培養(yǎng)基后愈傷組織進(jìn)一步分化成根和芽的比例和時(shí)間。 （三）是否進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)、對(duì)照與記錄 做好統(tǒng)計(jì)和對(duì)照，填好結(jié)果記錄表，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。從實(shí)驗(yàn)的第一步開(kāi)始就要求學(xué)生做好實(shí)驗(yàn)記錄，可以讓學(xué)生分組配制不同培養(yǎng)基，如誘導(dǎo)愈傷或直接分化叢芽的培養(yǎng)基，然后做不同配方的比較。 （四）生根苗的移栽是否合格 生根苗移栽技術(shù)的關(guān)鍵是既要充分清洗根系表面的培養(yǎng)基，又不能傷及根系。一般使用無(wú)土栽培的辦法。培養(yǎng)基質(zhì)要提前消毒，可以向培養(yǎng)基質(zhì)噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的高錳酸鉀，并用塑料薄膜覆蓋12 h。掀開(kāi)塑料薄膜后24 h才能移栽。新移栽的組培苗要在溫室過(guò)渡幾天，等壯苗后再定植大田或進(jìn)行盆栽。學(xué)生可以在課后統(tǒng)計(jì)自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.你能說(shuō)出各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專(zhuān)題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？ 答：微量元素和大量元素提供植物細(xì)胞生活所必需的無(wú)機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，同時(shí)能夠維持細(xì)胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營(yíng)養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，無(wú)機(jī)鹽混合物包括植物生長(zhǎng)必須的大量元素和微量元素兩大類(lèi)。 2.你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)嗎？ 答：教師可以安排學(xué)生分組，做不同的材料或配方，最后分別匯報(bào)成果。但每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)可以取用一個(gè)經(jīng)過(guò)滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說(shuō)明培養(yǎng)基制作合格，沒(méi)有被雜菌污染。 （二）練習(xí) 1.答：植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對(duì)培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長(zhǎng)，如一些細(xì)菌、真菌等的生長(zhǎng)。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前功盡棄，因此要進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。 2.答：外植體的生理狀態(tài)是成功進(jìn)行組織培養(yǎng)的重要條件之一。生長(zhǎng)旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。 課題2 月季的花藥培養(yǎng) 課題成果評(píng)價(jià) （一）選材是否恰當(dāng) 選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。學(xué)生應(yīng)學(xué)會(huì)通過(guò)顯微鏡觀察處于適宜發(fā)育期的花粉。 （二）無(wú)菌技術(shù)是否過(guò)關(guān) 如果出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，說(shuō)明某些操作步驟，如培養(yǎng)基滅菌、花蕾消毒或接種等有問(wèn)題。 （三）接種是否成功 如果接種的花藥長(zhǎng)出愈傷組織或釋放出胚狀體，花藥培養(yǎng)的第一步就成功了。要適時(shí)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，以便愈傷組織或胚狀體進(jìn)一步分化成再生植株。 答案和提示 （一）旁欄思考題 為什么花瓣松動(dòng)會(huì)給材料的消毒帶來(lái)困難？ 答：花瓣松動(dòng)后，微生物就可能侵入到花藥，給材料的消毒帶來(lái)困難。 （二）練習(xí) 1.答：F2代紫色甜玉米的基因型組成可能為Aasusu或AAsusu。如果運(yùn)用常規(guī)育種方法，將F2代中的紫色甜玉米與白色甜玉米（aasusu）進(jìn)行測(cè)交，可以選擇出基因型為AAsusu純種紫色甜玉米。但這種方法比較繁瑣，耗時(shí)也較長(zhǎng)，需要至少三年的選種和育種時(shí)間。如果利用花藥培養(yǎng)的技術(shù)，在F1代產(chǎn)生的花粉中就可能有Asu的組合，再將花粉植株進(jìn)行染色體加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的純合體（AAsusu）。這種方法可以大大縮短育種周期。 2.答：植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無(wú)菌技術(shù)及接種操作等基本相同。兩者的不同之處在于：花藥培養(yǎng)的選材非常重要，需事先摸索時(shí)期適宜的花蕾；花藥裂開(kāi)后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時(shí)更換培養(yǎng)基；花藥培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基配方的要求更為嚴(yán)格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。 專(zhuān)題4 酶的研究與應(yīng)用 課題1 果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用 課題成果評(píng)價(jià) 本課題評(píng)價(jià)的重點(diǎn)應(yīng)放在對(duì)學(xué)生探究報(bào)告的評(píng)價(jià)上。報(bào)告的主要內(nèi)容應(yīng)該包括：根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制出的溫度和pH對(duì)果膠酶活性影響的曲線圖；不同果膠酶用量對(duì)出汁量影響的曲線圖（在濃度和體積相同的條件下）；并最終得到果膠酶最適溫度、pH以及果膠酶的最適用量。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1．為什么在混合蘋(píng)果泥和果膠酶之前，要將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理？ 提示：將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理，可以保證底物和酶在混合時(shí)的溫度是相同的，避免了果泥和果膠酶混合時(shí)影響混合物的溫度，從而影響果膠酶活性的問(wèn)題。 2．在探究溫度或pH的影響時(shí)，是否需要設(shè)置對(duì)照？如果需要，又應(yīng)該如何設(shè)置？為什么？ 提示：需要設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，不同的溫度梯度之間或不同的pH梯度之間就可以作為對(duì)照，這種對(duì)照稱(chēng)為相互對(duì)照。 3．A同學(xué)將哪個(gè)因素作為變量，控制哪些因素不變？為什么要作這樣的處理？B同學(xué)呢？ 提示：A同學(xué)將溫度或pH作為變量，控制不變的量有蘋(píng)果泥的用量、果膠酶的用量、反應(yīng)的時(shí)間和過(guò)濾的時(shí)間等。只有在實(shí)驗(yàn)中保證一個(gè)自變量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能說(shuō)明問(wèn)題。B同學(xué)對(duì)于變量的處理應(yīng)該與A同學(xué)相同，只是觀察因變量的角度不同。 4．想一想，為什么能夠通過(guò)測(cè)定濾出的蘋(píng)果汁的體積大小來(lái)判斷果膠酶活性的高低？ 提示：果膠酶將果膠分解為小分子物質(zhì)，小分子物質(zhì)可以通過(guò)濾紙，因此蘋(píng)果汁的體積大小反應(yīng)了果膠酶的催化分解果膠的能力。在不同的溫度和pH下，果膠酶的活性越大，蘋(píng)果汁的體積就越大。 5．當(dāng)探究溫度對(duì)果膠酶活性的影響時(shí)，哪個(gè)因素是變量，哪些因素應(yīng)該保持不變？ 提示：溫度是變量，應(yīng)控制果泥量、果膠酶的濃度和用量、水浴時(shí)間和混合物的pH等所有其他條件不變。只有這樣才能保證只有溫度一個(gè)變量對(duì)果膠酶的活性產(chǎn)生影響。 （二）練習(xí) 答：大規(guī)模生產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室制備的主要不同點(diǎn)是： 1.有兩次瞬間高溫滅菌； 2.酶處理的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)； 3.有離心分離步驟和濃縮步驟。 課題2 探討加酶洗衣粉的洗滌效果 實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)材料：添加了復(fù)合酶的洗衣粉，大小相同的白棉布4塊（在上面分別滴加4滴同種的植物油，放置至干燥）。 水溫、水質(zhì)及水量：水溫的溫度梯度為5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃（其中5 ℃可以通過(guò)冰箱冷藏室來(lái)控制，其他溫度可以通過(guò)水浴控制）；水質(zhì)為自來(lái)水；水量為500 mL。 實(shí)驗(yàn)儀器：1 000 mL的燒杯、玻璃棒等。 子課題二不同種類(lèi)的洗衣粉對(duì)同一污漬或不同污漬洗滌效果的比較 比較子課題一與子課題二：在子課題一中，水溫是變量，其他因素在實(shí)驗(yàn)中保持不變；而在子課題二中，水溫則應(yīng)保持不變。在實(shí)施子課題二時(shí)，通常應(yīng)采用當(dāng)?shù)氐某?，如果是冬季水溫過(guò)低，就應(yīng)采用水浴的方法，使溫度達(dá)到25 ℃～35 ℃。 市場(chǎng)中的洗衣粉有多種類(lèi)型，應(yīng)選擇不同種類(lèi)的加酶洗衣粉和普通洗衣粉。污物的選擇也應(yīng)該多樣化，只有這樣才具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。表4-2的選擇供參考，表中的“√”號(hào)表示可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此外，學(xué)生也可以針對(duì)污漬相同、布料（如化纖或棉布）的不同情況，探究不同種類(lèi)洗衣粉的洗滌效果。 不同種類(lèi)的洗衣粉對(duì)同一污漬或不同污漬洗滌效果的列表比較 污染物 蛋白酶洗衣粉 復(fù)合酶洗衣粉 普通洗衣粉 油漬 √ √ 血漬 √ √ √ 奶漬 √ √ √ 果汁漬 √ √ √ 課題成果評(píng)價(jià) 本課題的評(píng)價(jià)可以分為三個(gè)方面：一是設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案是否思路清晰、科學(xué)性和操作性強(qiáng)；二是實(shí)驗(yàn)報(bào)告是否全面，是否涵蓋了本課題所要求達(dá)到的目標(biāo)；三是能否根據(jù)自己的探究成果，結(jié)合生活中的實(shí)際情況，設(shè)計(jì)一份宣傳板報(bào)或有關(guān)加酶洗衣粉的使用說(shuō)明材料，供家人或本校的教職員工參考。學(xué)生完成課題后，應(yīng)該得出以下三方面的結(jié)論。 1．加酶洗衣粉與普通洗衣粉洗滌效果的比較分析。 2．各種不同品牌的加酶洗衣粉對(duì)油漬、血漬和奶漬等污物的不同的洗滌效果分析。 3．使用加酶洗衣粉時(shí)應(yīng)注意的一些事項(xiàng)。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1．查閱資料，看看普通洗衣粉中包含哪些化學(xué)成分？ 提示：普通洗衣粉中通常包含有：表面活性劑、水軟化劑、堿劑、漂白劑等成分，有的洗衣粉中還含有增白劑、香精和色素，以及填充劑等。 2．在本課題中你打算使用什么方法和標(biāo)準(zhǔn)判斷洗滌效果？ 提示：可在洗滌后比較污物的殘留狀況，如：已消失、顏色變淺、面積縮小等，最好能進(jìn)行定量的比較。 （二）練習(xí) 1.答：列表比較如下。 普通洗衣粉 加酶洗衣粉 相同點(diǎn) 表面活性劑可以產(chǎn)生泡沫，可以將油脂分子分散開(kāi)；水軟化劑可以分散污垢；等等。 不同點(diǎn) 酶可以將大分子有機(jī)物分解為小分子有機(jī)物，小分子有機(jī)物易于溶于水，從而與纖維分開(kāi)。 2.答：不合適。因?yàn)榻z綢的主要成分是蛋白質(zhì)，它會(huì)被加酶洗衣粉中的蛋白酶分解，損壞衣物。 課題3 酵母細(xì)胞的固定化 課題成果評(píng)價(jià) （一）觀察凝膠珠的顏色和形狀 如果制作的凝膠珠顏色過(guò)淺、呈白色，說(shuō)明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說(shuō)明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。 （二）觀察發(fā)酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生酒精，可以看到產(chǎn)生了很多氣泡，同時(shí)會(huì)聞到酒味。 教師不僅要對(duì)學(xué)生制作的固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)，還要對(duì)學(xué)生的操作過(guò)程進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，對(duì)酵母細(xì)胞固定化原理和實(shí)驗(yàn)操作方法的理解，也應(yīng)是評(píng)價(jià)的有機(jī)組成部分。 答案和提示 練習(xí) 1.答：直接使用酶、固定化酶和固定化細(xì)胞催化的優(yōu)缺點(diǎn)如下表所示。 類(lèi)型 優(yōu)點(diǎn) 不足 直接使用酶 催化效率高，低耗能、低污染等。 對(duì)環(huán)境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應(yīng)后酶會(huì)混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。 固定化酶 酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離，同時(shí)，固定在載體上的酶還可以被反復(fù)利用。 一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，而在生產(chǎn)實(shí)踐中，很多產(chǎn)物的形成都通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)才能得到的。 固定化細(xì)胞 成本低，操作更容易。 固定后的酶或細(xì)胞與反應(yīng)物不容易接近，可能導(dǎo)致反應(yīng)效果下降等。 3.提示：可以從酶的結(jié)構(gòu)的多樣性，對(duì)理化條件的敏感程度等角度思考。 專(zhuān)題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題1 DNA的粗提取與鑒定 實(shí)驗(yàn)案例 案例一 以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取 課前準(zhǔn)備 本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)。 教師可以到市場(chǎng)售活雞處索取雞血，所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑檸檬酸鈉溶液。具體制備方法如下。取質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的檸檬酸鈉溶液100 mL，置于500 mL燒杯中，注入新鮮的雞血（約180 mL），同時(shí)用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免血液凝結(jié)。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，靜置1 d，使血細(xì)胞自行沉淀。有條件的學(xué)校也可以將血液倒入離心管內(nèi)進(jìn)行離心，用2 000 r/min或3 000 r/min的轉(zhuǎn)速，離心2 min，使血細(xì)胞沉淀于離心管底部，這樣可以使血細(xì)胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。值得注意的是雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過(guò)程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。 提取DNA的具體步驟 1.破碎細(xì)胞，釋放DNA 雞血細(xì)胞中的DNA與核蛋白結(jié)合，位于雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中，正常情況下是不會(huì)釋放出來(lái)的。為了使DNA從細(xì)胞核中釋放出來(lái)，需要向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水，并且攪拌，從而使血細(xì)胞膜和核膜脹破。用玻璃棒攪拌可以加速細(xì)胞的破裂。注意應(yīng)沿一個(gè)方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般5～10 mL的雞血細(xì)胞液加入20 mL蒸餾水?dāng)嚢? min。釋放出來(lái)的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，應(yīng)用3～4層紗布進(jìn)行過(guò)濾，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)。 2．溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA 在濃度較高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游離出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入兩倍體積的濃度為2 mol/L的NaCl溶液，攪拌1 min。注意應(yīng)沿一個(gè)方向攪拌，使DNA充分溶解。 3．DNA的析出 將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。教材中列舉了提取DNA的三種方案，本案例選取方案一。加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞。同時(shí)應(yīng)注意控制加水量，使NaCl溶液的終濃度為0.1～0.2 mol/L。加水過(guò)程一般分三次進(jìn)行，當(dāng)總加水量為300 mL左右時(shí)，DNA已基本析出。加水太多、溶液過(guò)稀，會(huì)使DNA分子又重新溶解。 用3～4層紗布對(duì)DNA稀釋液進(jìn)行過(guò)濾，濾去蛋白質(zhì)，收集DNA的黏稠物。如果采用離心法，效果更好。用4 000 r/min轉(zhuǎn)速的離心機(jī)，離心15 min，除去上清液(含有蛋白質(zhì))，留下的沉淀物中含有DNA。此時(shí)注意觀察DNA黏稠物的顏色。 4.DNA的初步純化 如果提取的DNA量不夠多且其中含有較多雜質(zhì)，或者加入溶液和攪拌等操作過(guò)程不規(guī)范，都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，常常使制取的DNA粗制品不能顯示出DNA的本色──白色。為了增進(jìn)實(shí)驗(yàn)效果，需要對(duì)DNA粗制品進(jìn)行簡(jiǎn)單的提純，下面的方案可供參考。 將DNA黏稠物再溶解，繼續(xù)用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物，仍舊沿一個(gè)方向不停攪拌3 min，使DNA充分溶解，以免損失。用3～4層紗布進(jìn)行過(guò)濾（或離心），濾去雜質(zhì)，收集含有DNA的濾液。向?yàn)V液中貼壁緩慢加入50 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇，并用玻璃棒朝一個(gè)方向緩慢、均勻地?cái)嚢瑁芤褐袝?huì)出現(xiàn)DNA絲狀物。 實(shí)驗(yàn)一般要求采用預(yù)冷的95％的乙醇，但對(duì)比結(jié)果顯示，常溫下的乙醇溶液也可產(chǎn)生明顯效果。從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。此時(shí)懸浮于溶液中的DNA絲狀物相對(duì)含雜質(zhì)較少，如果出現(xiàn)的絲狀物較少，可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘。濃縮后的DNA絲狀物，可以用緩緩旋轉(zhuǎn)玻璃棒的方法卷起(因?yàn)椴ＡО粲形紻NA的作用)。如果DNA絲狀物較少，不易吸附在玻璃棒上，也可以用筷子等表面粗糙的用具來(lái)幫助DNA分子纏繞。 DNA的純化還有許多其他方法。例如，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開(kāi)。隨后，加入氯仿—異丙醇混合液（體積比為24∶1），通過(guò)離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去,取上清液?？芍貜?fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚處理后，離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性存在于酚層中，這時(shí)可用分液漏斗或吸管等儀器將二者分開(kāi)。教師可以根據(jù)學(xué)校的條件讓學(xué)生自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 5．DNA的鑒定 二苯胺法二苯胺試劑的配制及鑒定DNA的方法參見(jiàn)教科書(shū)。需要注意的是，二苯胺試劑在冰箱內(nèi)可保存6個(gè)月，使用前需搖勻。 紫外燈照射法用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的溴化乙錠(EB)溶液，將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹到蠟紙上，再滴1滴EB溶液染色。將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射(暗室中)，可呈現(xiàn)橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm處)。 電泳法此方法適合鑒定純度較高的DNA。有條件的學(xué)校可以參考本專(zhuān)題課題2的實(shí)驗(yàn)案例和參考資料部分。 案例二 以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取 課前準(zhǔn)備 將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24 h。 提取DNA的具體步驟 1.取材 稱(chēng)取30 g菜花，去梗取花，切碎。 2.研磨 將碎菜花放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min。 研磨液的配制方法如下。將10.1 g Tris加入到50 mL蒸餾水中，使其溶解，然后，用2 moL/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述藥品全部溶解后，再用蒸餾水定容至1 000 mL。 教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑，使植物細(xì)胞膜破碎，釋放DNA。學(xué)生可以設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，比較哪一種方法可以提取到純度更高的DNA。一般實(shí)驗(yàn)室提取高純度的DNA都采用一種陽(yáng)離子去污劑──十六烷三甲基溴化銨分離緩沖液，使細(xì)胞膜破碎，同時(shí)將DNA與植物中多糖等雜質(zhì)分開(kāi)，再用氯仿—異丙醇混合液（體積比為24∶1）抽提去除雜質(zhì)蛋白，得到高純度的DNA。 3.過(guò)濾 在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過(guò)濾到燒杯中(有條件的學(xué)校可將濾液倒入塑料離心管中進(jìn)行離心，用1000 r/min的轉(zhuǎn)速，離心2～5 min，取上清液放入燒杯中)。在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。 4.沉淀 將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95％的預(yù)冷乙醇溶液中，并用玻璃棒緩緩、輕輕地?cái)嚢枞芤?玻璃棒不要直插到燒杯底部)。沉淀3～5 min后，可見(jiàn)白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn)，將絮狀物纏繞在玻璃棒上。 課題成果評(píng)價(jià) （一）是否提取出了DNA 觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備。 （二）分析DNA中的雜質(zhì) 本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。 （三）不同實(shí)驗(yàn)方法的比較 對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)方法，本課題可以采用分組的方法進(jìn)行研究。首先選取不同的實(shí)驗(yàn)材料，其次同種材料還可以采用不同方法，從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1．為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？ 答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。 2．加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？ 答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。 3．如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？ 答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。 4．此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。 5．為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？ 答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。 6．方案二與方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。 （二）練習(xí) 1．答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。 2．答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是因?yàn)?，與DNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒(méi)有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。 課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 實(shí)驗(yàn)案例 PCR擴(kuò)增雙歧桿菌編碼16SrRNA的DNA片段 1.雙歧桿菌的培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)用雙歧桿菌作為實(shí)驗(yàn)材料，需要在實(shí)驗(yàn)前一天培養(yǎng)雙歧桿菌。雙歧桿菌的培養(yǎng)基配方如下。 大豆蛋白胨5.0 g 胰胨5.0 g 酵母提取物10 g 葡萄糖10 g 微量鹽溶液40 mL 半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g 0.1%（0.1 g/100 mL）刃天青 1 mL 將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0。 其中，微量鹽溶液的配方如下。 CaCl2 0.2 g MgSO47H2O 0.48 g K2HPO4 1 g KH2PO4 1 g NaHCO3 10 g NaCl 2 g 培養(yǎng)雙歧桿菌24 h后，將菌液進(jìn)行離心，雙歧桿菌將沉淀在試管底部。 2．PCR操作。往雙歧桿菌的沉淀中加入0.2 mL裂解液（裂解液配方為50 mmol/ L 的Tris-HCl , 0.5 %的Tween 20, 1 mg/ mL的蛋白酶K，pH為8.0），使細(xì)胞裂解，釋放出DNA。將裂解液在55 ℃溫度下加熱孵育3 h后，再在95 ℃溫度下加熱10 min，然后立即放入冰水中冷卻。冷卻后離心，將10 μL上清液轉(zhuǎn)移到0.5 mL的離心管中，然后依次加入10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5 μL、25 mmol/ L 的MgCl2溶液3 μL，20 mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL(2U/μL)，蒸餾水29 μL，兩種引物(25 μmol/ L) 各0.5 μL?；靹蚝蟀唇炭茣?shū)表格中的數(shù)據(jù)設(shè)定PCR程序，進(jìn)行反應(yīng)。 需要說(shuō)明的是，進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)可以直接購(gòu)買(mǎi)試劑盒，試劑盒的價(jià)格比單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)試劑的價(jià)格要低，并且包括了PCR所需的所有試劑。但是，試劑盒上往往只標(biāo)出了試劑號(hào)，而沒(méi)有標(biāo)明試劑的名稱(chēng)，因此購(gòu)買(mǎi)時(shí)要進(jìn)行詳細(xì)的咨詢(xún)。如果單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)試劑，PCR所需的引物必須委托相關(guān)的試劑公司來(lái)合成，合成后必須低溫保存，否則引物容易發(fā)生降解。本實(shí)驗(yàn)所用引物的堿基序列如下。 引物I 5′GGATTCTGGCTCAGGATGAACGG 3′ 引物II 5′CCGGGTGCTICCCACTTTCATGG 3′( I 代表堿基次黃嘌呤, 它可以與A、G、C、T中的任何1個(gè)堿基配對(duì))。 3．PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。產(chǎn)物的檢測(cè)除了可以采用教科書(shū)中提供的方法外，還可以采用瓊脂糖凝膠電泳的方法。瓊脂糖凝膠電泳的有關(guān)介紹可參見(jiàn)本專(zhuān)題中課題3《血紅蛋白的提取和分離》以及本課題的參考資料，具體操作步驟如下。 （1）用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子。 （2）配制濃度為1%（1 g/100 mL）的瓊脂糖凝膠。在錐形瓶中，稱(chēng)取一定量的瓊脂糖粉，加入適量蒸餾水，在微波爐內(nèi)加熱，使瓊脂糖粉熔化，然后冷卻至60 ℃，倒入電泳槽中，待其凝固。 （3）配制0.5倍的TBE電泳緩沖液100 mL。配制方法見(jiàn)本課題的參考資料部分。 （4）向電泳槽中緩緩倒入配制好的電泳緩沖液，以沒(méi)過(guò)膠面2 mm為宜。小心移去梳子，注意不要破壞加樣孔。如果樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去。 （5）在DNA樣品中加入相當(dāng)于樣品0.2倍體積的載樣緩沖液（載樣緩沖液的成分參見(jiàn)本課題中參考資料），混勻后，加入樣品孔內(nèi)。 （6）接通電源。一般紅色代表正極，黑色代表負(fù)極。DNA樣品是由負(fù)極向正極移動(dòng)，因此要保證靠近加樣孔一端的電極為負(fù)極。電壓為1～50 V/cm(長(zhǎng)度以?xún)蓚€(gè)電極之間的距離計(jì)算)。 （7）當(dāng)指示劑移動(dòng)到凝膠邊緣時(shí)，斷開(kāi)電源，終止電泳。一般200～400個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，在50 V電壓下，電泳20～40 min即可。 （8）將凝膠放入溴化乙錠溶液中染色后，在紫外儀上觀察電泳帶及其位置，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的情況。 課題成果評(píng)價(jià) DNA片段的擴(kuò)增是否成功 檢測(cè)DNA片段的擴(kuò)增情況，既可以采用教科書(shū)中提供的方法，也可以采用教師用書(shū)中實(shí)驗(yàn)案例提供的方法。對(duì)于教科書(shū)中的方法，可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果；對(duì)于電泳檢測(cè)的方法，可以通過(guò)在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。如果擴(kuò)增不成功，則要分析失敗原因?？赡艿脑蛴校郝┘恿薖CR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取? 答案和提示 練習(xí) 1.提示：繪圖可參考教科書(shū)中圖5-9。PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段（2n=230=1 073 741 824)。 2.提示：PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)的。引物的設(shè)計(jì)需要豐富的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，感興趣的學(xué)生可以參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（見(jiàn)本專(zhuān)題參考書(shū)目），書(shū)中有詳盡的論述。 課題3 血紅蛋白的提取和分離 課題成果評(píng)價(jià) （一）是否完成對(duì)血液樣品的處理 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見(jiàn)教科書(shū)圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 （二）凝膠色譜柱的裝填是否成功。 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。 （三）血紅蛋白的分離是否成功 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。 答案和提示 （一）旁欄思考題 你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？ 答：凝膠實(shí)際上是一些微