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細胞融合實驗,liuzhe5@,概念促融合劑與融合技術(shù)應(yīng)用與意義,重點,一定義：Cellfusion,細胞融合：(Cellfusion)又稱體細胞雜交（somatichybridization）是指將不同來源的原生質(zhì)體(除去細胞壁的細胞)相融合，將兩個或多個細胞合并成一個細胞的技術(shù)。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,人心肌細胞,人肝臟細胞,,,,,,,,,,種內(nèi)雜交細胞,,,,,,人細胞,鼠細胞,,,,,,,,,,種間雜交細胞,在適當?shù)臈l件下，細胞融合在一起，產(chǎn)生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞，稱為雜交細胞（hybridcell）。種內(nèi)雜交細胞（intraspecifichybridcell）:同種細胞融合而成的細胞種間雜交細胞（interspecifichybridcell）:不同種的細胞融合而成的細胞,非對稱細胞融合（asymmetricfusion）：利用物理或化學方法使某親本細胞的核或細胞質(zhì)失活后再進行融合。,細胞核或細胞質(zhì)失活的有物理和化學方法：1.物理方法，如X射線、r射線等，它們能使細胞核失活；2.化學方法，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（R－6－G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達到失活作用。,動物克隆,上海第二醫(yī)科大學陳瑩博士,2003年，她將一5歲男孩的包皮細胞與一只已去除細胞核的新西蘭兔卵母細胞融合，獲得了人類早期胚胎。,二細胞融合的原理,,,熒光標記的小鼠細胞和人細胞融合實驗,將小鼠的抗體與發(fā)綠色熒光的熒光素(fluorescin)結(jié)合,人的抗體與發(fā)紅色熒光的羅丹明(rhodamine)結(jié)合；,顯微鏡下的細胞融合過程,細胞融合的過程,細胞互相靠近,細胞膜融合,細胞橋形成,細胞質(zhì)融合,細胞核融合,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,細胞融合主要經(jīng)過了兩原生質(zhì)體或細胞互相靠近、細胞橋形成、胞質(zhì)滲透、細胞核融合主要步驟。細胞橋的形成是細胞融合最關(guān)鍵的一步，融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋。,細胞融合過程中兩個細胞膜的變化,形成細胞橋的具體變化,細胞融合分為兩種：1.自發(fā)細胞融合2.人工誘導(dǎo)細胞融合,（1）自發(fā)細胞融合,自發(fā)細胞融合（spontaneouscellfusion）是在未施加任何誘導(dǎo)條件的情況下所發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象。,自發(fā)細胞融合現(xiàn)象在自然界中并不多見，常見的主要有以下幾種情況：1.精子和卵子受精2.肌管的形成3.胚胎著床4.巨細胞的形成5.破骨細胞的形成6.腫瘤細胞融合,,（2）誘導(dǎo)細胞融合,人工誘導(dǎo)細胞融合是在人為條件下發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象,常用的誘導(dǎo)方法有三種：1.生物法（病毒誘導(dǎo)法等）2.化學法（PEG誘導(dǎo)法、Ca2+誘導(dǎo)法、溶血卵磷脂誘導(dǎo)法等）3.物理法（電誘導(dǎo)法等）,1.病毒誘導(dǎo)法,常用的病毒：仙臺病毒（Sendalvirus),又稱日本血凝病毒（HemagglutinatingvirusofJapan,HVJ）屬于副粘液病毒科，RNA病毒，圓球形1962年，日本仙臺東北大學學者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可誘導(dǎo)細胞融合。,病毒促使細胞融合兩個原生質(zhì)體或細胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近，使兩個細胞膜、胞質(zhì)間互相滲透--------細胞核互相融合，進入正常的細胞分裂途徑，雜種子細胞。,,2化學法（聚乙二醇）,PEG:聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH性狀：白色蠟狀固體，具有強烈的凝集、沉淀蛋白質(zhì)的作用分子量〉1000-6000u，可作誘融劑。,20世紀70年代，華裔科學家高國南發(fā)現(xiàn)聚乙二醇能誘導(dǎo)細胞融合,,分子量小的PEG，融合效應(yīng)差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。pH偏堿時融合效應(yīng)最高。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者，常用濃度為50％，pH8.0~pH8.2,聚乙二醇,普遍認為聚乙二醇分子能改變各類細胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合,基本原理,聚乙二醇(PEG)是一種多聚化合物，商品名卡波蠟(Carbowax)。,聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細胞融合,原理：PEG帶有大量的負電荷,和原生質(zhì)體表面的負電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高pH,高鈣離子的溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。,,融合過程中應(yīng)注意①事先要做好兩種原生質(zhì)體的識別標記，如色素、缺陷型、抗性標記等。②原生質(zhì)體的密度應(yīng)在105個／mL左右，兩種原生質(zhì)體按1：1等量混合。③常用PEG的分子量通常為4000~6000，加熱熔化與Eagle溶液配成50％(W／V)濃度(小分子質(zhì)量的PEG配成55％濃度)。加入PEG后，24℃培育10~20min注意時間宜短不宜長，過長，使原生質(zhì)體周圍包裹一層膜形成凝集體，會降低融合率)，緩緩加入高pH、高鈣離子溶液15min后用沖洗液清洗，離心收集原生質(zhì)體。,3.物理法一電融合誘導(dǎo)法,1981年，Scheurich和Zimmermann發(fā)明了電誘導(dǎo)細胞融合。,電融合槽,在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。,細胞電融合,原理：懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細胞，在1—100MHz和100—1000V/cm的交流電場中，會向小電極移動，并極化成偶極子，而沿電場方向發(fā)生雙向電泳，此時再加上適當強度和持續(xù)時間的高壓電脈沖，即可使相鄰細胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電降解，從而觸發(fā)細胞融合。,,,+,--,,+,-,,+,-,,,,+,,,--,,,-,+,,偶極子,電誘導(dǎo)法原理,,,,+,--,,,-,+,,,,雙向電泳：在交流電場的作用下（1MHz，150V/cm）細胞膜上正負電荷分離，產(chǎn)生偶極，兩個極化的細胞會發(fā)生相互的緊密接觸。,,,,,,原生質(zhì)體電融合過程,1）在高頻電流電場下的相互接觸。2）脈沖刺激后30s3)50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。,注意事項,1）對介質(zhì)要求高，一般用高純度的蒸餾水并選用適當?shù)姆请娊橘|(zhì)溶液，如甘露醇等配制等滲性介質(zhì)。2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強度和時間，以防止細胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。,優(yōu)點：,融合率高，達70％－80％，甚至100％可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細胞融合可直接挑選雜種細胞重復(fù)性強、對原生質(zhì)體傷害小；裝置精巧、方便簡單；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性強等。,融合指數(shù)（fusionindex）:反映細胞融合的效率有兩種計算方法：1.FI=（對照組細胞數(shù)-試驗組細胞數(shù)）/試驗組細胞數(shù)2.FI=多核細胞中的細胞核數(shù)/所有細胞中的細胞核數(shù),,不同細胞融合的條件及其主要應(yīng)用,來源前處理融合的方法主要應(yīng)用動物細胞不需仙臺病毒,PEG，電融合生產(chǎn)單克隆抗體植物細胞脫壁PEG,電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細胞脫壁PEG,高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種,,,,,,A,,,A,,,,,B,B,,,,A,,A,,,,,B,B,,,,,,,,B,A,,,,A,,,,B,同核體,同核體,異核體（雜交細胞）,未融合,未融合,,,加入融合劑,融合細胞的類型,,同核體：由同一親本細胞融合而來異核體：（heterokaryon）有不同親本細胞融合而來異核體其細胞膜融合在一起，而融合的細胞含有兩個不同的細胞核。,動物細胞融合影響因素,動物細胞融合中，除促融劑外，其他如細胞性質(zhì)、溫度、pH、離子強度及離子種類等均全影響細胞融合效率。①親本細胞表面性質(zhì)影響較大②細胞種類不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化細胞較易融合，而淋巴細胞或血球細胞幾乎不融合。③細胞融合時需要適宜溫度和運動狀態(tài)。如仙臺病毒誘導(dǎo)-腹水癌細胞融合時，于37℃振搖時易于融合，且融合效率與病毒量呈正比。但在34℃振搖則融合率下降。在37℃時不振搖則-不融合。,,④細胞融合過程中，通常耗氧量較大，缺氧時經(jīng)常不融合。空氣中含氧量大于20％時有一定融合率，但有些細胞在無氧條件也可融合。⑤有些細胞融合時需要Ca2+，否則不融合，細胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生變化。實驗表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等離子可代替Ca2+，但有效濃度較Ca2+大的多。融合時最適合的離子強度一般為0.1mol/L。⑥最適合的pH為7.4-7.8之間，在此范圍之外，融合率均較低。,比較常用的雜種細胞篩選方法,1遺傳互補篩選法：2營養(yǎng)互補篩選：3溫度敏感篩選法,1）遺傳互補篩選法：利用每一親本貢獻一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細胞表現(xiàn)正常。親本A：HGPRT-/TK+親本B：HGPRT+/TK-雜交細胞：HGPRT+/TK+在HAT培養(yǎng)基中雜交細胞存活，A、B死亡,2）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)：細胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時，不能生長繁殖即營養(yǎng)缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理可以篩選雜種細胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。,3）溫度敏感突變型雜種細胞的篩選：一般的培養(yǎng)細胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細胞。親本一：低溫敏感突變型，可在低溫下生長，在高溫下死亡。親本二：高溫敏感突變型，可在高溫下生長，在低溫下死亡。雜種細胞能在高溫和低溫下生長。,細胞融合的應(yīng)用,1.用于基因定位2.用于生產(chǎn)樹突狀細胞抗腫瘤疫苗2.用于動物育種3.用于細胞治療4.用于生產(chǎn)單克隆抗體5.用于研究核質(zhì)關(guān)系和腫瘤發(fā)生機制,細胞融合應(yīng)用,一.單克隆抗體1975年英國科學家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細胞同腫瘤細胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies",,GeorgesJ.F.KoehlerFederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunologyBasel,Switzerlandb.1946d.1995,CarMilsteinArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)d.2002,科萊爾,米爾斯坦,,單克隆抗體的概念,單:單個細胞克隆:無性繁殖抗體:化學性質(zhì)單一、特異性強,親本細胞的準備,細胞融合,雜交瘤細胞的篩選,可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞的篩選,雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng),單克隆抗體的生產(chǎn)和純化,,,,,,,,,,,,生產(chǎn)過程,單克隆抗體的大量制備過程,一細胞融合前準備(一)動物免疫與免疫脾細胞懸液的制備在腹腔免疫1－2次后的2－4周，于融合前3—4天加強免疫一次，這樣可以使抗原最近激活的B淋巴細胞定位于脾臟，也使記憶細胞處在激活與分裂狀態(tài)。許多資料結(jié)果表明，脾細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤的最佳時間，是在抗體形成高峰之前，而不是在抗體形成高峰期?？扇苄钥乖拿庖吡砍?0-100ug，經(jīng)皮下或腹腔注射免疫1-2次（間隔2-3周），3周后50-500ug抗原加強免疫，加強免疫一定要靜脈注射或腹腔內(nèi)注射，確?？乖竭_脾臟。細胞抗原常用2107用細胞腹腔注射，不需佐劑。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液。,,淋巴細胞：經(jīng)過免疫處理的淋巴細胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法：對細胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動物體內(nèi)。3－4天后，在無菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95％以上的可以用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細胞，調(diào)整為107個/ml，加適當濃度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴細胞。,,小牛血清的選擇①供血的新生小牛必須是健康牛的產(chǎn)仔，并在產(chǎn)后24小時內(nèi)抽血，此期間不得吸取母乳。②以無菌操作自頸動脈放血，并在無菌條件下分離血清及濾菌，全過程在36小時內(nèi)完成。經(jīng)濾菌的血清置－20℃保存。③血清使用前需做細菌、支原體培養(yǎng)及內(nèi)毒素測定，在確實無污染的情況下方可使用。④每批小牛血清測定總蛋白含量并分別配成10％、20％、25％于基礎(chǔ)培養(yǎng)基和HAT培養(yǎng)基中，對骨髓瘤細胞和雜交瘤細胞進行培養(yǎng)，觀察小牛血清對瘤細胞和融合細胞的細胞毒性。⑤輕微溶血的血清，而無細胞毒性者仍可應(yīng)用。⑥在用血清做細菌培養(yǎng)時，應(yīng)置于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)進行，培養(yǎng)期間隨時可放于倒置顯微鏡下觀察，可避免由于肉眼觀察的疏忽。,,,B淋巴細胞的準備,紅細胞,,將紅細胞注入小鼠皮下或腹腔,,取出脾臟,,B淋巴細胞,,親本細胞的準備,(二)骨髓瘤細胞的獲得與培養(yǎng),骨髓瘤細胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一晶系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAB。骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可利用一般的動物細胞培養(yǎng)液。小牛血清的濃度一般在10％—20％，細胞的最大密度不得超106個／ml，一般擴大培養(yǎng)以1：10稀釋傳代，每3-5天傳代一次。細胞的倍增時間為16-20h。,親本細胞的準備,骨髓瘤細胞的準備,骨髓瘤細胞：是癌變的漿細胞，可以分泌免疫球蛋白，所以必須選擇不分泌免疫球蛋白的缺陷型骨髓瘤細胞，多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細胞。,,細胞融合,,,加入PEG作融合劑,B淋巴細胞,骨髓瘤細胞,雜交瘤細胞,,1,2,3,4,二細胞融合,融合條件除了融合劑以外，還包括溫度、培養(yǎng)基和培養(yǎng)板等。我們首先分析用PEG作融合劑時的條件選擇。由于作用時間不一樣對細胞的毒性也不一樣。用于融合的分子量一般在1000－4000，一般作用濃度在35％－50％之間，PEG作用1－2分鐘，以PH8.0－8.2時融合率最高。,小白鼠脾臟細胞B與癌細胞N以PEG進行融合，操作在10min內(nèi)完成(如下圖)，隨即把細胞平均分配在96槽細胞培養(yǎng)盤中,,,細胞融合：1.脾細胞的準備；拉頸處死小鼠；無菌操作取出脾臟；清洗、研磨。2.制備脾細胞懸液:收集細胞；離心洗滌；細胞計數(shù)。3.準備骨髓瘤細胞:收集細胞；離心洗滌；活細胞計數(shù)；調(diào)整細胞濃度，骨髓瘤細胞與小鼠脾胞按一定比例混合。4.細胞融合劑的選擇：病毒，PEG。5.細胞融合：在聚乙二醇作用下各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。,,將免疫脾細胞和小鼠骨髓細胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)。1200rpm離心7—10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細胞鋪展成薄層。在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG0.5ml，隨后靜置90秒。再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。,,融合細胞的早期觀察及其異常結(jié)果分析：1．融合后的細胞早期觀察與管理；2．無分泌特異性抗體雜交瘤原因分析；3．轉(zhuǎn)種與擴大培養(yǎng)過程中雜交瘤細胞生長；4．不出現(xiàn)雜交瘤的原因分折。,三雜交瘤細胞的篩選,,融合,,,將細胞轉(zhuǎn)移到HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng),,HAT,,,1,2,3,4,HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞,細胞團塊分散后，加HAT溶液，稀釋至骨髓瘤細胞不超過2105ml，即可加入有飼養(yǎng)細胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和1ml。用HAT選擇性培養(yǎng)時每隔2－3天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細胞。,HAT選擇系統(tǒng),HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細胞DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種。,雜交瘤技術(shù)中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞為親本之一。HPRT-細胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生；TK-細胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。,淋巴細胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細胞通過互補作用獲得HRPT或TK基因，可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT-或TK-親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有雜種細胞存活。,四可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞的篩選,,HAT,將培養(yǎng)皿孔內(nèi)的上清液取出，檢測抗體。常用的方法有：放射免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫熒光測定。,融合,,五雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng),,,,123456,融合,,HAT,,,雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng),利用單個細胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細胞系。在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤生長的飼養(yǎng)細胞，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺細胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。,,克隆化的目的1）是細胞建株的必經(jīng)過程，以得到遺傳特征相同的細胞；2）就雜交瘤而言，可從中篩選出穩(wěn)定而同源的雜種細胞系，淘汰遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細跑。3）減少非分泌型無關(guān)細胞生長過快。注意事項：①待克隆細胞生長處于對數(shù)增長期；②小牛血清的質(zhì)量和濃度；③細胞計數(shù)要準確；④及時觀察細胞生長情況。,,飼養(yǎng)細胞的種類和作用對于培養(yǎng)小鼠細胞來說，主要有下列各種細胞可供作為其飼養(yǎng)細胞：①胸腺細胞,用量為106/0.2ml②正常的脾細胞；③傳代培養(yǎng)中的大鼠胚胎成纖維細胞；④腹腔細胞其用量為2104/0.2ml，腹腔細胞是使用得最普遍的飼養(yǎng)細胞。胚胎成纖維細胞因在細胞培養(yǎng)條件下有分裂增殖的能力，故只適應(yīng)于軟瓊脂平板法培養(yǎng)中，該細胞鋪于平板的底層。,,飼養(yǎng)細胞的作用①提高培養(yǎng)細胞的密度，使待克隆細胞容易生存與繁殖。②腹腔細胞能清除培養(yǎng)中的死亡細胞，從而促進單個細胞克隆的生長。③飼養(yǎng)細胞能釋放諸如細胞生長因子類物質(zhì)，起到促進細胞分裂、增殖的作用。,1.有限稀釋法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,稀釋,,,,,1）有限稀釋法有限稀釋法原理是從理論上將細胞稀釋到10個/ml，然后裝成每小孔(96孔板)0.1ml，使每孔理論上含有單個細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后即可獲得單個細胞形成集落。有限稀釋法舉例：1.取1.0ml5104ml細胞+4ml培養(yǎng)基稀釋，得1104/ml.2.取0.5ml1104ml細胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1103/ml.3.取1.0ml1103ml細胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1102/ml.,2.軟瓊脂培養(yǎng)法,在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的0.25％的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi)。,,,,,,,2）軟瓊脂培養(yǎng)法：本法對于某些抗原，可以把克隆化培養(yǎng)與特異性篩選測定結(jié)合起來進行，所以它的特點是效率較高，速度較快。但缺點是克隆率不高?；驹硎抢脝蝹€細胞在軟瓊脂培養(yǎng)基上的局限化生長，待細胞集落長到肉眼可見后，用巴氏吸管從瓊脂上挑出來(一般8—10天后)，再移到液體培養(yǎng)基中，進行生長繁殖，并檢測培養(yǎng)上清液的活性。也可以用溶血空斑技術(shù)或圍繞集落形成免疫沉淀的方法來直接測它的活性。,,3.顯微鏡操作法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3）顯微鏡操作法在倒置(或解剖)顯微鏡下，借助于毛細吸管將單個細胞個別吸出，分別放入已加飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)孔內(nèi)，根據(jù)原理不同，又分為普通法和玫瑰花結(jié)兩種方法。普通顯微鏡操作法：于6cm平皿中，假如約103個細胞；CO2培養(yǎng)基箱中靜置1小時左右無菌條件；在倒置顯微鏡下去平皿蓋用直角轉(zhuǎn)頭滴管，吸出單個細胞移至預(yù)先加有飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi)直至96孔均分裝有細胞，加蓋；于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)觀察與更換培養(yǎng)方法同有限稀釋法。玫瑰花結(jié)原理：分泌抗體細胞在其表面含有抗原受體，在—定的條件下常可與特異性抗原致敏的羊紅細胞形成玫瑰花結(jié)。如果從免疫動物的脾細胞中除去能形成特異性玫瑰花結(jié)的細胞則失去對特異性抗原的反應(yīng)性。,4.熒光激活分離法,,熒光激活細胞分離器法(FluoresemuactivatedCellSortu，F(xiàn)ACS)用本儀器分離單細胞的原理是將懸液中的細胞引入一種液流的中央，使其一個接一個地通過聚焦的高能激光束，根據(jù)熒光和光放射的性質(zhì)快速分析和分離細胞。,,5）蓋片分離法1.用釘錘于潔凈的橡膠上砸干凈蓋片；2.選擇碎塊、大小形態(tài)適用的選出；3.加培養(yǎng)液及進行細胞培養(yǎng)；4.倒置鏡下選細胞，挑出單細胞玻片；5.進行單個細胞培養(yǎng)。,,,,大量生產(chǎn)單克隆抗體：,(1)體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體；（2）體nei雜交瘤細胞制備腹水或血清1)實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細胞接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml.腫瘤達到一定大小后則可采血，從血清獲得單克隆抗體。,2）腹水的制備：,腹腔注射1x106雜交瘤細胞，按種細胞7-10天后可產(chǎn)生腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml，可以將腹水中細胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。,,避免夭折的方法可采用：①換液動作輕柔、換液量不超過1/2；②避免反復(fù)取出CO2培養(yǎng)箱，不宜經(jīng)常換液；③不輕易更換新批號小牛血清。及時判斷陽性孔也是一項重要的工作，可起減少工作量和保證重點雜交細胞雙重作用，待集落生長到96孔板孔1/3左右，24孔板1/5左右，就要及時測定各孔上清中是否會有特異性抗體，一旦發(fā)現(xiàn)抗體陽性孔，就應(yīng)立即擴大培養(yǎng)，再凍存和克隆化，以免被其他細胞生長所壓抑或意外丟失。無分泌特異性抗體雜交瘤原因分析：融合后經(jīng)HAT選擇有細胞克隆出現(xiàn)，但不能篩選出產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤，常見原因是：①抗體檢測法不夠敏感；②HAT選擇失?。虎廴旧w丟失和克隆競爭；④動物免疫不成功。,,,雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖,單克隆抗體的應(yīng)用,主要用于疾病的診斷、治療和預(yù)防。與常規(guī)抗體相比，具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)點。如；各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細菌及血吸蟲等數(shù)百種疾病的診斷；在疾病治療方面，單克隆抗體猶如人體衛(wèi)士，能識別“自己”與“異己”，一旦發(fā)現(xiàn)致病因素便與之結(jié)合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥物制成“生物導(dǎo)彈”，將藥物定向帶到癌細胞所在部位，既消滅了癌細胞又不會傷害健康細胞,美國科學家采用細胞融合技術(shù)將番茄和馬鈴薯的細胞融合在一起，培育出稱之為“番茄薯”或“薯番茄”的新型植物。植株地上部結(jié)番茄，地下部生長根莖，產(chǎn)量高，品質(zhì)好。,,,動物細胞融合與單克隆抗體思考與探究,1.植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)有什么不同？提示：植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細胞融合前需去掉細胞壁，然后再融合；動物細胞融合是兩個體細胞直接融合。,2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞？,提示：哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細胞，B淋巴細胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細胞大量增殖。B淋巴細胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖骨髓瘤細胞是一種癌細胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞，它會兼有兩個親本細胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。,,3已成功的動物細胞融合實例還有哪些？生物種類細胞來源成功年代酵母菌—雞原生質(zhì)體—血紅細胞1975年人—胡蘿卜腹水癌細胞—原生質(zhì)體1976年人—小鼠纖維肉瘤細胞—畸胎瘤細胞1978年,,,,4.為什么不用兩個而用多個細胞進行細胞融合？,就目前常用的細胞融合方法來看，不管是用物理的、化學的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細胞。更重要的是，即使兩個細胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細胞類型。目前動物細胞融合技術(shù)最有價值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來說明這一問題。我們知道，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達百萬種以上，但是每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一個脾細胞（含B淋巴細胞）和一個瘤細胞雜交，我們不能確定該脾細胞分泌的抗體是否正是我們所需要的；若用大量的脾細胞和瘤細胞進行融合，就可以從融合細胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。,5.雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？,融合后的細胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。,,這樣的人畜細胞融合會造成什么后果？4位專家分析指出：首先，某些目前未知的兔子疾病將傳染給人類，就像艾滋病病毒可能是從非洲猩猩而來。盡管中山醫(yī)科大學把胚胎用于治療性克隆研究，但萬一被居心叵測者植人人類子宮，就可能產(chǎn)生一個人兔雜交種?！斑@完全是對人類尊嚴的褻讀?！?精子和卵子受精,,肌管,,,破骨細胞是由好幾個細胞融合,,,巨細胞,,骨巨細胞瘤,骨巨細胞瘤綠色箭頭所指為正在融合的間質(zhì)細胞,,,附錄：蟾蜍血紅細胞\雞血紅細胞,[實驗步驟]1.試劑：(1)Alsver液：葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，氯化鈉0.42g，加重蒸水至100mL即可。(2)GKN液：氯化鈉8g，氯化鉀0.4g，磷酸氫二鈉1.77g，磷酸二氫鈉0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000mL重蒸水中。(3)Ringer溶液：二氯化鈉0.25g，氯化鉀0.42g，氯化鈉6.5g(恒溫動物9g)溶于1000mL蒸餾水中。(4)50％PEG混合液：稱取少許PEG(Mw4000)放人刻度離心管內(nèi)，在沸水浴中加熱，的等體積的GKN液，混勻。,[實驗步驟],1.細胞懸液的制備：(1)蟾蜍血紅細胞懸液制備：注射器吸1mLAlsver液后，從蟾蜍主動脈弓取血1mL，再加入2mLAlsver液放入刻度離心管內(nèi)，按照3：1(V／V)加入6mLAlsver液混勻，放入4℃冰箱內(nèi)可保存3--4天。(2)雞血紅細胞懸液的制備：用注射器吸入1mLAlsver液后從雞翼下靜脈取血2mL，注入刻度離心管內(nèi)，按照3：1(V／V)加入6mLAlsver液混勻。2.取細胞懸液1mL，移入10mL離心管，加4mL0.85％生理鹽水。1500r／min離心5min。3.棄上清液，加0.85％生理鹽水至5mL，混勻后1500r／min離心5min。重復(fù)再離心洗滌1次。4.收集最后1次離心沉淀的血細胞，加適量的GKN液或Ringer溶液，按壓積紅細胞體積配成10％的紅細胞懸液。5.取懸液1mL到1個試管中，加入0.5～0.8mL預(yù)熱的50％PEG混勻，置于30℃水浴2min；再加入Ringer或Hanks液5ml以終止PEG的作用;取血細胞懸液1滴滴于載玻片上，再加入0.2%次甲基藍溶液1滴,蓋上蓋玻片。6.顯微鏡(高倍)觀察2個或3個靠近細胞融合過程。7.進行多個視野的測定，統(tǒng)計平均融合,