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1、沈陽藥科大學(xué)成人高等教育畢業(yè)論文 氟羅沙星注射液無菌檢查方法學(xué)研究 學(xué)生姓名： 席文娟 專業(yè)形式層次： 藥學(xué)本科 學(xué)號（或準(zhǔn)考證號）：080319030 指導(dǎo)教師： 至丹 實習(xí)單位： 西安安健藥業(yè)有限公司 完成時間： 2009 年11月 通訊地址： 西安市周至縣藥廠路1號 郵政編碼： 710400 聯(lián)系電話（手機）： 13474532309 成人高等教育畢業(yè)論文誠信聲明 本人鄭重聲明：所呈交的畢業(yè)論文，是本人在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下， 獨立進行研究工作所取得的成果，成果不存在知識產(chǎn)權(quán)爭議，除文中已 經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫 過的作

2、品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體均已在文中以 明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 畢業(yè)論文作者簽名: 年 月日 摘要 第 1 章 引言 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 2 第 2 章 實驗部分 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 2 1 環(huán)境與儀器設(shè)備 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 2 1.1 實驗環(huán)境 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 2 1.2 儀器與試藥 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 2 1.3 試驗用菌株 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 3 1.4 培養(yǎng)基 ,,,

3、,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 3 1.5 沖洗液和稀釋劑 ,,,,,,,,,,,,,,,,,, 3 2 方法與結(jié)果 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 3 2.1 菌液制備 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 3 2.2 樣品取樣量與前處理 ,,,,,,,,,,,,,,,,, 4 2.3 方法驗證試驗 I ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 5 2.4 方法驗證試驗H ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 5 2.5 方法驗證試驗田,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 6 2.6 方法驗證試驗IV ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

4、7 2.7 樣品的無菌檢查 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 7 第 3 章 結(jié)論 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 8 參考文獻 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 8 致謝 氟羅沙星注射液無菌檢查方法學(xué)研究 藥學(xué)專業(yè) 2008 級函授專升本 席文娟 摘要 建立氟羅沙星注射液的無菌檢查方法。 本試驗取氟羅沙星注射液， 按《中國藥典》 2005版二部收載［1］的“無菌檢查法”項下進行試驗。結(jié)果表明：采用方法驗證試驗IV 進行氟羅沙星注射液的無菌檢查， 供試品無菌生長， 而 6 株陽性菌生長良好， 方法可 行。 關(guān)鍵詞：氟羅沙星注射液；無菌

5、檢查法（薄膜過濾法） ；方法學(xué)驗證 ABSTRACT A test method for sterility of Fleroxacin Injection was established. The test method was carried out according to the method of volume two, Chinese Pharmacopoeia Edition 2005. Three validation tests were engaged, and the third one show that all of six strains positive co

6、ntrol tubes reveal growth of microorganism and the test control gives no evidence of growth . The method can be used to tset for sterility of this preparation . Keyword: Fleroxacin Injection ； test for sterility ； method validation tests 第一章引言 氟羅沙星注射液是一種新型的第三代氟唯諾酮類光譜抗菌藥物，主要通過抑制 DN順轉(zhuǎn)酶活性，而達到殺菌作用，其具

7、有抗菌譜廣、抗菌活性強、血中濃度高、組 織滲透性強、消除半衰期長等特點[2]。臨床上主要用于對本品敏感細菌引起的急性支 氣管炎，慢性支氣管炎急性發(fā)作及肺炎等呼吸系統(tǒng)感染；膀胱炎、腎盂腎炎、前列腺 炎、附睪炎、淋病奈瑟菌性尿道炎等泌尿生殖系統(tǒng)感染；傷寒沙門菌感染、細菌性痢 疾等消化系統(tǒng)感染；皮膚軟組織感染、骨感染、腹腔感染及盆腔感染等 [3]。本品屬注 射劑，為確保臨床用藥安全，《中國藥典》2005年版二部附錄規(guī)定需要進行無菌檢查 [1]。通過查閱、參考、借鑒有關(guān)抗生素藥品無菌檢查方法驗證文獻 [4-6] o 第二章實驗部分 1環(huán)境與儀器材料 1.1 實驗環(huán)境（見表2.1） 表2.1潔

8、凈度檢測結(jié)果（溫濕度：20C, 55% 檢查項目 無國至 尢菌室凈化臺 陽性對照室 陽性性對照室凈化 臺 塵埃粒子數(shù)o 0.5um） 1066 0 1200 0 沉降菌數(shù) 0 0 0 0 級別 100 100 100 100 由表2.1可見，實驗條件符合“無菌檢查法”要求。 1.2 儀器與試藥 HTY- 601型智能集菌儀及一次性使用全封閉集菌培養(yǎng)器 （杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備 有限公司生產(chǎn)）；氟羅沙星注射液（西安安健藥業(yè)有限公司，規(guī)格為 2ml: 0.2g,批號 為 20090801） 。 1.3 試驗用菌株 金黃色葡萄球菌（ Stap

9、hylococcus aureus） [CMCC（B）26003] 、銅綠假單胞菌 （ Pseudomonas aeruginose） [CMCC（B）10104] 、枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis） [CMCC（B）63501] 、生孢梭菌（ Clostridium sporogenes） [CMCC（B）64941] 、白色念珠 菌（Candida albican^ [CMCC（B）98001]、黑曲霉菌（Aspergillus niger） [CMCC（B）98003] （均由陜西省食品藥品檢驗所提供，前 5 株菌為第三代，黑曲霉菌為第二代 ）。 1.4 培

10、養(yǎng)基 （適用性檢查、無菌性檢查、靈敏度檢查按《中國藥典》 2005年版二部附 錄檢查均符合要求） 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 （批號： 0811172） 、 真菌 （改良馬丁） 培養(yǎng)基 （批號： 071017） 、 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號： 0811063） 、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號： 070926） 、營養(yǎng)肉 湯培養(yǎng)基（批號： 070809） 、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號： 080710） （北京三藥科技開 發(fā)公司） 。均按《中國藥典》 2005 年版二部附錄的要求配制及滅菌。 1.5 沖洗液和稀釋劑 0.9%氯化鈉溶液（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠） 、 0.1%蛋白胨水溶液（北京奧博

11、 星生物技術(shù)有限公司） 。按《中國藥典》 2005 年版二部附錄的要求配制及滅菌。 2 方法與結(jié)果 2.1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、 銅綠假單胞菌、 枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯中， 30?35c培養(yǎng)18?24小時，用0.9%滅菌氯化鈉溶7稀釋制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu （菌落形成單位）的菌懸液（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿法計數(shù)） ；接種生孢梭菌的新鮮培 養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30?35c培養(yǎng)18?24小時，用0.9%滅菌氯化鈉溶 液稀釋制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基平皿法計數(shù)）； 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

12、中， 23?28C培養(yǎng)24?48小時， 用0.9%X菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液（玫瑰紅鈉瓊脂 培養(yǎng)基平皿法計數(shù)）；接種黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面上，23? 28c培養(yǎng)5天，加3?5m10.9%€菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫，然后，吸出抱子懸液（用 管口帶有薄的無菌棉花能過濾菌絲的無菌毛細吸管）至無菌試管內(nèi)，用 0.9%滅菌氯 化鈉溶液稀釋制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的抱子懸液（改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基平皿 法計數(shù)）。結(jié)果見表2.2。 表2.2驗證用菌液的稀釋級別及接種量 試驗菌名稱 稀 釋 級 別 菌 落 數(shù) 接種量 1

13、1ml） 規(guī)定接 種量 試驗菌名稱 稀 釋 級 別 菌 落 數(shù) 接 種 量 規(guī)定接 種量 金更色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003] 10-6 85 1 小于 100cfu 生抱梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B)64941] 10-5 75 1 小可 100cfi 1 銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginose) [CMCC(B)10104] 10-6 79 1 小可 100cfu j 白色念珠菌

14、(Candida albicans) [CMCC(B)98001] 10-5 83 1 小可 100cfi 1 枯草芽抱桿菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501] 10-6 82 1 小可 100cfu j 黑曲霉菌 (Aspergillus niger) [CMCC(B)98003] 10-4 70 1 小可 100cfi 1 2.2 樣品取樣量與前處理 20支樣品，按照無菌方法進行 參照《中國藥典》2005年版二部附錄無菌檢查的有關(guān)規(guī)定[1],驗證實驗時每一驗證 菌株需要的樣品量相當(dāng)于每一濾筒的樣

15、品量，即每管 處理，備用。 2.3 方法驗證試驗I 取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（兩聯(lián)）一套，將 2.2項下的樣品按薄膜過濾法濾至 一管中，于最后加入小于100cfu的試驗菌，加入100ml相應(yīng)的培養(yǎng)基于濾筒內(nèi)作為 試驗管；另一管加入相應(yīng)的試驗菌及培養(yǎng)基作為對照管。再取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 及改良馬丁培養(yǎng)基分別泵入另兩管一次性全封閉集菌培養(yǎng)器中， 作為陰性對照管。按 規(guī)定溫度將上述一次性集菌培養(yǎng)器培養(yǎng) 3?5天（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30?35c 培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23?28c培養(yǎng)）。各試驗菌同法操作，結(jié)果見表 2.3 o 表2.3 方法驗證試驗I試驗結(jié)果 金黃色葡萄 銅綠假單

16、 枯草芽抱 生抱梭菌 白色念珠菌 黑曲霉菌 陰 球菌 胞菌 桿菌 試驗對照 試驗對照 試驗對照 試驗對照 試驗 對照 試驗對照 S G 一 + ~\- -F 一 ~\" -F + 一 + ~\- -F 一 + ~\- -F + + + + + + + + — — 注：S表示硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 G表示改良馬丁培養(yǎng)基 表2.3中結(jié)果顯示兩霉菌正常生長，細菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯 草芽抱菌、生抱梭菌）均不能生長，顯示本品的抑制作用將對無菌檢查結(jié)果的判斷有 影響，應(yīng)考濾使用一定量沖洗液和中和劑消除干擾。 2.4 方法驗證

17、試驗n 取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（兩聯(lián)）一套，取少量沖洗液潤濕濾膜，先將 2.2項 下的樣品按薄膜過濾法濾至一管中，用 0.1%蛋白陳水溶液（含0.1mol/L MnSO45ml） 沖洗，分3次沖洗，每次100ml,并于最后一次沖洗液中加入小于 100cfu的試驗菌， 過濾，加入100ml相應(yīng)的培養(yǎng)基于濾筒內(nèi)作為試驗管；另一管加入相應(yīng)的試驗菌及培 養(yǎng)基作為對照管。再取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基分別泵入另兩管一次 性全封閉集菌培養(yǎng)器中，作為陰性對照管。按規(guī)定溫度將上述一次性集菌培養(yǎng)器培養(yǎng) 3?5天（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30?35c培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23?28c培養(yǎng)）。 各試驗菌

18、同法操作，結(jié)果見表2.4。 表2.4方法驗證試驗I試驗結(jié)果 金黃色葡 萄球菌 試驗對照 銅綠假單 胞菌 試驗對照 枯草芽抱 桿菌 試驗對照 生抱梭菌 試驗對照 白色念珠 菌 試驗對照 黑曲霉菌 試驗對照 陰 S G + + + + + + + + 一 ~\" -F + 一 + ~\- -F + + + + + + + + — — 注：S表示硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 G表示改良馬丁培養(yǎng)基 經(jīng)每管用300m10.1就白陳水?液（含0.1mol/L MnSO45ml）沖洗后，銅綠假單 胞菌在48小時內(nèi)生長，金黃色葡萄球菌在第四天生長，枯草芽抱

19、菌和生抱梭菌仍未 生長，表明本品的抑菌作用仍未消除，需進一步加大沖洗液用量。 2.5 方法驗證試驗田 取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（兩聯(lián)）一套，取少量沖洗液潤濕濾膜，先將 2.2 項下的樣品按薄膜過濾法濾至一管中， 用0.1%白陳水溶液（含0.1mo1/L MnSO45m1） 沖洗，分5次沖洗，每次100ml,并于最后一次沖洗液中加入小于 100cfu的試驗菌， 過濾，加入100ml相應(yīng)的培養(yǎng)基于濾筒內(nèi)作為試驗管；另一管加入相應(yīng)的試驗菌及培 養(yǎng)基作為對照管。再取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基分別泵入另兩管一次 性全封閉集菌培養(yǎng)器中，作為陰性對照管。按規(guī)定溫度將上述一次性集菌培養(yǎng)器培養(yǎng) 3

20、?5天（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30?35c培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23?28c培養(yǎng)）。 各試驗菌同法操作，結(jié)果見表2.5。 表2.5方法驗證試驗I試驗結(jié)果 金黃色葡 銅綠假單 枯草芽抱 生抱梭菌 白色念珠 黑曲霉菌 陰 萄球菌 胞菌 桿菌 菌 試驗對照 試驗對照 試驗對照 試驗對照 試驗對照 試驗對照 S G + + + + + + + + 一 ~\" -F + 一 + ~\- -F + + + + + + + + — — 注：S表示硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 G表示改良馬丁培養(yǎng)基 經(jīng)每管用500m10.1陸白陳水?液（含0.1mol

21、/L MnSO45ml）沖洗后，銅綠假單 胞菌和金黃色葡萄球菌均在 48小時內(nèi)生長，枯草芽抱菌和生抱梭菌仍未生長，表明 本品的抑菌作用仍未消除，還需進一步加大沖洗液用量。 2.6 方法驗證試驗IV 取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（兩聯(lián)）一套，取少量沖洗液潤濕濾膜，先將 2.2 項下的樣品按薄膜過濾法濾至一管中， 用0.1%白陳水溶液（含0.1mo1/L MnSO45m1） 沖洗，分10次沖洗，每次100ml,并于最后一次沖洗液中加入小于 100cfu的試驗菌， 過濾，加入100ml相應(yīng)的培養(yǎng)基于濾筒內(nèi)作為試驗管；另一管加入相應(yīng)的試驗菌及培 養(yǎng)基作為對照管。再取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基

22、分別泵入另兩管一次 性全封閉集菌培養(yǎng)器中，作為陰性對照管。按規(guī)定溫度將上述一次性集菌培養(yǎng)器培養(yǎng) 3?5天（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30?35c培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23?28c培養(yǎng)）。 各試驗菌同法操作，結(jié)果見表2.6。 表2.6方法驗證試驗I試驗結(jié)果 金黃色葡 萄球菌 試驗對照 銅綠假單 胞菌 試驗對照 枯草芽抱 桿菌 試驗對照 生抱梭菌 試驗對照 白色念珠 菌 試驗對照 黑曲霉菌 試驗對照 陰 S G + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + — — 注：S表示硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 G

23、表示改良馬丁培養(yǎng)基 經(jīng)每管用500m10.1%白陳水?液（含0.1mo1/L MnSO45m1）沖洗后，枯草芽抱 菌在48小時內(nèi)生長，生抱梭菌在72小時內(nèi)才被觀察到。結(jié)果表明，檢驗條件下生抱 梭菌對氟羅沙星注射液更為敏感，所以選擇生抱梭菌作為氟羅沙星注射液無菌檢查的 陽性對照菌。 2.7 樣品的無菌檢查 取樣品60支，分別按薄膜過濾法濾至一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（三聯(lián)）中，每 管濾 20支樣品，用 0.1%蛋白胨水溶液作為沖洗液，沖洗量 1000ml/ 管 ，沖畢，于兩 管中泵入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（其中一管加入小于 100cfu 的生孢梭菌作為陽性對 照管） ，另一管泵入改良馬

24、丁培養(yǎng)基，上述各管按規(guī)定溫度培養(yǎng) 14 天，逐日觀察，供 試品管均澄清，陽性管生長良好，判供試品符合規(guī)定。 結(jié)論 方法驗證試驗I表明本品在未沖洗時對細菌有明顯的抑制作用， 在方法驗證試驗 H、方法驗證試驗田及方法驗證試驗IV三次試驗中，通過對沖洗液的調(diào)整（由 300ml 調(diào)至1000ml）與中和法（0.1mol/L MnSO45ml）消除了抑菌干擾。經(jīng)實驗方法驗證， 試驗IV可作為氟羅沙星注射液的無菌檢查法。 參考文獻 [1] 中國藥典 [S]. 二部， 2005: 附錄 89. [2] 趙忠芹 . 羅沙星注射液治療細菌感染性疾病 91 例的療效觀察 [J]. 山西醫(yī)藥雜志， 2

25、004， 33 （ 7） ： 602. [3] 國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥說明書內(nèi)容匯編 [S].2002:2-90. [4] 李佳寧， 張新妹 . 氟喹諾酮類藥物的無菌檢查方法驗證 [J]. 西北藥學(xué)雜志， 2005 ， 20（ 4） ： 74. [5] 方玲芬 . 鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液無菌檢查方法學(xué)研究 [J]. 中國藥事， 2006 ， 20（ 9 ） ： 554. [6] 麻明臣，邱海濱，張亞娟，等 . 乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液無菌檢查方法學(xué)研究 [J]. 中國藥 事， 2008， 22 （ 3） ： 251 致謝 這次的畢業(yè)設(shè)計既檢驗了我對所學(xué)知識的掌握程度， 又使我對專業(yè)知識有了更深 刻的理解。在此非常感謝我的指導(dǎo)老師李丹，不管是從選題，構(gòu)思到最后定稿的各個 環(huán)節(jié)給予細心指引與教導(dǎo) , 使我得以最終完成畢業(yè)論文設(shè)計。 在學(xué)習(xí)中 , 老師嚴(yán)謹?shù)闹? 學(xué)態(tài)度、豐富淵博的知識、敏銳的學(xué)術(shù)思維、精益求精的工作態(tài)度是我終生學(xué)習(xí)的楷 模，將永遠激勵著我。在此，謹向老師致以衷心的感謝和崇高的敬意！ 最后，我要向百忙之中抽時間對本文進行審閱，評議和參與該論文答辯的各位老 師表示感謝。 9