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齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因的克隆及其序列分析,,.,目的,目 錄,1,材料與方法,2,結(jié)果,3,結(jié)論,4,參考文獻,5,致謝,6,.,1 目的,促性腺素受體（GtH-RⅡ）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，其與促性腺激素（GtHⅡ）結(jié)合后可促進卵母細胞的成熟以及在精子發(fā)生的最后幾個時期起主要作用。 魚類中GtHⅡ基因除了在性腺中有豐富的表達外，在非性腺組織中也有少量或微量表達；可是還沒有人對齊口裂腹魚垂體組織中GtH-RⅡ基因進行克隆及序列分析，因此通過完成本次試驗，為進一步研究齊口裂腹魚的繁殖調(diào)控機制提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。,.,2 材料與方法,2.1 試驗材料 　　齊口裂腹魚平均體長為30-40cm； 平均體重為0.5-1.0kg。采集齊口裂腹魚垂體組織樣品，置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩? 2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI上斑馬魚GtH-RⅡ的cDNA序列，選取保守區(qū)序列；上游引物為5′CATCCGTCGAGGACACTTTCGGTA3′，下游引物為5′ACACATAGCATCCGCAAATCACGAG3′，委托華大基因科技有限公司進行特異性引物合成。,.,2.3 方法,,,,,,,,,,,,,引物設(shè)計與合成,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),PCR擴增,PCR產(chǎn)物回收,克隆測序,,序列分析,總RNA提取,,,.,3 結(jié)果,圖1 齊口裂腹魚垂體組織總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳圖,圖2 齊口裂腹魚GtH-R Ⅱ基因PCR電泳檢測圖,3.1 總RNA提取結(jié)果,3.2 RT-PCR產(chǎn)物檢測,.,3.3 GtH-RⅡ核酸序列比對,圖3 齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因cDNA部分編碼核酸序列分析,齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚 齊口裂腹魚 斑馬魚 鯉魚,GtH-RⅡ基因編碼核酸的測序結(jié)果與Genbank上斑馬魚序列進行相似性分析，相似性達93.0%，與鯉魚的相似性為92.6%。,.,3.4 氨基酸相似性分析,GtH-RⅡ基因編碼氨基酸序列的測序結(jié)果與Genbank上斑馬魚的序列進行相似性分析，相似性達97%以上。,,圖4 齊口裂腹魚GtH-RⅡ氨基酸序列及序列分析,,,,,,,,,,,,,,,,,,.,3.5 GtH-RⅡ氨基酸組成分析,亮氨酸（Leu）含量為最高，達到了16.45%，賴氨酸（Lys）含量最低，只有0.87%；其它具體的氨基酸組成類型及酸值見表1。,表1 齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因編碼的氨基酸組成,圖5 齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因編碼的氨基酸組成,,,.,3.6 GtH-RⅡ的氨基酸疏水性分析與抗原決定簇預(yù)測,GtH-R Ⅱ基因編碼的氨基酸疏水性中存在4個疏水區(qū)，分別位于第57、90、132和186氨基酸殘基附近;而氨基酸序列中則存在4個抗原決定簇，分別位于第27、34、112和159氨基酸殘基附近。,圖6 齊口裂腹魚GtH-RⅡ氨基酸的平均疏水性比例,圖7 齊口裂腹魚GtH-RⅡ蛋白抗原決定簇預(yù)測,,,,,,,,,.,3.7 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,圖8 齊口裂腹魚GtH-RⅡ蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 h表示α螺旋；e表示β折疊；c表示無規(guī)則卷曲,,β折疊占15.24%,α螺旋占61.43%,無規(guī)則卷曲占23.33%,,,.,3.8 蛋白質(zhì)磷酸化位點分析,由上圖可知，GtH-RⅡ蛋白中含有4個磷酸化位點，全是Ser（Serine絲氨酸）位點有4個，沒有Thr（threonine蘇氨酸）、Tyr（tyrosine酪氨酸）。,圖9 齊口裂腹魚LHR蛋白磷酸化位點預(yù)測,,,,.,4 結(jié)論,此次試驗得到的結(jié)果顯示：獲得的齊口腹裂魚GtH-RⅡ基因的長度為696 bp；與斑馬魚的序列相似性較高，表明同源性較近，其基因具有較高的保守性。 　　　對氨基酸和蛋白質(zhì)分析顯示：α螺旋占的比例大，存在4個抗原決定簇和4個疏水區(qū)；說明GtH-RⅡ蛋白柔性好，是油溶性受體蛋白的可能性強。 　　 最后得出齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因的保守性高，同時也為進一步研究齊口裂腹魚的繁殖調(diào)控機制提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而具體的調(diào)控機制則有待進一步的研究。,.,5 參考文獻,[1] Kraak GVD, Suzuki K, Peter RE, et al. 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