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1、海洋微微型浮游生物研究方法綜述 馬曉麗 2014生態(tài)學(xué)碩士 21140611116 摘要：海洋微微型浮游生物是指徑粒大小介于 0.22仙m和2微米之間的浮游生 物， 在世界各海域廣泛存在， 包括微微型浮游植物和微微型浮游動物。 它們是海 洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分， 在維持海洋生物系統(tǒng)穩(wěn)定， 促進物質(zhì)循環(huán)和能量流 動上起重要作用。 研究微微型浮游生物在不同時間、 不同海域的豐度和多樣性可 以探索其分布規(guī)律和生態(tài)學(xué)作用， 為環(huán)境評價、 預(yù)測等提供數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。 為此， 本文綜述了目前世界范圍內(nèi)微微型浮游生物豐度和多樣性的研究方法以及 我國在該領(lǐng)域的研究狀況。 關(guān)鍵詞 ： 微

2、微型浮游生物；生態(tài)系統(tǒng)；豐度和多樣性；研究方法 Abstract： Picoplankton (varying from 0.2 to 2 仙 m) including picophytoplankton and picozooplankton are widely distributed in the oceans all over the world. They are important portions of plankton and play an crucial role in the maintaining of stability of ecosystem in the o

3、cean and the material recycling and energy flow. Studying of the abundance and diversity of picoplankton in different locations and time will help in the understanding of the rules of the distribution and the ecological status of picoplankton. And the knowledge of abundance and diversity of picoplan

4、kton will help to make a solid foundation for studying the impact of human activities on biological diversity and provide reference data and theoretical foundation for environmental assessmentand forecast. Therefore, the research methods of the abundance and diversity of picoplankton and domestic re

5、search situation in the field were reviewed in this paper. Keywords: picoplankton; ecosystem; abundance and diversity; methods of research 引言：海洋微微型浮游生物指的是海洋中存在的粒徑小于 2微米的浮游生物， 主要包括聚球藻、原綠球藻、微微型真核浮游生物異養(yǎng)細菌等類群。隨著微食物 環(huán)概念(Microbialloop) 的提出，微微型浮游生物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的作用越來 越受到人們的重視 ⑴。對于它們在海洋中的生態(tài)分布變化及影響因素的研究也日 益受到研

6、究者的關(guān)注。海洋微微型浮游生物在全球海洋中是生物量和生產(chǎn)力的重 要貢獻者，是生命和非生命系統(tǒng)聯(lián)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是生源要素循環(huán)的重要驅(qū)動力 ⑵。微微型浮游生物中的光合自養(yǎng)生物，在全球各大洋和近岸海域都有分布，對海 洋初級生產(chǎn)及海洋碳循環(huán)有巨大的貢獻，是微食物網(wǎng)重要的組成部分 ⑶。異養(yǎng)細 菌在海洋中既是分解者，又是生產(chǎn)者，它們利用水體中的溶解有機物(DOM解化為 自身物質(zhì)以生長和繁殖從而形成顆粒有機物 (POM),隨著原生動物攝食異養(yǎng)細菌， 這部分POMJ再次傳遞返回經(jīng)典食物鏈中，使海洋中大量的溶解有機物得以迅速 循環(huán)再利用，大大提高了初級生產(chǎn)提供的物質(zhì)與能量的利用效率浮游病毒作為分 解者對微食物

7、網(wǎng)中各主要角色都有相當程度的影響 ，病毒對細菌和藻類的裂解向 水中釋放DOM這部分DOM又被細菌再利用，產(chǎn)生了微食物環(huán)的病毒回路(Viral Shunt),影響了海洋海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動的途徑 [4]。 在國際上，對海洋微微型浮游生物的研究在上世紀 70年代,隨著顯微技術(shù)以 及其他多種研究技術(shù)和手段的發(fā)展，開始逐漸興起"我國的海洋微微型浮游生物 生態(tài)學(xué)研究起步較晚，一方面是研究手段的限制 ⑵，另一方便是歷史原因所導(dǎo)致， 直到上世紀80年代后期才逐漸開展。近年來，對我國近海微微型浮游生物生態(tài)學(xué) 的報道逐漸增多，取得了重要的進展，積累了許多寶貴資料。 圖1:微微型和微型浮游生物的

8、一種分類方法: 微微型浮游生物 2?2 pm) 微微型原核生物 微微型光合原核生物 |化能自養(yǎng)細菌 ?異養(yǎng)浮源細菌 超微型浮游生物 (W5 pm) 2 ?5 pm 微型浮游生物 C2~20 /im) I微微型真核生物 + (微型真核生物 I微型原核生物一 (微型原核生物一 超微型光合其核生物 超微型原生動物 微型真核生物 微型光合原核生物 微型光合原核生物 微型光合真核生物 微型原生動物 1. 微微型浮游生物研究進展 在微微型浮游生物豐富研究上， 由于早前研究對微微型生物未給予足夠重視 對其形態(tài)結(jié)構(gòu)

9、、種類組成等知之甚少。 1970 年代起 , 研究者們開始運用熒光顯微 技術(shù) ( FEM ) 、流式細胞術(shù) (FCM)【5】 及電子顯微技術(shù) (EM)【6】 進行海洋微微型生 物的豐度檢測和形態(tài)觀察。 微微型浮游生物按其食性， 細胞核性質(zhì)， 細胞進化與 結(jié)構(gòu)等分類方法不一， 這里分為微微型浮游植物和微微型浮游動物兩類。 其中的 微微型浮游植物類群主要有原綠球藻( Prochlorococcus ，簡稱 Pro ) 、聚球藻 (Synechococcus ,簡稱Syn)和微微型真核浮游植物 (Picoeukaryote ,簡稱Euk) 3 類 。根 據(jù)藻 膽素 組分 的不 同 ，又

10、可 將聚球藻 分成富 含藻紅素的 聚球藻 ( Phycoerythrin-rich, PE) 和富含藻藍素的聚球藻 ( Phycocyanin-rich,PC ) 兩 類。聚球藻(0.6-1.6 ^m)對低溫較不敏感，并且可以利用多種營養(yǎng)鹽，在緯度較 高，水深較淺的海域和河口中廣泛分布 ⑸。原綠球藻細胞極小(0.54-0.67 ^m), 含有獨特的色素二乙烯基葉綠素( divinyl-chlorophyll a,b )，也是唯一利用該 種色素作主要光合色素的野生型物種，分布在南北緯 40之間的大洋中，在寡 營養(yǎng)熱帶、 亞熱帶大洋海區(qū)等營養(yǎng)鹽含量較低的海域是浮游植物的優(yōu)勢種群 【10】。

11、 微微型真核浮游植物泛指直徑＜ 3Nm的所有真核浮游植物類群，物種組成非常 復(fù)雜，多樣性豐富，分布比原綠球藻和聚球藻更為廣泛 【 11】 。由于微微型浮游動 物與微微型真核浮游植物基本結(jié)構(gòu)相似， 有許多交集， 目前國際上劃分不是很明 顯，兩者研究方法基本相同 【12】。 在微微型生物多樣性研究方面， 20 世紀 70 年代末 , 由于落射熒光顯微鏡技 術(shù)的應(yīng)用 , 科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)聚球藻在海洋中的普遍存在聚球藻是一類單細胞、個體 微小(0.6-2 n m)、球形或短棒狀、進行二分裂的藍細菌 (cyanobacteria)。與真 核藻類和高等植物相似 , 聚球藻以葉綠素 a 作為主要

12、光合色素進行放氧光合作用 【7-9】。 20世紀 80年代， Chisholm 等于 1988年在對北大西洋和太平洋浮游植物進 行研究時發(fā)現(xiàn)在真光層底部有一種細胞體積極小但數(shù)量極大， 能夠發(fā)弱紅色熒光 的球狀或棒狀細胞，其細胞色素為類似葉綠素 a 的色素。通過純化培養(yǎng)后 Chisholm 等人于 1992 年將其命名為 Prochlorococcus marinus 。 【21】 此后 , Pro 的研究引起了浮游生物研究者的極大興趣 , 并在短短數(shù)年內(nèi)獲取了關(guān)于其分布、 動態(tài)生理和進化等等方面的大量資料。 直至 21 世紀初 , 分子生物學(xué)的迅速發(fā)展才 使得人們可以直接利用 D

13、NA 序列分析開展微微型真核生物的分子多樣性研究 11310 2001年,Moon-van de Staay等【聞 首次運用真核生物通用引物研究太平洋 表層海水中微微型真核生物的分子多樣性。目前 , 研究者們已利用分子生物學(xué)技 術(shù)對太平洋 【 15】 , 地中海 【16】 , 紅海 【 17-18】 , 印度洋 【19】 , 北冰洋 【20】 , 南極附近水體 【21】 等世界各大海域進行了微微型浮游生物多樣性研究 , 獲得了大量微微型真核生物 基因序列。 2. 微微型浮游生物豐度常用研究方法 2.1 培養(yǎng)技術(shù)法 即通過對細菌進行一定條件的培養(yǎng) , 根據(jù)細菌的菌落數(shù)或生長狀況計

14、算細菌 的數(shù)量。平板計數(shù)法是經(jīng)典的細菌計數(shù)方法：將所要計數(shù)的細菌適度稀釋 , 然后 在特定的平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng) , 通過計數(shù)生長出的單菌落數(shù) , 來計算細菌的豐 度。該方法的缺點較明顯 : 需要嚴格無菌的操作環(huán)境 , 不適于現(xiàn)場試驗 ; 現(xiàn)有的培 養(yǎng)基和培養(yǎng)條件并不適宜所有海洋細菌的生長 , 所以目前本方法在現(xiàn)場試驗中較 少使用。但是通過平板法可以獲得活的單菌落 , 在對細菌的分離純化、分類鑒定 研究中還在使用?？瞻叻ㄊ怯嫈?shù)病毒數(shù)量的經(jīng)典方法 , 原理與平板計數(shù)法類似 , 將病毒稀釋后與過量的宿主混合 , 然后鋪種于平板培養(yǎng)基上 , 培養(yǎng)一定時間后細 菌繁殖成乳白色襯底 ,

15、被病毒裂解的區(qū)域則在此襯底上表現(xiàn)為圓形的透明斑 , 稱 為噬斑 " 噬斑數(shù)代表該接種量中有活力的噬菌體數(shù)量。 如果挑出單個噬斑來培養(yǎng) , 可以獲得由單個噬菌體所繁殖的后代 , 達到分離純化的目的 " 空斑法依賴于病毒 對宿主的感染 , 并不適宜自然水樣總病毒的定量研究。 2.2 透射電子顯微鏡法 (Transmission electron microseopy TEM) TEM法的基本原理為以電子激發(fā)的光子作為光源照射被觀測樣品 ，這種方法 分辨率高 , 可以觀察到細胞的亞顯微結(jié)構(gòu) 【 22】 ; 可以觀察到含有病毒顆粒的細胞 ; 可以觀察到病毒顆粒的形態(tài) , 初步確定病毒的種

16、類 ; 可以測量細胞的大小和體積 , 進而估算細胞碳含量。但TEMt樣品制備方法復(fù)雜，成本高，儀器操作復(fù)雜且耗時 不適合在現(xiàn)場調(diào)查中使用。 2.3 表面熒光顯微鏡法 (Epifluorescence microseop ， EPM) EPM是較常規(guī)的實驗室檢測方法，主要原理是利用特異性熒光染料對樣品 進行染色 , 通過在熒光顯微鏡下觀察特異熒光來計數(shù)細胞數(shù)目。 對于海洋微微型 浮游生物的研究 , 由于聚球藻、 原綠球藻和微微型真核浮游生物自身含有熒光基 團 (PE 和葉綠素 ), 不需染色可直接在熒光顯微鏡下觀察 ; 異養(yǎng)細菌和浮游病毒 由于不含色素,需要染色后進行觀察。與TEM&相

17、比,EPM法樣品制備過程簡單, 儀器操作和樣品觀察簡單 , 但在浮游病毒的計數(shù)中 , 個體較大的病毒和個體較小 的細菌不易區(qū)分。 2.4 流式細胞儀法 (Flow Cytometry,FCM) 流式細胞儀是集現(xiàn)代物理電子技術(shù)、 激光技術(shù)、 計算機技術(shù)于一體的科學(xué)技 術(shù)設(shè)備 , 是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中先進的儀器之一。通過流式細胞儀可以對處于快 速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、 多參數(shù)、 快速的定性、 定量 分析或分選。Olson等于1985年首次將FCMK裝在科考船上進行樣品的現(xiàn)場檢 測 【23】。 相對于前面介紹的幾種方法 , 流式細胞儀在海洋微微型浮游生物研究方面 有很

18、大的優(yōu)點 , 它可以自動、快速的對細胞進行多參數(shù)測量 , 獲得細胞的熒光性 質(zhì)、 散射光性質(zhì) , 以及樣品細胞豐度等多種信息 , 近年來已被廣泛應(yīng)用于海洋生態(tài) 調(diào)查中。 但是 , 流式細胞儀也存在一定缺點 , 如儀器價格較昂貴， 對儀器的操作需 要豐富經(jīng)驗 , 每次檢測樣品之前都要對儀器進行校正。 3. 微微型浮游生物多樣性常用分子技術(shù)研究方法 由于海洋微微型浮游生物種類繁多， 個體微小， 且常常不同種類間缺乏明顯 的形態(tài)區(qū)別，故難以用傳統(tǒng)的方法來研究其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和種類組成。直至 21 世紀， 各種分子生物技術(shù)的應(yīng)用， 極大推動了微微型浮游生物多樣性的研究。 以 下對目前國內(nèi)外常

19、用的研究微微型浮游生物多樣性的分子生物學(xué)技術(shù)以及其優(yōu) 缺點進行了歸納總結(jié)。 3.1 構(gòu)建克隆文庫 構(gòu)建克隆文庫是研究微微型真核生物分子多樣性的傳統(tǒng)方法【 24】 。其優(yōu)點 為步驟簡單 , 不需要使用特殊儀器 , 并且避免了一些分子標記技術(shù)的技術(shù)限制。 Takishita 等【 25】 運用構(gòu)建克隆文庫技術(shù)對海底淤泥樣品進行了微微型真核生 物多樣性研究。 Zuendorf 等【 26】對丹麥瑪麗艾厄海峽樣品進行克隆文庫的構(gòu) 建 , 對隨機選取的 400 個克隆進行測序 , 最后獲得 70 個屬于不同種類微微型真 核生物的OTUs這些研究均獲得了豐富的微微型真核生物多樣性。這表明 ，克

20、隆 文庫構(gòu)建方法適合用于微微型真核生物分子多樣性研究 , 利用該方法能夠獲得對 環(huán)境樣品中真核生物多樣性的客觀認識。但是 , 構(gòu)建克隆文庫直接測序耗時且花 費較大，并且和其他基于 DNA分析分子多樣性的技術(shù)一樣，存在另一個弊端，即 僅通過DNAff列分析無法區(qū)分獲得的序列所代表的細胞是否真實存在,如對海底 沉積物樣品進行研究 , 時常獲得實際并不生活在淤泥中的硅藻類 , 其死亡細胞由 于沉降作用而存在與淤泥中。 Stoeck 等設(shè)計了 1 個避免此類誤差的方法 , 他們通 過對同一環(huán)境樣品同時構(gòu)建rDNA文庫和cDNA文庫的方法區(qū)別死亡細胞和真實 存在的細胞。這一技術(shù)給微微型真核生物分

21、子多樣性研究提供了新途徑【 27】 。 3.2 變性梯度凝膠電泳 /溫度梯度凝膠電泳 (DGGE/ TGG)E DGGE/ TGG的法的原理是：通過在電泳過程中人為造成變性劑濃度梯度或 溫度梯度,使得長度相同而堿基序列不同的 DNA片段由于解鏈特性的差異而得 以分離，甚至是僅有單一堿基差異的DNA片段也能利用該方法得到有效分離。在 DGGE/TGG由法中,為確保DNAt段不完全變性,需要在引物一端加上一段 GC夾 子.DGGE方法已運用于地中海，紅海，南極等海域的微微型真核生物多樣性研究 ， 是該領(lǐng)域研究中的常用方法之一 128-29,0然而，由于利用DGGE和TGGE對環(huán)境樣 品進行

22、微微型真核生物分子多樣性研究時 ,PCR 擴增模板是不同種類基因組的混 合物，故而DGGE/ TGG由法仍會無可避免地產(chǎn)生一些鷹像。例如，異源結(jié)合現(xiàn) 象(Heteroduplex formation),即非同源DN明段相結(jié)合，從而在電泳過程中產(chǎn)生 特異條帶，但該條帶并不是多樣性的真實體現(xiàn)；不同種類真核生物DNA片段的共 遷移現(xiàn)象；以及同一 DNAt段由于存在多個解鏈區(qū)域而造成相同片段產(chǎn)生不同條 帶的結(jié)果.但是,其中部分鷹像可以通過對 DGGE獲得片段切膠后再次擴增得。 3.3 多聚酶鏈式反應(yīng) - 限制性片段長度多態(tài)性 / 末端限制性片段長 度多態(tài)性 ( PCR-RFLP ; T-RFLP

23、) PCR-RFL限術(shù)是研究微微型真核生物多樣性最早使用的分子生物學(xué)方法之 一，其原理是利用不同 DNA片段中特定限制性內(nèi)切酶酶切位點的不同而將其區(qū) 分開。 RFLP 技術(shù)由于簡單易行 , 且不需要特殊儀器 , 故而是微微型真核生物多樣 性研究中使用 最頻繁的方法之一 1301 o 2001年,D 1 e”對地中海、南極水域、北 大西洋等海域環(huán)境樣品構(gòu)建克隆文庫并進行 RFLP分析。此后,該方法被廣泛運用 于不同海域的微微型真核生物多樣性研究 【 31】 。 T-RFLP技術(shù)基于RFLPW形成,其流程是：用5端帶有熒光標記的引 物對總 DNA進行擴增；對PCR產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶酶切，

24、用DNA測序儀對末端帶有熒 光標記的限制性酶切片段進行分離和檢測。 不同的熒光片段可以認為是不同微微 型真核生物種類 T-RFLP 技術(shù)的優(yōu)點是可以快速大批量地對樣品進行多樣性分 析 , 并且可在分子層面上研究微生物群落結(jié)構(gòu)隨時間和空間的豐度變化和分布情 況。Count-way等同時運用構(gòu)建克隆文庫和T - RFLP技術(shù)對北大西洋西部環(huán)境 樣品進行以18SrDNA為靶標基因的微微型真核生物分子多樣性分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 32】 。 T- RFLP 方法豐富 , 但是 ,T- T- RFLP#術(shù)的缺點主要在于需 兩種方法都獲得了豐富的微微型真核生物多樣性 盡管利用克隆文庫構(gòu)建方法獲

25、得的多樣性較 RFL叨法因其可實現(xiàn)快速分析而具有顯著優(yōu)勢。 要使用昂貴的遺傳分析儀。 3.4 熒光原位雜交( FISH) FISH 技術(shù)利用帶有熒光標記的探針與環(huán)境樣品或經(jīng)富集的樣品雜合 , 并在 熒光顯微鏡下成像 , 使研究者得以觀察某一特定細胞類群的形態(tài)學(xué)特征及其在海 洋中的分布和豐度。目前微微型浮游生物研究領(lǐng)域 , 對 FISH 的利用主要集中于 對新發(fā)現(xiàn)的未獲培養(yǎng)的類群(如MASTs等)進行研究 由。Massana等利用構(gòu)建克 隆 文庫技術(shù)對 MASTs 類群 研究發(fā)現(xiàn) ,MASTs 中至少包含 8 個獨立的進化枝。 通過對其中 2 個進化枝進行 FISH 檢測 ,

26、獲得這 2 個類群的形態(tài)資料 , 并進一 步研究得出MASTs類群是重要的細菌捕食者。此后，他們又運用FISH技術(shù)進一 步對MASTs!行研究發(fā)現(xiàn)，MASTs在五大洋中均有分布，屬于自由生活以細菌為 食的異養(yǎng)鞭毛蟲 【34】 。在微微型真核生物研究領(lǐng)域 ,FISH 技術(shù)的運用使得對這些 微小生物進行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化研究成為可能。 然而利用 該技術(shù)必須首先對 目的類群基因序列等背景資料有一定認識 , 才能進行探針設(shè)計和合成。 3.5 宏基因組 宏基因組技術(shù)避免了 PCRT增,通過直接對環(huán)境樣品中提取的 DNA勾建宏基 因組文庫或鳥槍法測序 , 從而對感興趣的微微型真核生物進行不依

27、賴純培養(yǎng)的序 列分析和功能研究。其中常用的克隆載體包括細菌人工染色體 (BAC) , 酵母人工 染色體 (YAC),fosmid 和黏粒。 Massana 【35】 等首次將宏基因組技術(shù)引入微微型真 核生物研究領(lǐng)域， 他們利用采集自地中海西部的布拉內(nèi)斯灣的樣品構(gòu)建了微微型 真核生物的宏基因組 fosmid 文庫 , 獲得了 1 個全長為 35 kb 的克隆 FBB25。 PiganeaJ36］等對馬尾藻海的微微型真核生物進行了宏基因組研究，獲得了 41個 不同的大片段真核生物序列 , 且這些大片段真核生物序列的 GC 含量較高 , 因而 推測不同環(huán)境壓力可能對微微型真核生物堿基組

28、成產(chǎn)生影響。對于多數(shù)種類均 無法培養(yǎng)的微微型真核生物而言 , 宏基因組技術(shù)能夠直接對基因組序列進行分析 從而獲知某一類群生物基因序列信息 , 進一步對其生理生化特征和生態(tài)地位等做 出推測 , 是微微型真核生物研究領(lǐng)域的發(fā)展方向之一。但由于利用該技術(shù)需要較 高的實驗操作水平。 3. 小結(jié) 海洋微微型浮游生物是全球海洋中生物量和生產(chǎn)力的重要貢獻者， 是海洋生 態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)組成部分，對海洋碳泵作用、能量傳遞、微食物環(huán)等具有重要作用。 目前研究微微型浮游生物豐度的方法主要有培養(yǎng)法、 電鏡、表面熒光顯微鏡、流 式細胞儀等方法。而研究其多樣性多使用分子生物學(xué)手段， 方法不一，熟悉其優(yōu) 缺點

29、將有利于選擇合適的方法，減小誤差。我國在微微型浮游生物研究領(lǐng)域起步 較晚，采用研究手段單一，數(shù)據(jù)積累較少，尤其是針對微微型真核生物分子多樣 性的研究。希望本文可以為我國研究微微型浮游生物提供一個技術(shù)理論支持。 參考文獻 【 1】 Azam F, Fenchel T, Field J G, Gray J S, Meyer-Reil L A, Thingstad F. The ecological role of water-column microbes in the sea. Mar Ecol Prog Ser. 1983, 10: 257-263 【 2】焦念志 .海洋微微型生物生態(tài)學(xué)

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