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1,第19章：分子生物學常用技術－－4學時 分子雜交、PCR、基因測序 蛋白質研究技術(雙向電泳，酵母雙雜交) 基因轉移與基因剔除(含RNA干擾) 第20章：基因工程－－4學時 第21章：基因診斷與基因治療－－4學時,第四篇：分子生物學技術與應用,,2,第十九章,分子生物學常用技術,3,分子生物學技術能幫助我們干什么？,揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白質)的結構與功能 DNA 水平：基因序列分析、拷貝數(shù)和染色體定位 RNA 水平：定量分析、基因表達產物的可變剪接分析 蛋白質水平：蛋白質定量、定位、功能 細胞與整體水平：基因在活體中的功能 目的：了解疾病發(fā)生的規(guī)律，提供治療與預防手段,4,我們需要了解和掌握哪些基本技術？,基本技術： 核酸：測序、印跡、雜交、體外擴增技術 蛋白質：電泳與印跡、組學技術、相互作用 綜合技術： 基因工程技術 轉基因生物與基因敲除技術 應用技術： 基因診斷 基因治療,5,Molecular hybridization:利用已知核酸序列 (探針/probe) 檢測與其互補的未知核酸序列 用途： 確認核酸序列間同源性 對特定核酸序列進行定量 自核酸混合體中辨認特定核酸序列,第一節(jié)：核酸分子雜交,6,一、基本原理,變性(denature)復性(renature)雜交(hybiridization),,,7,核酸變性,在特定變性因素作用下，DNA雙螺旋解離的過程 破壞氫鍵與疏水作用可導致變性 熱變性：高溫可使核酸變性，溫度高于 90℃時任何核酸雙鏈都將變性 酸堿變性：pH11 時核酸將變性，DNA 使用堿變性，RNA 則不可 化學試劑變性：能夠破壞氫鍵的化學試劑如尿素或甲酰胺可使核酸變性,8,變性溫度,Tm：melting temperature，解鏈溫度或變性溫度 影響變性溫度的因素： 溶液的離子強度 變性溫度與離子強度正相關，低鹽利于變性 DNA分子的 GC 含量 GC％＝(Tm－69.3)×2.24,9,核酸復性,變性的 DNA 單鏈相互識別并結合，恢復其天然雙螺旋結構的過程 復性類似與化學反應，需要一定反應時間,10,影響 DNA 復性速度的因素,DNA 分子的濃度：濃度高，復性快 DNA 分子的長度：長片段復性速度慢 DNA 分子的復雜性：重復序列復性速度快 不同物種C0t曲線比較 人類基因組C0t曲線,11,二、核酸探針,Probe：用于測定未知核酸片段的已知序列 探針為 DNA 或 RNA，可以為單鏈或雙鏈 探針必需經過標記：放射性標記或非放射性標記,12,1. 探針有哪些種類？,DNA 探針：常規(guī)探針利用基因組 DNA 序列或 cDNA 序列合成的探針，一般為雙鏈，也可制備成單鏈 RNA 探針：高靈敏度探針一般是通過體外轉錄而來，均為單鏈 寡核苷酸探針(oligo-nucleotide)：用于點突變檢測人工合成的短序列(~20nt)，可自由選擇序列,13,2. 標記物有哪些？,標記物的要求： 高度的靈敏性：足以檢測到極微量的核酸序列 高度的特異性：足以在大量非特異性序列中檢測到特異的靶序列 標記物的種類： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性標記物(non-radioactive label),14,放射性同位素,特點：靈敏度最高的標記物，足以檢測到飛克級微量的核酸序列g→mg→μg→ng→pg→fg 常用的放射性同位素,15,放射性標記的核苷酸單體,dNTP or NTP 5’ or 3’ P32 labelling,16,非放射性標記物,特點：安全且易于存放，但靈敏度與特異性均不及放射性同位素 地高辛：通過地高辛抗體結合并檢測 生物素：結合親和素/鏈親和素(avidin/streptavidin) 化學發(fā)光物質：通過紫外激發(fā)或化學反應而發(fā)光 電子密度標記物：金等重金屬,17,3. 如何檢測雜交信號？,同位素標記物： 蓋革計數(shù)器、液體閃爍計數(shù)器 放射自顯影(autoradiography),18,如何檢測雜交信號？,非放射性標記物： 酶聯(lián)免疫技術(enzyme linked immuno-assay) 化學發(fā)光(chemiluminescence),19,三、如何對核酸探針進行標記？,20,1. 缺口平移,nick translation: 適用于標記雙鏈DNA 控制 DNase I 的用量，可以控制探針的長度,21,2. 非放探針的酶促標記,生物素或地高辛標記的核苷酸單體通過酶促反應可以參入探針,22,3. 非放探針的化學標記,利用光敏基因經可見光照射直接與核酸結合,23,四、如何進行雜交？,樣品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龍膜、硝酸纖維膜、載玻片等 與標記的探針雜交 封閉液封閉后雜交，雜交爐中進行 緩沖液清洗 控制溫度與變性劑濃度 顯色 放射自顯影/酶聯(lián)顯色,24,五、雜交有哪些不同的方式？,斑點雜交：dot hybridization Southern 印跡雜交：Southern blot Northern 印跡雜交：Northern blot Western blotting：不是雜交 原位雜交：in situ hybridization 反 Northern 印跡雜交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微陣列：Genechip/DNA microarray,25,dot hybridization,將核酸樣品直接點在雜交膜上與探針進行雜交 特點：簡便但特異性不高可探測核酸含量，但無法得知分子大小,26,Southern blot,Edwin Southern 創(chuàng)立的方法 電泳技術與雜交結合，可顯示靶 DNA 序列的長度 可進行毛吸管轉移、真空轉移與電轉移,27,,,電泳,轉膜,雜交,28,Northern blot,類似于 Southern 印跡雜交的方法，用于 RNA 檢測,29,in situ hybridization,原位雜交：特定 mRNA 的組織細胞分布,30,FISH,Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基因的染色體定位,31,反 Northern 雜交與 DNA 芯片,反 Northern 雜交：將探針 DNA 片段固定在雜交膜上，利用標記物標記的 RNA 進行雜交,32,第二節(jié)：聚合酶鏈式反應,PCR，polymerase chain reaction 在體外選擇性擴增特定 DNA 片段的高效手段 70 年代有人提出 PCR 的設想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和適合的酶而無法進行 1984 年 Kary Mullis 發(fā)明 PCR，并因此獲得 1993 年的諾貝爾化學獎 全自動的熱循環(huán)儀和多種 PCR 衍生技術使其成為重要的科學研究手段,33,一、PCR 的基本原理,在體外，以特定引物引導，通過 DNA 聚合酶選擇性擴增特定區(qū)域 變性(denature) 退火(anneal) 延伸(extension),34,DNA的體內復制,35,引物酶,引物酶,DNA的體內復制,36,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,DNA的體內復制,37,DNA加熱解鏈,38,模板DNA,39,,,,引物1,引物2,40,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,41,第1輪結束,第2輪開始,42,72℃,,,,,,,,,,,,Taq,Taq,Taq,,Taq,55℃,43,,,,,,,,,,第2輪結束,44,模板DNA,第1輪擴增,第2輪擴增,第3輪擴增,第4輪擴增,第5輪擴增,第6輪擴增,理想拷貝數(shù)=2nn 循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX 平均效率,約為0.85n 循環(huán)次數(shù),45,,,,,,重復1-3步 25-30輪,目的DNA片段 擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈 與引物復性,新鏈延伸,,,,,DNA的體外擴增,熱循環(huán),DNA解鏈,46,,PCR反應體系4種dNTP混合物 各200 μmol/L 引物 各0.1-0.5 μmol/L 模板DNA 0.1～2 μg Taq DNA聚合酶 2.5 U Mg2+ 1.5mmol/L,DNA的體外擴增,47,PCR 技術的特點,高度的靈敏性：理論上經 20 循環(huán)可將目的基因片段擴增 220＝1000000 倍 高度的特異性：利用引物與模板的特異性配對，可保證擴增的特異性 一對 20 堿基長引物的多樣性為440＝1024 應用的廣泛性：目前已經成為分子生物學研究必不可少的手段 操作的簡便性：不需要復雜的設備和繁瑣的流程,48,二、做 PCR 要有什么條件？,酶：Taq DNA 聚合酶 模板 DNA：可以為基因組 DNA 或 cDNA 引物：人工合成的寡核苷酸片段 dNTP：聚合反應的核苷酸單體 緩沖液：包含特定的 pH、離子強度和 Mg2+ 反應程序：變性、退火、延伸組成的循環(huán) 儀器：DNA 熱循環(huán)儀，或稱 PCR 儀,49,DNA聚合酶催化的聚合反應,,dNTP,50,1. 什么是耐熱 DNA 聚合酶,早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I 在高溫時發(fā)生變性，每一循環(huán)都需要重新添加酶 延伸反應溫度為 37℃，非特異性太多 目前常用 Taq DNA 聚合酶 純化自嗜熱水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高溫，最適反應溫度為 72℃ 左右,51,Taq DNA polymerase,在 70~75℃ 范圍活性最佳，每秒可延伸 150nt 95℃ 時的半衰期為 40 min 按變性時間 1 min 計，能滿足 30 循環(huán)的反應 Taq 酶具有 5’ →3’ 聚合活性和 5’ →3’外切活性 不具備校讀活性，錯誤率為 2×10－4 左右 錯誤合成的 DNA片段可以作為模板，循環(huán)數(shù)越多，最終擴增產物錯誤率越高 只能用于檢測，不適合基因克隆,52,有保真性的耐熱 DNA 聚合酶嗎？,Pfu DNA polymerase： 常用的高保真耐熱 DNA聚合酶 有5’ →3’ 外切活性 錯誤率約 1×10－6 適應于基因克隆,53,2. 如何設計寡聚核苷酸引物？,引物(primer)是 PCR 反應必備的前提，對 PCR 產物類型、長度和反應的特異性具有決定作用 PCR 需要兩條引物，引物決定擴增范圍和擴增片段長度,54,引物設計原則,引物長度一般為 15~30 核苷酸 引物太短影響雜交體的穩(wěn)定和特異性 引物太長隨機匹配序列增多，特異性反而下降 GC 含量一般為 40％ ~ 60％ 應充分考慮退火溫度(annealing temperature) GC 含量低，退火溫度低，易出現(xiàn)非特異 GC 含量高，非特異性結合也會增加 引物解鏈溫度粗略計算公式：引物的解鏈溫度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T),55,引物設計原則,引物自身不應該存在鏈內互補序列，以防止出現(xiàn)發(fā)卡結構,兩條引物間、同一引物的分子間不應存在互補序列 出現(xiàn)互補易導致引物二聚體的出現(xiàn)，影響擴增效率,56,引物設計原則,避免引物與非特異序列間的同源性 引物的 3，末端必須與模板完全互補，5，末端允許添加非配對序列 5，末端允許添加非匹配序列，如：酶切位點,5’,3’,57,3. 如何選擇 dNTP 和緩沖液?,dNTP 是聚合反應的底物 常規(guī)使用濃度：0.2 mM each 探針標記時，可使用同位素或非放標記的 dNTP 緩沖液：特定的 pH 和離子強度 Mg2＋濃度一般為 1.5 mM PCR mix：預制的便捷反應體系,58,4. 用什么做模板 DNA？,PCR 的模板(template)可以是基因組 DNA 或 cDNA 逆轉錄-PCR(reverse transcription PCR)：RT-PCR 在利用 DNA 為模板進行擴增時純化比較簡單 血液、病原體、體外培養(yǎng)細胞、甚至病理標本經簡單處理后均可直接進行 PCR 擴增 RNA 樣品一般要經過嚴格純化，并逆轉錄 未經純化的 RNA 不穩(wěn)定，無法進行逆轉錄 反應體系中如存在 DNA，將對 RNA 擴增產生干擾,59,6. 如何設計反應程序？,PCR 的循環(huán)數(shù)： 理論上 20 ~ 25 即可滿足擴增需要，但實際循環(huán)數(shù)一般為 25 ~ 35 過多循環(huán)后到達平臺期，繼續(xù)延長循環(huán)數(shù)無效,模板濃度高時平臺期出現(xiàn)早，模板濃度低時平臺期出現(xiàn)晚，應根據(jù)模板濃度調節(jié)循環(huán)數(shù),60,反應程序的關鍵是退火溫度,退火溫度： 提高退火溫度有助于提高反應的特異性 退火溫度過高將導致引物與模板無法配對，影響擴增效率 反應的退火溫度主要取決于引物序列,61,三、我們能用 PCR 做什么？,自 PCR 技術創(chuàng)立以來，經近 20 年的發(fā)展，在基本 PCR 技術基礎上產生了多種 PCR 的衍生技術，應用于各種不同的目的 基因克隆或亞克?。蚬こ?特定基因表達量的分析 基因突變的檢測－－基因診斷 病原體特征性序列的鑒定－－基因診斷 定點誘變－－第 4 節(jié) DNA 序列測定－－第 3 節(jié),62,最常用的 PCR 是 RT-PCR,RT-PCR：reverse transcription PCR 以 mRNA 為模板 先進行逆轉錄，再進行 PCR 為什么要以 mRNA 為模板？ mRNA 無內含子，克隆的基因可在原核表達 mRNA 的量代表了基因的表達水平,63,如何利用 RT-PCR 檢測基因表達水平?,定量 PCR(quantitative PCR) PCR 產物的量與起始的模板量有關 利用 PCR 對模板 DNA 或 cDNA 進行定量測定 定量 PCR 一般用于特定基因 mRNA 水平的檢測 RT-PCR 可用于基因表達水平檢測 需設定內部參照物(reference gene)，如：GAPDH、actin、18s rRNA 等穩(wěn)定表達基因 定量是相對的，一般是不準確的,64,為什么說 RT-PCR 定量是不準確的？,指數(shù)擴增期，產物量與模板量成正比 進入平臺期，產物量不能再反應模板量 不同樣品進入平臺期的循環(huán)數(shù)不同，難以選擇測定的時間節(jié)點,65,有精確定量方法嗎？,實時熒光定量 PCR(real-time PCR)： 以產物量到達一定閾值所需要的循環(huán)數(shù)為定量標準 需要對 PCR 產物的生成量進行動態(tài)監(jiān)控,,66,如何進行產物量的實時檢測？,需要熒光標記探針與兩側 PCR 引物 探針標記有報告熒光與粹滅熒光 反應過程中探針被降解，報告熒光顯色 可通過熒光定量 PCR 儀進行實時監(jiān)控,67,巢式 PCR 可以提高擴增效率和特異性,Nested-primer PCR 內外兩套引物分兩輪進行擴增 在克隆一些低豐度基因時可以采用,經過兩輪 PCR 擴增，具有更高的靈敏度 四條引物均與模板匹配，因此增加了特異性,68,可以利用多對引物進行多重 PCR,多重 PCR(multi-primer PCR) 多組引物同時進行的 PCR，可大幅度降低 PCR 反應的工作量,69,可以在組織切片上進行原位 PCR,原位 PCR(in situ PCR) 在組織切片或細胞涂片上進行的 PCR 方法 主要用于特定基因表達水平的原位分析 組織切片經過固定、蛋白酶和 DNase 消化后進行 RT-PCR 擴增,70,Sequencing：基因結構分析的最基本方法 主要方式： 化學降解法 酶法：Sanger 法/雙脫氧鏈末端終止法 二代/三代測序技術,第三節(jié)：基因測序,71,適用于寡核苷酸片段測序的方法 基本反應： G：DMS G/A：哌啶 T/C：肼(低鹽) C：肼(高鹽),一、化學降解法,72,Sanger 在 1977 年建立的方法，也稱酶法測序 DNA 序列測定的最常用方法,二、雙脫氧末端終止法,在反應體系中加入 2’, 3’ -ddNTP，由于其沒有 3’-OH 而不能與下一個核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。,73,Sanger法測序,74,模板：單鏈→單雙鏈均可 酶： Klenow →耐熱 DNA 聚合酶 標記：同位素標記→熒光標記 電泳：平板電泳→毛細管電泳4 泳道→單一泳道,酶法測序的自動化程度越來越高,75,二代測序技術(next-generation sequencing) 1 天完成全基因組測序 羅氏、Solexa、ABI 等公司各有不同技術 利用微珠或芯片實現(xiàn)大通量，邊合成邊測序 三代測序技術(next-next-generation sequencing)： 3 分鐘完成全基因組測序 基于納米微孔的單分子測序技術,二代測序與三代測序技術,76,第四節(jié)：DNA 定點誘變技術(自學）,目前主要用 PCR 方法進行定點誘變 也可進行突變基于的全合成,77,第五節(jié)：RNA 干擾技術,學習基因工程之后，在基因剔除技術部分介紹,78,第六節(jié)：生物芯片,生物芯片(biochip)：基于微電子技術和生物信息技術建立的高度集成化的生物樣本分析方法 生物芯片是后基因組時代的利器 生物芯片有哪些種類？ DNA microarray Protein microarray Antibody microarray Chemical compound microarray Tissue microarray,79,什么是基因芯片技術？,基因芯片(gene chip)，一種高通量的核酸雜交方法，又稱 DNA 微陣列 (DNA microarray) 將大量探針固定與固相支持物，與標記的待測樣品進行雜交的方法 Affymetrix 公司已經將 GeneChip 注冊,80,如何制作基因芯片？,cDNA 芯片：cDNA 片段以顯微打印的方式固定于固相支持物表面，集成度較低 原位合成芯片：以激光蝕刻技術直接合成寡核苷酸探針，集成度可達 105 點陣/cm2以上,81,基因芯片能幫助我們干什么？,基因表達譜芯片(gene expression profile)：基因表達的大通量分析 SNP 芯片(single nucleotide polymorphism)：單核苷酸多態(tài)性的大通量檢測 微小 RNA 芯片(miRNA)：分析 microRNA 甲基化芯片：分析基因組甲基化狀態(tài) ChIP-chip(chromatin immunoprecipitation)：分析 DNA 與蛋白質的相互作用,82,芯片的主要工作流程,選擇與購買芯片 準備樣品 標記樣品 雜交 檢測雜交信號 分析處理結果,83,第七/八節(jié)：蛋白質分析方法,蛋白質的定量分析： ELISA(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) Western blot 蛋白質的定位： 免疫組織化學 熒光蛋白的活細胞定位 蛋白質相互作用的研究 蛋白質功能的研究 蛋白質組學技術,84,Proteomics,蛋白質組與蛋白質組學： 對特定組織細胞總蛋白的整體性研究,85,蛋白質組學研究的目的什么？,解讀基因組：基因組編碼了多少基因？ 蛋白表達：比研究 RNA 表達深入了一步 蛋白功能：超過 1/3 的蛋白質功能不明確 蛋白質修飾：糖基化、磷酸化、酶解等 蛋白質定位：subproteome 蛋白-蛋白相互作用：互作是功能的基礎,86,蛋白質組學的核心技術是什么？,1975 年，雙向電泳技術建立 1990 年，更新的 Edman 降解法用于微量蛋白質測序，靈敏度達到 pmol 級 質譜技術使蛋白測序靈敏度達到 fmol 級 基因組計劃提供了大量的生物信息 雙向電泳＋質譜＋生物信息分析,87,等電聚焦 ＋ SDS-PAGE,雙向電泳技術,88,雙向電泳,等電聚焦＋SDS-PAGE,89,雙向電泳的優(yōu)點與缺陷,優(yōu)點： 比單向電泳有更高的分辨率 缺點與解決辦法： 無法檢測低豐度蛋白：分組檢測 無法檢測大分子量或脂溶性蛋白：酶解 電泳圖譜解讀困難：自動化分析、DIGE,90,Difference gel electrophoresis (DIGE),91,Mass spectrometry,肽質譜(MS)：分析混合多肽 只能確定氨基酸組成，不能分析序列 氨基酸質譜：分析單一肽的氨基酸序列 串聯(lián)質譜(Tandem mass spectrometry，MS/MS) 可以分析氨基酸序列 通過與數(shù)據(jù)庫比較確認肽的來源,92,MS 與 MS/MS,93,如何進行蛋白-蛋白相互作用的分析？,酵母雙雜交(yeast two-hybridization) 噬菌體展示文庫(phage display library) 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation) FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer),94,Yeast two-hybridization,蛋白質相互作用的篩查方法 以特定蛋白為釣餌，篩選其相互作用蛋白,95,如何利用蛋白質組學方法進行功能分析？,蛋白質芯片 抗原－抗體 鑒定蛋白質相互作用 鑒定蛋白質與小分子相互作用：代謝組學 檢測酶活性：蛋白質功能的高通量分析,96,本章的主要內容是什么？,通過本章學習了解了哪些核酸和蛋白質研究方法？ 什么是分子雜交？ 分子雜交的探針是什么？怎樣進行標記？ 分子雜交有哪些基本方式？ 什么是 PCR？基本原理是什么？ PCR 反應體系是由什么組成的？,97,本章的主要內容是什么？,什么是 RT-PCR？能用來干什么？ 如何利用 PCR 進行核酸的定量分析？ 什么是基因芯片？ 什么是蛋白質組學？核心方法是什么？ 如何進行蛋白質相互作用的研究？,