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外文翻譯 題目1：如何使用活性碳纖維陰極（電芬頓技術(shù)） 從實(shí)際印染廢水去除COD 題目2：一個(gè)完整的印染廢水處理系統(tǒng)中 微生物群落的演變研究 外文翻譯之二 一個(gè)完整的印染廢水處理系統(tǒng)中微生物群落的演變研究 作者：楊慶祥，王佳，王洪濤，陳軒宇，任思維，李雪玲 國(guó)籍：中國(guó) 出處：生物資源技術(shù) 摘要：這項(xiàng)研究中，在完整的印染廢水處理系統(tǒng)的兩個(gè)階段的生物過(guò)程中，用植入和分子生物技術(shù)來(lái)跟蹤細(xì)菌、真菌和古生菌種群動(dòng)力學(xué)特征。枚舉結(jié)果表明，在這個(gè)系統(tǒng)中，細(xì)菌是優(yōu)勢(shì)種群。在所有處理單元中，特別是在從第二階段的生物樣品處理過(guò)程中，真菌對(duì)于細(xì)菌的比例在減少，而古生菌對(duì)細(xì)菌的比例有著明顯的增長(zhǎng)。PCR-變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析表明，64.6％的細(xì)菌，57.6％的真菌和38.2％的古生菌種群在系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中一直存留在初生污泥中，且微生物多樣性隨著系統(tǒng)運(yùn)行而不斷增長(zhǎng)。盡管在進(jìn)水時(shí)微生物群落和組成不斷變化，但某些細(xì)菌的種群，如陶厄氏菌和黃色單胞菌同時(shí)出現(xiàn)在所有收集到的樣本中。 1. 介紹 在中國(guó)，多種含染料的廢水構(gòu)成了幾乎近30%的工業(yè)廢水，其中印染廢水（PDW）是最重要的廢水之一。印染廢水有BOD5/COD（5天生化需氧量/化學(xué)需氧量，20％左右）比率低，PH高（10-13），含有毒性，水質(zhì)變化大和生物難降解物質(zhì)（如染料和染料助劑：聚乙烯醇，PVA）的特性。雖然在中國(guó)，對(duì)污水的處理工藝是一種結(jié)合物理，化學(xué)和生物的過(guò)程，但是生物過(guò)程卻發(fā)揮了核心作用，并且能去除40％-50％的COD和50％-60％的色度。但是，在系統(tǒng)開(kāi)始或者系統(tǒng)運(yùn)行期間會(huì)出現(xiàn)重要的問(wèn)題，如活性污泥濃度的降低，污泥膨脹和大量泡沫的產(chǎn)生經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致處理效率的大大降低或者系統(tǒng)的崩潰。 在大多數(shù)工業(yè)廢水處理廠，接種污泥在一個(gè)特定的階段，通常會(huì)從市政污水處理廠被收集起來(lái)作為接種物。這種污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)通過(guò)適應(yīng)新的污水環(huán)境中需要經(jīng)歷很大的變化，有時(shí)候會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)啟動(dòng)的失敗。假設(shè)優(yōu)勢(shì)微生物在系統(tǒng)的每個(gè)階段扮演著重要的角色，同時(shí)說(shuō)明了優(yōu)勢(shì)微生物在系統(tǒng)運(yùn)行中生物處理過(guò)程的組成和它們的演變很有可能幫助理解和解決上述問(wèn)題。許多先前關(guān)于微生物群落動(dòng)態(tài)的研究側(cè)重于功能和群落之間的關(guān)系穩(wěn)定或者關(guān)于環(huán)境條件對(duì)生物群落結(jié)構(gòu)的的影響，通常是在能夠處理合成廢水的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模條件下的生物反應(yīng)器。我們以往在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器中研究擴(kuò)大堿性細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)處理真正的印染廢水處理影響，表明在沒(méi)有影響處理效率的過(guò)程中微生物群落經(jīng)歷了巨大的變化，同時(shí)極少的那些從富集接種培養(yǎng)物中分離出來(lái)細(xì)菌種群可以在穩(wěn)定運(yùn)行的生物反應(yīng)器中被檢測(cè)到。然而，國(guó)內(nèi)只有少數(shù)研究報(bào)告是關(guān)于微生物群落在大規(guī)模工業(yè)廢水處理系統(tǒng)種的動(dòng)態(tài)，尤其在完整的印染廢水處理系統(tǒng)從接種污泥到穩(wěn)定運(yùn)行的污泥中存在著的微生物群落的進(jìn)化。針對(duì)印染廢水水質(zhì)變化快特性和復(fù)雜的組合成分，它更重要的是印染廢水處理系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和操作以便了解微生物群落動(dòng)態(tài)變化及系統(tǒng)啟動(dòng)和穩(wěn)定運(yùn)行之間的關(guān)系。 這項(xiàng)研究中，在一個(gè)全面的PDW生物處理系統(tǒng)的建立和調(diào)試期間將運(yùn)用PCR-DGGE和rRNA基因測(cè)序方法，跟蹤三種類型的微生物（細(xì)菌，真菌和古生菌）的進(jìn)化過(guò)程。關(guān)于微生物種群在廢水處理系統(tǒng)中的功能的研究結(jié)果將形成進(jìn)一步研究基礎(chǔ)。 2. 方法 2.1 廢水特性和處理系統(tǒng) 用一開(kāi)始確定的處理系統(tǒng)處理新鄉(xiāng)聯(lián)達(dá)印染有限公司的廢水且連續(xù)監(jiān)測(cè)一年半以上其印染廢水的特性和生物處理系統(tǒng)的性能。用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定COD，BOD5的濃度，色度，懸浮固體（SS），總氮（TN），總磷酸鹽（TP），NH4+-N和pH值。該公司每天排放500噸的混合廢水，水的顏色經(jīng)常從棕色變成深藍(lán)色，綠色，灰色，最后變成黑色。廢水的特性列于表1。 該廢水處理系統(tǒng)于2009年的10月設(shè)立。該系統(tǒng)由混凝沉淀池，兩段式生物處理工藝包括過(guò)程1（厭氧水解酸化單元（H1），好氧活性污泥處理單元（O1）和沉降槽1）和過(guò)程2（厭氧水解酸化單元（H2），好氧生物接觸氧化單元（O2）和沉降槽2）組成，如圖1所示。在系統(tǒng)啟動(dòng)階段，市政污水處理廠被收集到的活性污泥接種到O1以獲得最終的SS濃度為4-5g/l 。經(jīng)過(guò)約一個(gè)星期的低曝氣，O1操作如表2中所示。該沉淀池的污泥回流到H1。在O1單元接種1000升的混合脫色酵母的23天后H2開(kāi)始啟動(dòng)，我們先前了解和研究的沉淀池1的污泥和市政污水處理廠的污泥的那部分正為O1。從23日到29日，O2在低氧曝氣的條件下進(jìn)行操作，同時(shí)從H2富集的污泥在這里形成生物膜。在啟動(dòng)之后，整個(gè)系統(tǒng)在如表2所示的條件下操作。 圖1 PDW處理過(guò)程的流程圖 （H1，厭氧水解單元; O1酸化，好氧活性污泥單元; H2，厭氧水解酸化單元，O2，好氧生物接觸氧化單元） 2.2 污泥樣品 從以上的生物處理單元且在不同的操作時(shí)期收集污泥樣本，即，接種污泥（第1天和23天，分別為O1和H2），系統(tǒng)啟動(dòng)后（第23天為O1和H1；第29天為O2），并在此中間操作（第29天，185天為O1和H1；185天為O2和H2）。將一小部分樣品放在無(wú)菌的聚丙烯試管中，同時(shí)用生物枚舉法立刻進(jìn)行處理。其他部分進(jìn)行分子分析，即，樣品從不同的處理槽，在4°C條件下以12000rpm離心10分鐘。將沉淀物用磷酸鹽緩沖液（pH=7）洗滌兩次（每在12000 rpm下離心10分鐘），并儲(chǔ)存在20℃用于分子分析。 2.3 DNA抽取 通過(guò)十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法從污泥顆粒中提取總的DNA。得到的天然或者純化的殘缺的DNA在溴化乙錠（EB）染色后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳（1％w /v瓊脂糖）和紫外線透視來(lái)鑒定。純化后的DNA被存儲(chǔ)在20℃的條件下以便進(jìn)行PCR–DGGE分析。 2.4 微生物種群量化 用植入和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)不同的微生物種群進(jìn)行計(jì)量。通過(guò)枚舉法，細(xì)菌和真菌的濃度取決于改進(jìn)后對(duì)肉蛋白胨瓊脂和馬丁瓊脂平板的稀釋技術(shù)。所有瓊脂板在室溫下培養(yǎng)。細(xì)菌在1-2天后，真菌在3-5天后，計(jì)算板上數(shù)量。各組的微生物菌落的數(shù)量取決于同一水平上的三次重復(fù)測(cè)量。 細(xì)菌，真菌和古生菌的種群通過(guò)引物使用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)被計(jì)數(shù)量化，338f (5’-CCTACGGGAGGCAGCAG)和518r (5’-ATTACCGCGGCTGCTGG)是細(xì)菌的序列；FF390(5’-CGATAACGAACGAGACCT) 和 FR1(5’-AICCATTCAATCGGTAIT) 是真菌的序列；344f(5’-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA)和519r (5’-TTACCGCGGCGGCKGCTG)是古生菌的序列。該P(yáng)CR技術(shù)在95℃的條件下運(yùn)行30s，40個(gè)變性的循環(huán)（94℃，5s），熱處理（34s：細(xì)菌，63℃；真菌，60℃；古生菌，65℃）和從60℃-95℃每0.5℃讀取板上的一個(gè)數(shù)據(jù)做熔解曲線分析。實(shí)時(shí)PCR法使用ABI7500Q-PCR儀（美國(guó)）在體積為25微升的條件下進(jìn)行，按照制造商的說(shuō)明用SYBR綠色檢測(cè)系統(tǒng)和SYBR的預(yù)混料EX的Taq?器材進(jìn)行檢測(cè)。放大的16S rRNA和18S rRNA基因?qū)氲酱竽c桿菌DH5-α質(zhì)粒。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)要求用103-108基因拷貝那些稀釋的質(zhì)粒DNA。使用了兩個(gè)熔解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)了這個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。用兩個(gè)獨(dú)立實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)并各自進(jìn)行三個(gè)重復(fù)樣本的試驗(yàn)。通過(guò)繪制的循環(huán)閾值與log10的基因拷貝數(shù)（古鐵雷斯等，2004）產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2.5 PCR-DGGE技術(shù)分析微生物種群 對(duì)于細(xì)菌DGGE分析，16S rRNA基因的V3區(qū)是采用引物338F GC (5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG ACTCC TACGG GAGGC AGCAG 3)和518R (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)在95℃的PCR條件下持續(xù)5分鐘，循環(huán)變性10次（94℃，1分鐘），熱處理（65 ℃，每秒減少1℃，直到55，72 ℃持續(xù)90秒），循環(huán)變性20次（94 ℃持續(xù)1分鐘），熱處理（55℃持續(xù)45秒，72℃持續(xù)90秒），最后直到72℃持續(xù)7分鐘。 對(duì)于真菌種群分析，18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增進(jìn)行使用引物FF390（5’-CGATA ACGAA CGAGA CCT-3）和GC-FR1（50 CCCCC GCCGC GCGCGGCGGG CGGGG，CGGGG，GCACG GGCCG AICCA TTCAA TCGGT AIT-3’），在95℃的PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行8分鐘，30個(gè)變性循環(huán)（95℃持續(xù)30秒），退火（50℃下持續(xù)45秒，72 ℃持續(xù)120秒），同時(shí)在72℃條件下持續(xù)10分鐘。 對(duì)于的古生菌群落分析，它的16S rRNA通用引物ARC344F-GC為：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC GGG GYG CAG CAG GCG CGA-3’和519r：5’-GWA TTA CCG CGG CKG CTG-3’下在94℃的PCR條件下進(jìn)行5分鐘，10個(gè)變性循環(huán)（94℃，30秒），退火（61℃持續(xù)30秒，每?jī)蓚€(gè)循環(huán)中降低1℃，直到51℃，72℃持續(xù)30秒），20個(gè)變性循環(huán)（94℃，30秒），退火（56持續(xù)30秒，72持續(xù)30秒），72℃下進(jìn)行30分鐘。 上述細(xì)菌，真菌和古細(xì)菌的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接用于DGGE分析。DGGE將如前所述使用一個(gè)D-代碼的通用突變系統(tǒng)和變性梯度為35-60％的細(xì)菌和古細(xì)菌及20-50％為真菌。DGGE圖譜通過(guò)使用4.6.2軟件（Bio-Rad公司實(shí)驗(yàn)室）來(lái)進(jìn)行分析。每一個(gè)頻段的存在或不存在在每個(gè)泳道的凝膠為基礎(chǔ)，構(gòu)建一個(gè)二進(jìn)制矩陣成對(duì)骰子距離矩陣進(jìn)行計(jì)算的。通過(guò)加權(quán)配對(duì)組，得到了一個(gè)關(guān)于平均（UPGMA）聚類分析的樹(shù)狀圖。Shannon多樣性指數(shù)（H0）被引入用來(lái)分析如前所述細(xì)菌群落多樣性（物種豐富度）。在多樣性指數(shù)中，譜帶強(qiáng)度相對(duì)于骰子索引的相似性，更值得被考慮。每個(gè)頻段所指示的單一物種和譜帶強(qiáng)度被認(rèn)為是物種豐富度。該指數(shù)計(jì)算公式如下： （n/N） 其中ni/ N是通過(guò)物種來(lái)確定的種群的比例（明亮譜帶、譜帶總亮度）。而多樣性指數(shù)受物種數(shù)和物種豐富度所影響。 DGGE凝膠上切下的主要頻段，并克隆到大腸桿菌質(zhì)粒上并按照PMD18-T克隆試劑盒（上海生工生物技術(shù)有限公司，上海，中國(guó)）上制造商的要求進(jìn)行測(cè)試。序列分析中包括的BLAST搜索證明最近在數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的相關(guān)物種。通過(guò)MEGA版4.1使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 2.6 添加核苷酸序列 細(xì)菌和古細(xì)菌的核苷酸序列至少超過(guò)200條，并可能不會(huì)被提交到基因庫(kù)中。真菌在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列號(hào)為JN371150到JN371169。 3.結(jié)果與討論 3.1 PDW 處理系統(tǒng)的性能 COD濃度和PDW的色度分別在646–5056mg/l和80–650倍之間波動(dòng)。在使用硫酸亞鐵和聚氯化鋁（PAC）進(jìn)行混凝沉淀后，COD和色度分別降低到417-3750mg/l和40-550倍，同時(shí)平均去除率為43.9％和38.5％。在同一時(shí)間，PDW的pH值明顯降低，從10.96-13.89達(dá)到了8.50左右，這是后續(xù)的生物處理所必要的條件。 PDW以水質(zhì)組成經(jīng)常變化為特點(diǎn)。在檢測(cè)期間，進(jìn)水的顏色范圍從黑色，深藍(lán)色，深綠色，褐色，深紫色，深紅色到玫瑰紅色，因此COD會(huì)有波動(dòng)。混凝后，雖然COD和色度有不同程度降低，但是處理后的廢水的顏色比先前的進(jìn)水僅有了少許的清晰。廢水經(jīng)過(guò)第一級(jí)生物處理過(guò)程同時(shí)結(jié)果示于補(bǔ)充圖1。通過(guò)這個(gè)處理過(guò)程，COD濃度和色度分別降至174-902mg/l和稀釋30-80倍，脫除效率分別為25-83.4％和25-89.1％。綠色是最難脫色的，而黑色和藍(lán)色比較容易脫色。雖然進(jìn)水的COD濃度到達(dá)2000多mg/l，在某些時(shí)期，在第一階段的生物處理工藝有使COD濃度小于800mg/l的去除效率。高COD進(jìn)水濃度是最有可能由于混凝不足或PDW高濃度的原料輸入到系統(tǒng)中，因此水力停留時(shí)間為24小時(shí)（ O1 ）似乎是不夠的。然而，即使在低濃度的進(jìn)水條件下，污水通過(guò)這個(gè)處理過(guò)程中仍含有174-500mg/l的COD濃度，這是由生物頑抗那些使用普通的活性污泥卻難以降解的物質(zhì)存在。 第一階段的生物處理工藝處理后的廢水被送入第二階段由生物過(guò)程組成的水解池和生物接觸氧化池作進(jìn)一步處理（補(bǔ)充圖2）。這個(gè)過(guò)程中，通過(guò)10.8-53.9％COD的去除率和25-66.7％色度的去除率，最終達(dá)到COD<500毫克每升和色度<40倍的指標(biāo)。第二階段生物過(guò)程對(duì)COD和色度有明顯的去除效果，因此出水看起來(lái)比進(jìn)水更清晰，尤其是那些高濃度的進(jìn)水（COD>200mg/l）。混凝和兩個(gè)階段的生物過(guò)程的總處理效率將總結(jié)在表3中。COD和色度的平均去除率達(dá)到了85％。最終出水的色度滿足當(dāng)?shù)嘏欧艠?biāo)準(zhǔn)（<50倍稀釋）。然而，剩余的COD（146-492mg/l）需要更深度的處理。因此，不同的方法，如混凝，預(yù)氧化處理和O3氧化需在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比較。結(jié)果表明，芬頓氧化有最好的效果并且在pH值為4.0時(shí)，通過(guò)添加150mg/l硫酸亞鐵和0.8l/l過(guò)氧化氫最終使COD從490mg/l減少到<100mg/l。 3.2 不同微生物種群在操作系統(tǒng)中的濃度變化 微生物種群的濃度將使用接種和獨(dú)立培養(yǎng)（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）的方法。培養(yǎng)結(jié)果表明，在所有收集到的樣本上異養(yǎng)細(xì)菌，放線菌和真菌分別達(dá)到每克干污泥有2.01*109-8.86*109CFU，2.54*108-4.4*1010CFU和1.87* 105-6.36*106個(gè)菌落。在所有系統(tǒng)操作進(jìn)行處理后，真菌比例對(duì)于細(xì)菌總數(shù)有明顯下降，例如，在185天內(nèi)，從O1的種子污泥1:1.72*103（O1-1）下降到1:1.96* 105（圖2a）。古生菌不通過(guò)接種計(jì)數(shù)。 圖2 在不同的的PDW處理系統(tǒng)運(yùn)行階段中枚舉的微生物種群 （A，栽培的結(jié)果； B，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，黑色方格：細(xì)菌；白色方格：真菌；條紋方格：古生菌。樣品分別以處理單元和采樣時(shí)間命名。樣品O1-1和H2-23分別對(duì)應(yīng)種子污泥在O1和H2 1日和23日操作，分別O1-23和O2-29，O1和O2啟動(dòng)后，分別O1-29，O1-185，H1-29，H1-185，O2-185和H2-185，中間階段的系統(tǒng)運(yùn)行） 這個(gè)培養(yǎng)的方法提供了一個(gè)直觀的計(jì)算結(jié)果。然而，由于大部分微生物無(wú)法培養(yǎng)的特性，分子生物學(xué)方法（實(shí)時(shí)PCR）的運(yùn)用通過(guò)操作PDW處理系統(tǒng)來(lái)確認(rèn)微生物群落結(jié)構(gòu)的演變趨勢(shì)。實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果表明，隨著細(xì)菌和真菌的異常，系統(tǒng)隱藏著大量的古生菌。在收集到的樣品中，三種微生物：細(xì)菌，古細(xì)菌和真菌濃度分別為1.29 *1011- 1.16 * 1016個(gè)，5.52*107-2.05*1013個(gè)和5.10*107-3.67 *1010個(gè)每克干污泥，這是遠(yuǎn)高于圖2b中得到的培養(yǎng)結(jié)果 。雖然在培養(yǎng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果之間有差異，微生物種群變化趨勢(shì)是類似的。在運(yùn)行的系統(tǒng)中，真菌和古細(xì)菌種群變化正好相反，真菌的比率顯著減少而細(xì)菌和古生菌的比例增加（如圖所示在表4中）。 最近的研究表明，真菌（含酵母菌）利于染料降解和脫色。但是，在PDW處理系統(tǒng)全過(guò)程中，真菌在初生污泥中并沒(méi)有生存得更好。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明：真菌數(shù)量比率很大（真菌：細(xì)菌，1:8.6*102），同時(shí)大于在接種污泥O1（O1-1）中的古生菌，雖然它們的數(shù)量比細(xì)菌要少。然而，符合的培養(yǎng)結(jié)果，在系統(tǒng)操作下，真菌在所有的處理單元的比例減少，所以可知真菌在PDW環(huán)境頻繁變動(dòng)的條件下無(wú)法適應(yīng)。在能夠生長(zhǎng)得更好的前提下，將培養(yǎng)的脫色酵母接種到H2，通過(guò)其和活性污泥一起在廠房和沉淀池O1處理市政污水，我們將假設(shè)真菌在大多數(shù)COD在活性污泥中通過(guò)微生物去除后。相比于O1-1（初生污泥O1，1:860 ）和O1 -23（部分初生污泥H2，1:1.38 *107），真菌在H2（H2-23，真菌接種污泥細(xì)菌，1:470）的初生污泥中的比例極大地增長(zhǎng)。然而，這個(gè)比例大幅降低至1:1.8*104，在采樣185天時(shí)（ H2-185）。O2單元流入的混合廢水和H2的活性污泥，表示在圖1。在系統(tǒng)啟動(dòng)后29天（O2- 29，真菌：細(xì)菌，1:32），在O2的合成填料有利于真菌存活在當(dāng)真菌細(xì)菌比例很高的條件下。不幸的是，這個(gè)比例可能不會(huì)一直持續(xù)這一水平當(dāng)系統(tǒng)運(yùn)行到比例高達(dá)1:1.0* 103在185天后（O2 -185）。在污水處理系統(tǒng)中維持真菌比例是這一領(lǐng)域中主要的應(yīng)用難題。即使我們?cè)诿撋湍妇械膽?yīng)用，甚至在實(shí)驗(yàn)室中試驗(yàn)紡織廢水處理系統(tǒng)，已經(jīng)取得了一些成功，但是這仍然是一個(gè)將真菌運(yùn)用在所有污染廢水處理器中的主要挑戰(zhàn)。 對(duì)比真菌數(shù)量，古細(xì)菌在O1（O1-1，古細(xì)菌，1:3.6*105）的初生污泥中的微生物群落中的濃度很小。然而，這個(gè)比例迅速增加。在23日，古生菌的濃度超過(guò)真菌同時(shí)增加至1:1.2* 103（O1-23，古生菌）后維持在該水平上。更多有趣的是，第二階段的生物處理過(guò)程中似乎更有利于古生菌增長(zhǎng)。隨著系統(tǒng)的運(yùn)行，在185天（O2-185，古細(xì)菌，1:0.58）O2種古生菌種群的濃度顯著增加甚至超過(guò)細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)種群。 古生菌種群已被廣泛研究，如厭氧污泥床反應(yīng)器處理啤酒廠的環(huán)境廢水，綿羊瘤胃，海洋沉積物，并且他們的已證實(shí)在農(nóng)業(yè)沼氣主導(dǎo)地位植物采用實(shí)時(shí)PCR和FISH（熒光原位雜交）。古生菌的檢測(cè)和定量在好氧廢水處理系統(tǒng)中對(duì)污染物的降解能力是非常罕見(jiàn)的。古生菌的大量存在在PDW處理系統(tǒng)的這項(xiàng)研究中，特別是正常的活性污泥處理后，古生菌很有可能在降解生物頑抗物質(zhì)扮演起重要的角色。 3.3 系統(tǒng)操作體系中的微生物多樣性的動(dòng)態(tài)變化 細(xì)菌的PCR-DGGE指紋圖譜（圖3），對(duì)古細(xì)菌和真菌種群收集到的樣本進(jìn)行了Shannon多樣性指數(shù)（H0）分析。系統(tǒng)顯示出的三個(gè)微生物種群的多樣性差異，同時(shí)細(xì)菌具有最高的多樣性（H’ = 1.02-1.37），之后才是古細(xì)菌（H0 = 0.59-1.30）和真菌（H0 = 0.78-1.17）。相比于其他研究，這個(gè)系統(tǒng)中的細(xì)菌群落是多樣的。多樣性指數(shù)高于（平均0.82）膜生物反應(yīng)器處理的美國(guó)海軍船舶的灰水，并接近膜生物反應(yīng)器處理的市政污水（1.3-1.6）。在這項(xiàng)研究中，細(xì)菌的多樣性明顯高于古細(xì)菌和真菌。在厭氧反應(yīng)器的細(xì)菌多樣性被認(rèn)為是大于古細(xì)菌的多樣性。通過(guò)復(fù)雜的供應(yīng)材料，這可能反映細(xì)菌代謝的靈活性和可用基質(zhì)的范圍。然而，一些最近的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了一些重要的問(wèn)題，例如，尚未被培養(yǎng)的古細(xì)菌的巨大多樣性，先前無(wú)法預(yù)測(cè)的能量代謝（例如，化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)），以及未知的占主導(dǎo)地位的古生菌群落在原核生物的非重讀環(huán)境，如在土壤中的氨氧化。 如圖3所示，可以看出，在操作條件和PDW環(huán)境適宜的條件下，微生物群落系統(tǒng)在四個(gè)構(gòu)筑物里經(jīng)歷了顯著的變化。一般情況下，隨著系統(tǒng)的運(yùn)行，細(xì)菌和古生菌的可見(jiàn)光波段在所有構(gòu)筑物中都增加，這是違背了真菌種群變化趨勢(shì)。UPFMA分析是基于細(xì)菌DGGE條帶的存在及其強(qiáng)度（示于表5）形成的，表明了樣本在O1的第一天（O1-1）和第23天（O1-23）的相似性為64.6％，這表明在系統(tǒng)啟動(dòng)之后將有超過(guò)一半的細(xì)菌群落仍能生存。 在這項(xiàng)研究的處理系統(tǒng)中，初生污泥中的持久性是遠(yuǎn)高于我們先前在實(shí)驗(yàn)室利用豐富的堿細(xì)菌培養(yǎng)作為種子接種生物反應(yīng)器的研究（分別為16.7％和36.4％，種子培養(yǎng)和樣品之間的相似性，從15天的操作得出）得出的結(jié)果。這表明，在活性污泥的處理系統(tǒng)中細(xì)菌比富含培養(yǎng)液的細(xì)菌更持久。在系統(tǒng)運(yùn)行中，細(xì)菌群落在一個(gè)獨(dú)立的處理單元中是在不斷進(jìn)化的體現(xiàn)，通過(guò)在運(yùn)行期間減少收集樣本的相似性（47.7-63.8％）。如上所述，色度，COD和PDW的混合物即使在一天內(nèi)也會(huì)頻繁的改變，這可能是驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落變化的因素之一。以往的研究也表明在實(shí)驗(yàn)室的生物反應(yīng)器中，細(xì)菌群落高度可變，即使在性能穩(wěn)定試點(diǎn)規(guī)模的反應(yīng)器。 相比細(xì)菌，真菌種群在系統(tǒng)運(yùn)行中有著更大的變化。雖然42.6-61％的真菌群落在系統(tǒng)啟動(dòng)后的每個(gè)處理單元的活性污泥中都有著持續(xù)性，當(dāng)系統(tǒng)運(yùn)行單位達(dá)在每個(gè)獨(dú)立的處理單元在不同的操作環(huán)境下達(dá)到17.7％到50.6％之間時(shí)是它們的相似性不斷地降低，如（表5）。 相較于細(xì)菌和真菌，古生菌之間的相似處在每個(gè)處理池的樣品中最低，在系統(tǒng)分別啟動(dòng)O1和O2后，群落在38.2％-42％的范圍內(nèi)波動(dòng)和維持。 綜上所述，在本研究中，當(dāng)系統(tǒng)啟動(dòng)，細(xì)菌和真菌在這個(gè)處理池中比古生菌更持久（前三周）。在系統(tǒng)運(yùn)行和進(jìn)水起伏不定時(shí)，細(xì)菌種群比真菌和古細(xì)菌更穩(wěn)定。幾項(xiàng)調(diào)查研究原核生物的多樣性的轉(zhuǎn)變，取決于廢水的成分或不同的反應(yīng)器發(fā)生的操作條件。一些證據(jù)展示了在恒定的操作條件下細(xì)菌進(jìn)化的穩(wěn)定性。事實(shí)上，古生菌群落變化比細(xì)菌少，同時(shí)也被其他研究人員證實(shí)了，它們?cè)诜磻?yīng)器性能上反應(yīng)出來(lái)并且與工藝參數(shù)相關(guān)聯(lián)，如揮發(fā)性脂肪酸（VFAs的）。 雖然當(dāng)系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)微生物群落不斷變化，并且進(jìn)水也有如綜上所述的波動(dòng)，但是通過(guò)第一階段生物處理工藝，COD和色度去除率幾乎相同，甚至在第二階段的生物過(guò)程增加了。這似乎是剛組建或不斷變化的微生物群落都有的相同或更強(qiáng)大對(duì)污染物降解的功能。這是可能是在多樣的進(jìn)化群體之間功能的剩余，同時(shí)在對(duì)反應(yīng)器沒(méi)有影響的前提下使群落改變。考慮到一些微生物物種中未檢測(cè)到DGGE凝膠，當(dāng)其濃度均低于104每克干污泥或PCR過(guò)程可能會(huì)在廢水處理階段抑制一些物質(zhì)，有人推測(cè)存在一個(gè)更高的微生物多樣性在初生污泥，其中一些可能有高PDW處理效率，也有可能被保留在系統(tǒng)中DGGE凝膠，但沒(méi)有檢測(cè)到。在長(zhǎng)期對(duì)PDW的適應(yīng)過(guò)程中，有較高的性能的初生微生物在色度去除率和PDW消減能力上越來(lái)越強(qiáng)大，因此通過(guò)DGGE檢測(cè)出來(lái)。 圖3 在操作條件和PDW環(huán)境適宜的條件下，微生物群落系統(tǒng)的四個(gè)構(gòu)筑物里經(jīng)歷的變化 3.4 在系統(tǒng)操作下的微生物群落系統(tǒng)組合物的動(dòng)態(tài)變化 從DGGE凝膠來(lái)看，共有41組密集的細(xì)菌帶被切除和測(cè)序，在所收集到的樣品中，幾乎所有的細(xì)菌占主導(dǎo)地位。基于對(duì)這些序列的系統(tǒng)物種分析表明，41個(gè)細(xì)菌克隆形成29個(gè)操作分類單元（ OTUS ）分布在不同的系統(tǒng)物種群落，其中包括變形菌，桿菌，梭狀芽胞桿菌，芽孢桿菌，硝化螺，暖繩菌，擬桿菌，酸桿菌（圖4a）。隨著系統(tǒng)的運(yùn)行，樣品中OTU的數(shù)量在所有的處理池中普遍增加，O1-185樣本（18）最高和樣品中H1-29 ，H2-23和O2-29 最低（7）。據(jù)推測(cè)，細(xì)菌在進(jìn)水屬性頻繁改變下，不斷進(jìn)行基因突變，可能在運(yùn)行長(zhǎng)時(shí)間之后已經(jīng)形成新的物種。多樣化的微生物種群增強(qiáng)該系統(tǒng)的處理PDW的能力，并得到了穩(wěn)定的COD和色度的處理效率。 然而，雖然細(xì)菌和進(jìn)水改變，還有一些DGGE圖譜或OTU單板不斷保留在每個(gè)處理池中。例如，有4個(gè)OTU分配給梭菌，索氏菌和黃單胞菌，同時(shí)在O1的所有樣本中被檢測(cè)出來(lái)；3個(gè)OTU分配給硝化螺菌，梭狀芽孢桿菌和索氏菌從H1的樣本中檢測(cè)出來(lái)。這些細(xì)菌種類在污染物退化或維持活性污泥顆粒方面可能會(huì)扮演重要的角色。 在第一階段的生物過(guò)程處理之后，大多數(shù)污染物被耗盡，在第二階段的生物物質(zhì)的過(guò)程中，留下一些生物頑抗物質(zhì)作為食品的微生物。第二階段的過(guò)程中有比第一階段顯著更少的但更穩(wěn)定的細(xì)菌（6個(gè)OTU在H2和5個(gè)OTU在O2），這表明殘余頑抗的物質(zhì)更穩(wěn)定，同時(shí)少量的細(xì)菌種類屬于綠菌和暖繩菌，索氏菌， 黃單胞菌和類桿菌，能在廢水環(huán)境中進(jìn)一步利用這些物質(zhì)。該殘余頑抗物質(zhì)需要進(jìn)一步分析。兩種細(xì)菌屬于索氏菌（通過(guò)DGGE膠帶12）和黃單胞菌（頻帶1所示）分別為所有收集到的樣品中檢測(cè)到的，這意味著無(wú)論系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)間和頻繁變化的進(jìn)水這些物種在PDW凈化中扮演著重要角色。 從真菌DGGE凝膠檢索測(cè)序到總共20個(gè)波段，所示在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建圖4b上。幾乎所有的序列都不能被鑒定出，<95％的序列有著未知的克隆。20個(gè)序列中的8條包括了最密集的條帶如10，11，12和13，它們都不是真菌，但類似于某些原蟲(chóng)，這意味著使用的引物沒(méi)有嚴(yán)格的特定。其他序列被分配到兩個(gè)真菌群體，門(mén)壺菌門(mén)和接合菌。在第二階段的一些酵母接種之后從這個(gè)運(yùn)行的PDW處理系統(tǒng)隔離出去，其中一些已確定具有高色度去除效率（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，這里沒(méi)有發(fā)現(xiàn)酵母。對(duì)真菌種群在PDW系統(tǒng)的進(jìn)一步研究正在使用其他方法并且正在進(jìn)行中。共28個(gè)克隆取自古生菌的DGGE凝膠進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，如圖所示圖4（c）。所有古生菌的克隆被分配到廣古菌和泉古菌，其中大部分只群集一些未知的物種或克隆。 28個(gè)克隆形成16OTU單板且在一個(gè)OTU內(nèi)只有1-2個(gè)堿基差異。古生菌OTU的數(shù)量在第二階段的生物處理工藝超過(guò)在第一階段的古生菌OTU的數(shù)量，并且和結(jié)果相對(duì)應(yīng)。隨著系統(tǒng)的運(yùn)行，古細(xì)菌OTU的數(shù)量在第一階段的生物處理過(guò)程中下降，在處理槽之內(nèi)的樣品只共享一個(gè)OTU，而所述OTU數(shù)量在第二階段的生物處理過(guò)程中顯著增加，與樣品共享3-4個(gè)OTU。這些結(jié)果表明，在第二階段的生物處理過(guò)程中，類似細(xì)菌，古細(xì)菌種群比第一階段穩(wěn)定得多。生物過(guò)程的第一階段相比，在第二階段的進(jìn)水的組合物是更恒定的，這表明，這個(gè)變量廢水特性在大型PDW處理系統(tǒng)中使微生物群落進(jìn)化的是主要驅(qū)動(dòng)因素。我們的研究結(jié)果與其他研究人員的結(jié)論是一致的：微生物群落結(jié)構(gòu)本身并不能驅(qū)動(dòng)生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性，該生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性是功能冗余的結(jié)果，這是確保由水庫(kù)的物種的存在下，可以執(zhí)行相同的生態(tài)功能。在廢水處理系統(tǒng)，充足的細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)的靈活性以適應(yīng)變化的環(huán)境中，是穩(wěn)定的廢水處理系統(tǒng)中很重要的因素。因此，選擇具有良好性能的活性污泥和豐富的微生物群落作為接種污泥是PDW處理系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要保證。 4. 結(jié)論 調(diào)查的PDW生物處理系統(tǒng)有顯著的COD和色度去除率，在優(yōu)勢(shì)種群為細(xì)菌的情況下同時(shí)包含著不同的細(xì)菌，古細(xì)菌和真菌。在這個(gè)過(guò)程中，接種污泥適應(yīng)新PDW的環(huán)境，不同的微生物種群經(jīng)歷巨大的，持續(xù)的，多樣的和系統(tǒng)的變化。在系統(tǒng)運(yùn)行中，微生物群落是在不斷進(jìn)化的，盡管有穩(wěn)定性，這是最有可能通過(guò)進(jìn)水成分來(lái)波動(dòng)的。在第二階段的生物處理過(guò)程中存在大量的古生菌表明，他們可能在降解生物頑抗污染物中發(fā)揮重要作用。 參考文獻(xiàn) Acevedo, F., Pizzul, L., Castillo, M.P., Cuevas, R., Diez, M.C., 2011. 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