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1、學習 ----- 好資料 博恒 ? 玉米赤霉烯酮 ELISA 快速檢測試劑盒操作說明書 1、 簡介 本試劑盒采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附 ELISA 原理快速定量檢測谷物、 飼料中的玉米赤霉 烯酮（ ZearaLenone,ZEN ）。 谷物 /飼料的前處理包括：提取、過濾、稀釋，處理時間大約為 20-40 分鐘。 本試劑盒的檢測限為： 10 ppb；谷物 /飼料中 ZEN 的回收率 ≥ 80%；批內、批間變異系數(shù) <15% 。 2、 試劑盒組成 A. 24/48/96 孔 ZEN 酶標板 : 3/6/1

2、2 條 ×8 孔 B. 20 ×濃縮洗滌液： 25mL ( 用蒸餾水稀釋 20 倍使用 ) 1 瓶 C. ZEN 抗體 : 3/6/12mL 1 瓶 (紅蓋 ) D. 酶標二抗： 3/6/12 mL 1 瓶 (綠蓋 ) E. 顯色液： 3/6/12 mL 1 瓶 (藍蓋 ) F. 終止液 :3/6 mL 1 瓶 (黃蓋 ) G. ZEN 標準品 :1.5/2mL/ 瓶（ 0、30、 60、200、 500ppb） 各 1 瓶 H. 操作說明書 1 份 注意 ：標準品含有低濃度 ZEN 、終止液含 2 N H 2SO4，需小心

3、取用；勿在有效期外使用本試劑盒。 3、 貯存條件與有效期 2-8℃避光貯存，忌 0℃以下凍存，有效期見試劑盒內蓋。 4、 樣品處理程序 實驗準備：配制 60%甲醇水溶液（ v/v ， 60:40）和 20%甲醇水溶液（ v/v ， 20:80）。 注意：請精確配制上述溶液，以免影響檢測的準確性 。 稱取 5 g 具有代表性的粉碎樣品于 100 mL 帶塞三角瓶內，準確加入 25 mL 60% 甲醇水溶液。 將加入了甲醇水溶液的樣品放入振蕩器內（或用手強力振蕩） ，充分振蕩 3 分鐘后，用 whatman 1 號濾紙過濾，收集濾液

4、。 取濾液 2mL ，加入 6 mL 20% 甲醇水溶液，混勻，用 whatman 1 號濾紙過濾，此為樣品 待檢液。 注意 ： 更多精品文檔 學習 ----- 好資料 ? 某些樣品待檢液 ( 如花生等 ) 久置影響檢測結果的準確性，為保證檢測的準確性，樣品提取后請即時檢測。 ? 若樣品待檢液不立即檢測，請將其存儲于棕色玻璃瓶內， 2-8℃避光保存。 ? 試劑盒在使用前，請將試劑盒內所有試劑放到室溫（ 20-25℃）進行溫度平衡。試劑用完后立即將其放置回 2-8℃冰箱內保存。 ? 在每個步驟操作時， 速度要

5、快， 不要使板孔暴露在空氣中時間過久，避免酶標板變干。 未用完的酶標板需密閉于自封帶內，防止受潮且避光保存于 2-8℃冰箱內。 ? 在溫育時，避免光照，建議將酶標板置于濕盒內 (在有蓋容器內放置一塊平整濕紗布 ) 進行溫育。 ? 若樣品數(shù)量超過 20 份，請用多通道加樣器操作。 5、 定量檢測程序 5.1 實驗準備： 從冰箱取出試劑盒，恢復至室溫后，打開自封袋，取出所需數(shù)量的板條插入 微孔架，記錄空白、 ZEN 標準品①②③④⑤號及樣品的位置（可參照下表所示） 。其余 板條封口后放入冰箱。將 20×濃縮洗滌液用超純水或蒸餾水稀釋 20 倍

6、，待用。 1 2 3 12 A 樣品 空白 B 標準品① 樣品 C 樣品 標準品② D 標準品③ 樣品 E 標準品④ 樣品 F 標準品⑤ 樣品 G 樣品 樣品 H 樣品 樣品 5.2 加樣： 空白孔加入 100 μL 洗滌液 (不加 ZEN 抗體 )。ZEN 標準品孔和樣品孔相應地加入 標準品 (①②③④⑤ ) 和樣品待檢液各 50 μL/孔（如上表所示加入） ，再加入 ZEN 抗體 (50 μL /孔 )，此時各孔中溶液體

7、積為 100 μL。將酶標板在水平桌面上輕微振蕩（注意避免液體 濺出），使之混勻，放入濕盒內 ( 在有蓋容器內放置一塊平整濕紗布 )， 37℃溫育 30 分鐘。 注意：此操作步驟要快，盡量保持前后孔溫育時間一致，每次加樣須更換新的吸頭。 5.3 洗板：甩出孔中的液體， 用洗瓶或移液器將洗滌液加入各孔中 (滿孔 )，再次甩出孔中液體， 更多精品文檔 學習 ----- 好資料 將酶標板倒置在吸水紙上拍打以除去孔中的液體，再重復操作洗滌步驟三次 (共洗四次 )。 5.4 加酶標二抗： 將洗好的酶標板平放，加入酶標二抗

8、 100 μL /孔，置于濕盒內， 37℃溫育 30 分鐘。 5.5 洗板： 參照 5.3 5.6 顯色： 將洗好的酶標板平放，加入顯色液 100 μL /孔， 37℃顯色 5 分鐘 (若顯色較淺，可 適當延長，但不宜超過 10 分鐘 )。 5.7 終止及測定： 將顯色完畢的酶標板取出，加入終止液 50 μL/ 孔，輕微震蕩混勻，以空白 孔調零，在 450 nm 處測量吸光值 A （在加入終止液 5 分鐘內讀取吸光值） 。 5.8 結果判定： 以 ZEN 標準品濃度

9、 30ppb、60ppb、200ppb、500ppb 的常用對數(shù)值（ 1gC）為 橫坐標，各濃度標準品相應的吸光值 A 與 0ppb 的標準品 A 值的比值 (B/B 0%) 為縱坐標 [B/B 0%= 標準品（或樣品）的吸光值 /0ppb 標準品的吸光值 ×100%] ，繪制標準曲線。根據樣品孔的吸 光值計算樣品的 B/B 0%值，查標準曲線，可得到相應樣品中 ZEN 的含量 (已考慮樣品提 取的稀釋倍數(shù)，結果無需換算 )。 (或可直接用 RADEWIN 等專用 ELISA 分析軟件對數(shù)據 進行分析得出結果 )。如果檢測結果高于檢測上限， 請將待測樣品

10、提取液用 30%甲醇水（ v/v ， 30:70）稀釋后再檢測，測定結果乘以相應的稀釋倍數(shù)。 6、 限量 (定性 )檢測程序 樣品處理程序見四，適用于同時定性檢測多個限量標準不同的樣品，以 ZEN 標準品③ 號 (60ppb) 作參照進行定性比較，不需作標準曲線。待測樣品提取液根據限量標準的不同，用 30%的甲醇水溶液按下表稀釋： 限量標準 ≤60ppb ≤500ppb 待檢樣品提取液 1mL 0.3mL 30%的甲醇水 0 2.2mL 稀釋倍數(shù) 1 50/6 6.1 實驗準備： 從冰箱取出試劑盒，恢復至室溫后，打開

11、自封袋，取出所需數(shù)量的板條插入 微孔架，記錄空白、 ZEN 標準品③號 (60ppb)及樣品的位置，其余板條封口后放入冰箱。 6.2 反應： 空白孔加入 100 μL 洗滌液 (不加 ZEN 抗體 )。ZEN 標準品孔和樣品孔相應地加入 標準品③號 (60ppb)和稀釋后的待檢樣品提取液各50 μL/ 孔，再加入 ZEN 抗體 (50 μL / 孔)， 將酶標板在水平桌面上輕微振蕩（注意避免液體濺出） ，使之混勻，置濕盒內， 37℃溫 育 30 分鐘。 注意：此操作步驟要快，盡量保持前后孔溫育時間一致，每次加樣須更換 新的吸頭。

12、 6.3 洗板： 參照 5.3 6.4 加酶標二抗： 參照 5.4 6.5 洗板： 參照 5.5 6.6 顯色： 參照 5.6 6.7 終止及測定： 參照 5.7 ( 目測法不加終止液 ) 6.8 結果判定： 目測法 ( 未加終止液前目測 )：比較樣品孔與標準品參照孔的顏色，若樣品 更多精品文檔 學習 ----- 好資料 孔顯色比標準品參照淺，則為陽性，樣品中 ZEN 的含量超出限量標準；若深者，則為 陰性；若顏色接近，則需用酶標儀測吸光值比較。儀器法

13、：酶標儀檢測在 450nm 波長 處各孔的吸光值 A ，若樣品的 A 值 <標準參照的 A 值，為陽性，表示樣品中 ZEN 的含 量超出限量標準；若樣品 A 值 ≥標準參照 A 值，為陰性。 7、 自備儀器及試劑 酶標儀（內置 450nm 濾光片）或黃曲霉毒素 B1 專用測定儀 20-200μL 微量移液器及配套吸頭 恒溫培養(yǎng)箱（ 0℃ -50℃）、冰箱、感量 0.01g 的天平、小型粉碎機或碾缽 玻璃器皿：三角瓶、燒杯、分液漏斗、蒸發(fā)皿、量筒、具塞試管、滴管、移液管等 其他：甲醇、 whatman 1 號濾紙、吸水紙等 8、 國家標準

14、 GB/T 19540-2004 飼料中玉米赤霉烯酮的測定 薄板層析法和 ELISA 分析法 GB 2715 2005 糧食衛(wèi)生標準 小麥和玉米中玉米赤霉烯酮限量指標為 60μg/kg GB 13078.2-2006 飼料衛(wèi)生標準飼料和玉米中玉米赤霉烯酮的允許量 500 μg/kg 地址：南昌市高新區(qū)火炬大道 201 號江西留學生創(chuàng)業(yè)園 郵編： 330029 電話： 0791-8130250 傳真： 更多精品文檔