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2012年度碩士論文答辯,論文題目：腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像學(xué)位申請(qǐng)人：羅冬梅專業(yè)名稱：光學(xué)研究方向：生物組織的二次諧波成像所在院系：生物光子學(xué)研究院導(dǎo)師姓名和職稱：金鷹副教授2012.06.04,contents,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,SHG于1961年首次被Franken發(fā)現(xiàn)：當(dāng)兩個(gè)具有相同基頻的光子同時(shí)與具有非對(duì)稱結(jié)構(gòu)的樣品相互作用時(shí)，散射產(chǎn)生恰好雙倍于激發(fā)頻率的二次諧波光信號(hào)（半波長(zhǎng)，雙倍能量）。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,研究背景和內(nèi)容,實(shí)驗(yàn)原理、裝置和流程,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,,SHG成像特點(diǎn)對(duì)生物組織無(wú)光損傷和光致毒。SHG具有高度的方向性。無(wú)需外源性標(biāo)定物即可實(shí)現(xiàn)成像。SHG顯微成像不受前向發(fā)射性質(zhì)的限制，可以與其它顯微成像裝置聯(lián)合成像，如TPEF、OCT等聯(lián)合使用，進(jìn)行成像比較，實(shí)現(xiàn)信號(hào)互補(bǔ)。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,SHG在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,研究?jī)?nèi)容：利用TPEF/SHG光譜學(xué)成像技術(shù)對(duì)不同DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)獲取DNA樣品（基因組DNA溶液、細(xì)胞核提取物以及培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核）的SHG信號(hào)并進(jìn)行高解析度成像。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞添加少量的乙醇（體積比小于5%）可以得到SHG信號(hào)。在此基礎(chǔ)上，探討乙醇對(duì)DNA構(gòu)象的影響。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,介質(zhì)在強(qiáng)激光作用下，電極化強(qiáng)度與入射輻射的場(chǎng)強(qiáng)E之間的關(guān)系可以表示為：P=χ(1)E+χ(2)E2+χ(3)E3χ(1)是介質(zhì)的一階線性極化率；χ(2)和χ(3)分別表示介質(zhì)的二階、三階非線性極化率；χ(2)E2正是二次諧波和雙光子熒光激發(fā)等二階非線性光學(xué)產(chǎn)生的根源。SHG的產(chǎn)生與介質(zhì)的二階非線性極化率的存在率有關(guān)，χ(2)不為零。χ(2)與材料本身的特性有關(guān)，它反映了分子的中心對(duì)稱性、介質(zhì)分子排列和取向等細(xì)微結(jié)構(gòu)。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,研究背景和內(nèi)容,實(shí)驗(yàn)原理、裝置和流程,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,二次諧波的產(chǎn)生條件：（1）非中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)（2）相位匹配,,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,相位匹配傳播中的基波和不斷產(chǎn)生的倍頻極化波之間保持相位一致，相互干涉，當(dāng)相位完全匹配時(shí)產(chǎn)生的二次諧波輸出功率最大。實(shí)際上就是要求入射光與二次諧波倍頻光在介質(zhì)中的折射率相等（即傳播速度相同）。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,鈦寶石飛秒激光器發(fā)出的超短脈沖激光通過(guò)聲光調(diào)制器后到達(dá)雙光子激光掃描顯微鏡作為激發(fā)光，經(jīng)過(guò)主二向色性光束分束器由油浸物鏡聚焦到樣品上，樣品在基頻光激發(fā)下產(chǎn)生背向二次諧波再經(jīng)油浸物鏡收集，經(jīng)過(guò)紅外光束濾色片濾除漫反射的基頻光后將激發(fā)光輸送到META探測(cè)，由探測(cè)器探測(cè)后轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)傳輸至計(jì)算機(jī)。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,人肝癌細(xì)胞系BEL-7420購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。,細(xì)胞傳代培養(yǎng),基因組DNA、細(xì)胞核的提取,,SHG成像,,,,培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞提前一天接種于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,基因組DNA溶液的發(fā)射光譜,,,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,研究背景和內(nèi)容,實(shí)驗(yàn)原理、流程和裝置,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,細(xì)胞核提取物的成像與光譜,基因組DNA溶液的發(fā)射光譜,細(xì)胞核提取物的發(fā)射光譜,,,,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,培養(yǎng)細(xì)胞的SHG/TPEF成像,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,,,結(jié)論：基因組DNA和細(xì)胞核提取物DNA均能產(chǎn)生SHG信號(hào)，且細(xì)胞核提取物的SHG/TPEF信噪比明顯高于基因組DNA的SHG/TPEF信號(hào)。常規(guī)狀態(tài)下幾乎觀測(cè)不到來(lái)自培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核核區(qū)的SHG信號(hào)。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加少量無(wú)水乙醇（體積比小于5%），可以在培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域檢測(cè)到SHG信號(hào)。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,DNA產(chǎn)生二次諧波的原因：（1）DNA由核苷酸分子構(gòu)成，核苷酸是手性分子，滿足非中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)；（2）DNA的反向平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)在一定的電場(chǎng)激發(fā)下，能夠?qū)崿F(xiàn)相位匹配，滿足產(chǎn)生SHG的產(chǎn)生條件。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,研究背景和內(nèi)容,實(shí)驗(yàn)原理、流程和裝置,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,在真核細(xì)胞中，DNA以非常致密的形式存在于細(xì)胞核中；基因組DNA是以線性雙鏈的形態(tài)的存在于溶液中，DNA致密程度遠(yuǎn)低于細(xì)胞核DNA。,基因組DNA的SHG/TPEF信噪比低于細(xì)胞核DNA的原因：,,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,在細(xì)胞中DNA主要以B型構(gòu)象存在，也包括Z型和A型構(gòu)象。,乙醇誘導(dǎo)DNA構(gòu)象發(fā)生改變對(duì)于添加酒精后培養(yǎng)細(xì)胞中出現(xiàn)SHG信號(hào)，我們推測(cè)是由于乙醇的加入改變了培養(yǎng)細(xì)胞DNA的分子構(gòu)象，導(dǎo)致DNA的某些光學(xué)特性發(fā)生了變化，從而引起SHG的產(chǎn)生。,,DNA構(gòu)象影響因素：（1）溶劑極性；（2）介電常數(shù)；（3）粘度；（4）離子濃度,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,當(dāng)加入乙醇到DNA溶液中，使得溶液中水活性降低，致使結(jié)合到DNA上的水分子數(shù)減少，原來(lái)被水分子支撐而伸展的DNA溝槽收縮，大溝槽變得更窄更深，小溝槽變得更寬更淺，使得DNA整體外形變得更短，從而導(dǎo)致DNA構(gòu)象由B型向A型轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變將改變雙螺旋結(jié)構(gòu)中大溝槽和小溝槽的氫鍵類型。,,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,DNA隨著乙醇濃度的增大穩(wěn)定性會(huì)降低，推測(cè)當(dāng)加入乙醇到培養(yǎng)的細(xì)胞中，乙醇小分子會(huì)通過(guò)核孔進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，致使DNA的穩(wěn)定性降低從而使DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合松散，使雙鏈處于較松散的狀態(tài)，有利于DNA與RNA結(jié)合致使構(gòu)象發(fā)生改變。,松散狀態(tài)的DNA,DNA與RNA結(jié)合,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,反射式背向二次諧波信號(hào)強(qiáng)度由以下公式?jīng)Q定：,由上式可知二次諧波信號(hào)強(qiáng)度與介質(zhì)的二階非線性極化率有關(guān)。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,二階非線性極化率又與材料本身的特性有關(guān)：它反映了介質(zhì)分子的中心對(duì)稱性、介質(zhì)分子排列和取向等細(xì)微結(jié)構(gòu)。推測(cè)有可能乙醇的加入造成的DNA構(gòu)象的轉(zhuǎn)變使得DNA分子的二階非線性極化率χ(2)發(fā)生變化，繼而導(dǎo)致介質(zhì)的二次諧波加強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次說(shuō)明了二次諧波對(duì)生物組織的微觀結(jié)構(gòu)的變化極其敏感。,,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,在活細(xì)胞中，由于細(xì)胞本身不滿足非中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)，每個(gè)核苷酸分子產(chǎn)生的二次諧波相互疊加抵消使得我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中并未觀測(cè)到SHG的產(chǎn)生。當(dāng)加入乙醇分子后，DNA分子表面的電荷特性發(fā)生改變以及分子的螺旋構(gòu)象形態(tài)發(fā)生改變，使得每個(gè)分子在同樣入射光的的激發(fā)下所產(chǎn)生的超極化強(qiáng)度與之前相比發(fā)生改變，在我們觀察的生物組織區(qū)域內(nèi)，所有的二次諧波相位一致而相互干涉加強(qiáng)，滿足相位匹配原理，使得我們?cè)诩尤胍掖己笥^察到了SHG。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,由此，反推基因組DNA和細(xì)胞核提取物中SHG的產(chǎn)生，由于在提取這兩種物質(zhì)的過(guò)程中添加了乙醇，乙醇的加入也會(huì)影響DNA的構(gòu)象，對(duì)二次諧波的產(chǎn)生和增強(qiáng)造成一定的影響。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,總結(jié)：本論文圍繞光學(xué)非線性成像技術(shù)在生物組織成像中的應(yīng)用進(jìn)行展開(kāi)，討論了基于DNA樣品的二次諧波（SHG）的非線性光學(xué)成像，探討了乙醇對(duì)DNA光學(xué)特性的影響。有助于進(jìn)一步理解生物組織中DNA二次諧波效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制及其影響因素，對(duì)進(jìn)一步獲取生物組織DNA的細(xì)微結(jié)構(gòu)信息，拓寬其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。,,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,研究背景和內(nèi)容,實(shí)驗(yàn)原理、流程和裝置,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,不足與展望：（1）乙醇對(duì)DNA二次諧波成像的影響只是做了定性的研究，未來(lái)還可以考慮定量方面的研究。（2）還可以考慮其它的化學(xué)試劑（如十二烷基硫酸鈉：SDS，乙二胺四乙酸二鈉鹽：EDTA等）對(duì)DNA非線性光學(xué)特性產(chǎn)生影響，并進(jìn)行相關(guān)的研究。,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,致謝,本論文是在導(dǎo)師金鷹老師的細(xì)心指導(dǎo)和幫助下完成的。在此，我向金鷹老師表示衷心的感謝，感謝他三年來(lái)在我的科研、學(xué)習(xí)和生活上的指導(dǎo)、關(guān)心與幫助！感謝鄧小元老師的幫助與支持，感謝光子中醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的其他各位老師對(duì)我學(xué)習(xí)和研究上很多有益的幫助和鼓勵(lì)。感謝光子中醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的各位同學(xué)在我的實(shí)驗(yàn)相關(guān)工作中的關(guān)心與幫助。感謝國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目/科學(xué)部主任基金項(xiàng)目（30940020）對(duì)本課題的資助和支持！感謝我的父母及家人在我三年碩士期間對(duì)我的長(zhǎng)期支持與鼓勵(lì)！最后，衷心地感謝各位答辯老師能夠在百忙之中參與我的答辯??！,腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像,研究生期間發(fā)表的論文,1、羅冬梅、金鷹等，“腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像”《光譜學(xué)與光譜分析》，2012；2、羅冬梅，金鷹等，“人類基因組非冗余Exon/Intron數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建”《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)》，2010；3、羅冬梅，金鷹等，“腫瘤基因組研究進(jìn)展”《激光生物學(xué)報(bào)》，2009。,ThankYou!,