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1,第十章 臨床分子生物學(xué)診斷 （ Clinical Molecular Biology Diagnosis ）,2,學(xué)習(xí)內(nèi)容,了解流式細(xì)胞術(shù)及染色體檢測(cè)在臨床中的應(yīng)用熟悉分子生物學(xué)常用技術(shù)及在臨床診斷中的地位掌握基因診斷的定義及在臨床診斷中的應(yīng)用（重點(diǎn)）,3,分子生物學(xué)概念,在分子水平上研究生命現(xiàn)象的科學(xué)。通過(guò)研究生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)、功能和生物合成等方面內(nèi)容，闡明各種生命現(xiàn)象的本質(zhì)。,正常生命現(xiàn)象－本質(zhì)疾病－診斷,4,運(yùn)用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，對(duì)來(lái)自人體的血液、骨髓、體腔液、排泄物、分泌物和組織細(xì)胞等標(biāo)本進(jìn)行各種檢測(cè)，獲得有關(guān)病原體、核酸及蛋白質(zhì)改變等方面的實(shí)驗(yàn)信息，為疾病診斷、治療方案選擇、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估等提供客觀依據(jù)，并為疾病的防治、健康普查與咨詢等做出正確的評(píng)價(jià)。,臨床分子生物學(xué)檢測(cè)概念,5,Gene Diagnosis,第一節(jié) 基因診斷,6,以DNA或RNA為檢查對(duì)象，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)檢查基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)量的改變，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過(guò)程。遺傳物質(zhì)可以是外源性基因，也可以是內(nèi)源性基因。,一、基因診斷的定義：,7,基因診斷的主要內(nèi)容,基因突變分析 基因連鎖分析 基因表達(dá)分析 病原體診斷,8,二、基因診斷在診斷學(xué)中的位置,9,基因診斷的基礎(chǔ)是醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)，專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)，不同的是我們?cè)诨蛩缴涎芯浚夯蚪Y(jié)構(gòu)（解剖）、基因轉(zhuǎn)錄翻譯等（生理）、基因結(jié)構(gòu)異常（病理），基因表達(dá)異常（病生），然后主要應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)手段進(jìn)行基因診斷。,基因診斷遵循診斷學(xué)的基本原則,10,染色體數(shù)量變異：包括整倍體和非整倍體 染色體結(jié)構(gòu)變異：染色體在體內(nèi)外因素作用下，發(fā)生斷裂和愈合過(guò)程中的異常改變。,三、遺傳變異,缺失：指染色體部分丟失，主要有末端和中間缺失兩種 倒位：指一條染色體發(fā)生兩處斷裂，中間部分顛倒順序再連接 易位：某個(gè)染色體斷片位置移到另一處或另一個(gè)染色體的新位置上 插入：兩處斷裂產(chǎn)生的中間一段染色體轉(zhuǎn)移到同一染色體或另一條染色體的一個(gè)斷裂處并重新連接 重復(fù)：染色體中增加的額外染色體成分，是染色體個(gè)別區(qū)帶或片段的重復(fù),11,１．轉(zhuǎn)換： 指DNA上發(fā)生的單個(gè)堿基的置換，一種嘌呤被另一種嘌呤所置換；或一種嘧啶被另一種嘧啶所置換。 ２．顛換： 指一種嘌呤被另一種嘧啶所置換，或一種嘧啶被另一種嘌呤所置換。 ３．缺失： 指DNA鏈被刪除一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)，常引起嚴(yán)重的表型改變。 ４．插入： 指DNA鏈中插入一對(duì)或幾對(duì)堿基。,四、基因突變,指DNA中核苷酸排列順序或組成發(fā)生的變化,（一）按基因突變性質(zhì)劃分,突變可分為長(zhǎng)度變化和點(diǎn)突變，后者又分為兩種：轉(zhuǎn)換和顛換,12,1．錯(cuò)義突變： DNA中核苷酸發(fā)生置換后，改變了遺傳密碼，使一種氨基酸變成另一種氨基酸，影響到所合成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。 2．無(wú)義突變： 當(dāng)DNA突變后，使原來(lái)編碼某一氨基酸的密碼子變成終止密碼子時(shí)，多肽鏈停止合成，提前釋放出不完全的蛋白質(zhì)，造成功能喪失。 3．同義突變： 指由于遺傳密碼是兼并的，決定一種氨基酸的密碼子常常不止一個(gè)，因此DNA中某些堿基置換只造成三聯(lián)密碼中第三個(gè)核苷酸發(fā)生改變，不改變氨基酸。 4．移碼突變： 即DNA鏈中插入或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)后，使讀碼格式發(fā)生改變，自突變點(diǎn)3’方向以后的一系列密碼都改變，造成肽鏈大范圍錯(cuò)誤。,（二）按基因突變結(jié)果劃分,根據(jù)突變發(fā)生的位置和突變性質(zhì)，會(huì)使遺傳密碼的閱讀框和蛋白質(zhì)翻譯發(fā)生變化，可分為：,13,五、基因診斷常用技術(shù),核酸分子雜交 DNA序列測(cè)定 聚合酶鏈反應(yīng) 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 限制性片段多態(tài)性分析 單核苷酸多態(tài)性 DNA芯片技術(shù),Southern 、Northern 印跡雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交,14,（一）核酸分子雜交技術(shù),核酸分子雜交是指兩條互補(bǔ)單鏈核酸（DNA或RNA）在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈的過(guò)程,特點(diǎn)：,分子雜交的基礎(chǔ)是堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū) 雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA之間進(jìn)行 都采用了同位素或非同位素標(biāo)記的探針,15,待測(cè)核酸制備,濾膜上核酸固化,雜 交,去除未參與雜交的探針,,,,,檢 測(cè) 雜 交 信 號(hào),制備探針核酸片段,,探 針 標(biāo) 記,,加入標(biāo)記核酸探針,,核酸分子雜交的流程示意圖,16,1. Southern印跡法,是最經(jīng)典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進(jìn)行分子量大小測(cè)定，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。,主要步驟：,不同來(lái)源DNA樣品（限制性內(nèi)切酶切割） 凝膠電泳分離 堿變性使DNA解離成單鏈 毛細(xì)管虹吸或電轉(zhuǎn)移法到硝酸纖維素膜 洗滌、涼干、80℃烤箱中加溫2小時(shí)用于雜交 探針于100℃變性處理 顯色,17,斑點(diǎn)雜交結(jié)果,2. Northern印跡法,用于組織細(xì)胞中總RNA或mRNA的定性和定量分析,同Southern雜交 注意RNA酶的處理 電泳須在含甲醛或乙二醛的變性凝膠中進(jìn)行,主要步驟：,3. 斑點(diǎn)雜交 Dot Blotting,用于基因組中特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及半定量分析，方法簡(jiǎn)單、快速靈敏、樣品用量少；其缺點(diǎn)是不能鑒定所測(cè)基因的分子量，特異性不高。,18,組織或細(xì)胞的原位雜交，是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，并可顯示細(xì)胞亞群分布和動(dòng)向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。,4. 原位雜交 In Situ Hybridization,19,確定DNA雙股鏈上每一個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)單元或堿基的確切順序的過(guò)程,（二）DNA序列測(cè)定,DNA測(cè)序的方法,鏈終止法測(cè)序 化學(xué)降解法測(cè)序 自動(dòng)化測(cè)序,（DNA Sequencing）,20,1、鏈終止法測(cè)序,基本原理:,在合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈時(shí)，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而可讀取待測(cè)DNA分子的順序。,21,脫氧核苷酸的連接,22,雙脫氧核苷酸不能連接,,23,制備單鏈模板↓ 將單鏈模板與引物退火↓ 加入DNA多聚酶及4種脫氧核苷酸↓ 分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓ 將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓ 根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列,技術(shù)路線,24,,25,A T G G T A C C G C A T,26,2、化學(xué)降解法測(cè)序,基本原理:,在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)基團(tuán),再用化合物處理,使DNA分子在被修飾的位置降解。,雙鏈DNA變性為單鏈↓ 同一方向末端標(biāo)記，以顯示DNA條帶↓ 不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體↓ 電泳,讀取DNA核苷酸順序,技術(shù)路線:,27,,Maxam-Gilbert 法所用的化學(xué)技術(shù),28,,,,哌啶,化學(xué)法測(cè)序?qū)嵗?29,3、自動(dòng)化測(cè)序,基本原理:,與鏈終止法測(cè)序原理相同，只是用不同的熒光素分別標(biāo)記ddNTP，如ddATP標(biāo)記紅色熒光，ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光，ddGTP標(biāo)記黃色熒光，ddTTP標(biāo)記綠色熒光。由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色，而簡(jiǎn)化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基。,30,31,32,（三）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，擴(kuò)增產(chǎn)物大小依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,模板DNA的變性：94℃數(shù)分鐘，雙鏈解離成單鏈 模板DNA與引 物退火：55℃左右，引物與模板DNA互補(bǔ)序列結(jié)合 引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的新鏈,PCR（體外核酸擴(kuò)增技術(shù)）基本原理 ：,PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：,（Polymerase Chain Reaction，PCR）,33,特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化； 能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，使肉眼能直接觀察和判斷； 可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研 究和檢測(cè)鑒定。,PCR（體外核酸擴(kuò)增技術(shù)）特點(diǎn) ：,34,,,,,變性,退火,延伸,,百萬(wàn)倍擴(kuò)增,35,PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用,36,（四）連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),連接酶鏈反應(yīng)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù),程序：在模板DNA、DNA連接酶、寡核苷酸引物存在條件下，加熱94℃變性，雙鏈打開(kāi)，然后降溫退火(65℃)，引物與之互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合并留下一缺口，引物與靶序列完全互補(bǔ)，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應(yīng)的三步驟(變性-退火-連接)就能反復(fù)進(jìn)行，否則空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行。 應(yīng)用：點(diǎn)突變、微生物病原體、單堿基遺傳病，微生物的種型鑒定等研究。,（ligase Chain Reaction, LCR）,37,單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間構(gòu)象，主要是由其內(nèi)部堿基相互作用力維持的，當(dāng)某個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，其空間構(gòu)象發(fā)生改變，相同長(zhǎng)度的單鏈DNA形成的構(gòu)象不同，由此形成單鏈構(gòu)象多態(tài)性，在非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)中受排阻大小不同，可以將構(gòu)象上有差異的分子分離開(kāi)。,（五）單鏈構(gòu)象多態(tài)性,（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）,38,SSCP 示意圖,39,限制性內(nèi)切酶可特異識(shí)別DNA堿基序列并對(duì)其進(jìn)行切割，當(dāng)基因組中的核苷酸發(fā)生突變時(shí)可造成限制酶切位點(diǎn)的改變，用限制酶切割基因所產(chǎn)生的限制性片段的數(shù)目和每個(gè)片段的長(zhǎng)度就不同，稱之為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。能導(dǎo)致限制性片段發(fā)生改變的酶切位點(diǎn)又稱為多態(tài)性位點(diǎn)。,（六）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析,（ Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP ）,40,RLFP分析法,41,42,是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,包括置換、顛換、缺失和插入。是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種，在人群中的發(fā)生率大于1%。,1.密度高 2.具有疾病關(guān)聯(lián)性 3.遺傳穩(wěn)定性 4.檢測(cè)手段易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,（七）單核苷酸多態(tài)性,（ Single Nucleotide Polymorphism，SNP ）,特點(diǎn)：,43,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）由于在制備過(guò)程中運(yùn)用了計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)如顯微光蝕刻、顯微打印等，且常用硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片技術(shù),（八）基因芯片技術(shù),44,基因芯片,45,1.優(yōu)生優(yōu)育與遺傳性疾病 2.對(duì)疾病做出診斷 3.器官、組織移植的配型 4.病原體診斷 5.環(huán)境對(duì)人體影響檢測(cè) 6.法醫(yī)學(xué)方面的鑒定,應(yīng)用范圍：,通過(guò)設(shè)計(jì)不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如基因表達(dá)譜測(cè)定、實(shí)變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因組文庫(kù)作圖及雜交測(cè)序等。,46,1.遺傳性疾病的基因診斷 2.感染性疾病的基因診斷 3.腫瘤的基因診斷 4.法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,六、基因診斷在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,47,第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)及臨床應(yīng)用,48,一、流式細(xì)胞儀的基本介紹,利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速、直線、流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。,49,集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。,流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer),50,,,,,,單細(xì)胞懸液或生物顆粒,,分析速度高,,多參數(shù),,精度高,,當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù),可分選,流式細(xì)胞儀特點(diǎn),51,液流系統(tǒng)流動(dòng)室液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)激光光源光收集系統(tǒng) 電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 細(xì)胞分選系統(tǒng),二、流式細(xì)胞儀的基本構(gòu)造,52,信號(hào)產(chǎn)生-散射光信號(hào),當(dāng)顆粒通過(guò)聚集的激光束時(shí)，激光向各個(gè)方向散射與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號(hào)（FSC） 與激光束垂直的稱為側(cè)向角散色光信號(hào)（SSC）,53,FSC，前向角散射光，代表細(xì)胞大小 SSC，側(cè)向角散射光，代表細(xì)胞粒度,54,信號(hào)產(chǎn)生-熒光信號(hào),當(dāng)熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過(guò)激光束時(shí)，染料吸收光子躍遷到激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。,55,單參數(shù)直方圖雙參數(shù)圖二維散點(diǎn)圖等高線圖和密度圖假三維圖三維圖,三、流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示方式,56,X軸：代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)的強(qiáng)度，用“道數(shù)”表示，根據(jù)選擇放大器類(lèi)型不同，可以是線性標(biāo)度或?qū)?shù)標(biāo)度 Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號(hào)特征性細(xì)胞的頻率,單參數(shù)直方圖,57,細(xì)胞雙參數(shù)測(cè)定不僅能提供二個(gè)參數(shù)各自與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，更重要的是獲得了這二個(gè)參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，其中包含了更多的生物學(xué)信息。在二維圖上，橫軸代表第一個(gè)測(cè)量參數(shù)，縱軸代表第二個(gè)測(cè)量參數(shù)。,雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示,58,縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù),在圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞,二位散點(diǎn)圖,59,用等高線來(lái)表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。,二位等高線圖和密度圖,60,利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)二維等高線圖的之中視覺(jué)直觀的表現(xiàn)方法，縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù),Z軸為細(xì)胞數(shù)。,假三維圖,61,三維圖,任意選擇三個(gè)參數(shù)為X、Y、Z軸構(gòu)成的圖像，三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。,62,流式細(xì)胞儀檢測(cè)范圍,細(xì)胞大小 細(xì)胞粒度 細(xì)胞表面面積 DNA含量與細(xì)胞周期 RNA含量 蛋白質(zhì)含量,細(xì)胞結(jié)構(gòu),,,,,,,特異性抗原 （細(xì)胞表面/胞漿/核） 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 細(xì)胞活性 酶活性 激素結(jié)合位點(diǎn) 細(xì)胞受體,細(xì)胞功能,,,,,,,凡細(xì)胞內(nèi)能進(jìn)行熒光標(biāo)記的成分或變化都可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),四、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用,63,DNA分析,1. 細(xì)胞周期檢測(cè),64,Sub G1,發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段，在乙醇固定過(guò)程中小分子DNA片段穿過(guò)胞膜丟失，造成凋亡細(xì)胞內(nèi)DNA含量減少，出現(xiàn)一個(gè)DNA含量小于2n的亞”G1”峰。,2. 細(xì)胞凋亡分析,65,3. 細(xì)胞增值的檢測(cè)與分析,CFSE單參數(shù)法,CFDA-SE（羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯）是一種非極性分子，進(jìn)入細(xì)胞后可以被分解成CFSE，不可逆地和細(xì)胞內(nèi)蛋白的Lysine殘基或其它氨基結(jié)合。 被CFDA -SE標(biāo)記的非分裂細(xì)胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時(shí)間可達(dá)數(shù)個(gè)月。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)。CFSE標(biāo)記物平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞，因此其熒光強(qiáng)度是親代的一半。,66,,圖中細(xì)胞被標(biāo)記并刺激后，可跟蹤細(xì)胞的分裂。配合使用Modfit軟件分析，可確定每代的細(xì)胞數(shù)。,細(xì)胞增殖的檢測(cè)與分析,67,4. 細(xì)胞相對(duì)大小和顆粒性分析,68,5. 細(xì)胞活性分析,Fluorescein Diacetate（二乙酸熒光素）進(jìn)入活細(xì)胞后,被胞內(nèi)酯酶降解，生成熒光底物.活細(xì)胞會(huì)發(fā)綠色熒光,69,Granulocytes,,Monocytes,,,Basophils,Lymphocytes,,,T Helper,T Cytotoxic,,,,,,,Peripheral White Blood Cells CD45+,,,CD3+ CD4+,CD3+ CD8+,CD3+,CD3- CD19+ HLA-DR+,CD3- CD16+ CD56+,Monocytes,6. 細(xì)胞表面分子的檢測(cè)與分析,Lysed Whole Blood Components,70,T淋巴細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞檢測(cè),淋巴細(xì)胞,71,B淋巴細(xì)胞檢測(cè),淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞,72,NK細(xì)胞檢測(cè),淋巴細(xì)胞,NK細(xì)胞,73,第三節(jié) 熒光原位雜交,(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH),74,利用生物素或地高辛等非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針，并通過(guò)熒光素偶聯(lián)的抗原-抗體檢測(cè)系統(tǒng)，在組織、細(xì)胞及染色體上對(duì)DNA或RNA進(jìn)行定性或定位分析。,標(biāo) 記 物：,脫氧尿嘧啶三磷酸 Bio-11-dUTP(生物素) Dig-11-dUTP(地高辛),標(biāo)記方法：缺口平移法，隨機(jī)引物法,75,特點(diǎn) 1 熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全； 2 探針?lè)€(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用； 3 實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確； 4 可定位1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)； 5 多色FISH通過(guò)顯示不同顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列； 6 既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。,76,熒光標(biāo)記原位雜交原理,實(shí)驗(yàn)流程：FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→ （染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測(cè)→結(jié)果分析。,77,整條染色體涂染探針 染色體重復(fù)序列探針 染色體專(zhuān)一位點(diǎn)探針,染色體FISH探針,實(shí)驗(yàn)流程：,FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→ （染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測(cè)→結(jié)果分析。,78,整條染色體涂染,易位染色體,染色體重復(fù)序列探針,染色體專(zhuān)一位點(diǎn)探針,79,謝 謝,祝同學(xué)們考出好成績(jī),