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命題點(diǎn)6　現(xiàn)代生物科技專題 真題重溫練(A卷) 1．(2018江蘇，32)為生產(chǎn)具有特定性能的α淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α淀粉酶基因(1 656個(gè)堿基對(duì))，利用基因工程大量制備α淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程見下圖。請(qǐng)回答下列問題： (1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的________________。 (2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的________端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是_____________________ ________________________________________________________________________。 (3)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中________的設(shè)定與引物有關(guān)，________的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。(填序號(hào)) ①變性溫度?、谕嘶饻囟取、垩由鞙囟取、茏冃詴r(shí)間?、萃嘶饡r(shí)間　⑥延伸時(shí)間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α淀粉酶的mRNA的部分堿基序列： 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含________個(gè)密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測(cè)虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有________種。 (5)獲得工程菌表達(dá)的α淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性，結(jié)果如下： 緩沖液 50 mmol/L Na2HPO4KH2PO4 50 mmol/L TrisHCl 50 mmol/L GlyNaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對(duì)活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該α淀粉酶活性最高的條件為_________________________。 答案　(1)基因組DNA　(2)5′　使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連　(3)②?、蕖?4)8　13　(5)pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L TrisHCl 解析　(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的基因組DNA作為模板，并依據(jù)α淀粉酶基因兩端的部分核苷酸序列合成兩條引物。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，只能從3′端延伸DNA子鏈，為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的5′端加上限制性酶切位點(diǎn)，并且要注意在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，這樣既能防止目的基因、載體的自身連接，又能確保目的基因與表達(dá)載體的定向連接。(3)PCR技術(shù)包括變性、退火(復(fù)性)和延伸三步，變性溫度決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA的解鏈，且時(shí)間很短；退火時(shí)引物結(jié)合到互補(bǔ)的DNA單鏈上，退火溫度由引物復(fù)性溫度決定，其溫度設(shè)定與引物的長(zhǎng)度、堿基組成及濃度等有關(guān)；延伸時(shí)間與產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度有關(guān)。(4)圖中虛線框內(nèi)共含有24個(gè)堿基，mRNA上3個(gè)相鄰的堿基編碼1個(gè)氨基酸，故共包含8個(gè)密碼子。虛線框后的第1個(gè)密碼子的第1個(gè)堿基是U，第2和第3個(gè)堿基各有4種可能性，因此共有16種可能性。題干表明控制α淀粉酶的基因有1 656個(gè)堿基對(duì)，說明圖中虛線框后的第一個(gè)密碼子肯定不是終止密碼子(3種終止密碼子為UAA、UAG、UGA)，故虛線框后第一個(gè)密碼子實(shí)際最多有16－3＝13種可能性。(5)分析表格中的數(shù)據(jù)，酶相對(duì)活性最高為99.5%，對(duì)應(yīng)的條件是pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L TrisHCl。 2．(2017江蘇，33)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì)劃通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬?gòu)U水的凈化處理。PCR 擴(kuò)增過程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問題： (1)從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過__________獲得________用于PCR擴(kuò)增。 (2)設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物(引物1和引物2)，為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)腳___________________位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成________________，而造成引物自連。 (3)圖中步驟1代表________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。 (4)PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會(huì)破壞______________的堿基配對(duì)。退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但__________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。 (5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有________(填序號(hào)：①升高退火溫度?、诮档屯嘶饻囟取、壑匦略O(shè)計(jì)引物)。 答案　(1)逆轉(zhuǎn)錄　cDNA　(2)限制性核酸內(nèi)切酶　堿基互補(bǔ)配對(duì)　(3)變性　(4)引物與模板之間　GC堿基含量高　(5)②③ 解析　(1)由mRNA獲得目的基因片段需通過逆轉(zhuǎn)錄，獲得的基因片段為cDNA。(2)為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，宜在引物中增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)，以便使復(fù)制出的目的基因兩端含限制酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)引物時(shí)，需避免引物之間堿基互補(bǔ)配對(duì)，而造成引物間自連。(3)圖中步驟1為高溫下實(shí)現(xiàn)DNA變性解鏈。(4)PCR擴(kuò)增時(shí)，若退火溫度過高則會(huì)破壞引物與模板間的堿基互補(bǔ)配對(duì)。DNA片段中A與T間形成兩個(gè)氫鍵，而G與C間可形成三個(gè)氫鍵，GC堿基含量越高時(shí)DNA分子越穩(wěn)定，其退火溫度就越高。(5)若PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可通過降低退火溫度及重新設(shè)計(jì)引物等措施，以便使引物與模板結(jié)合，從而進(jìn)行后序擴(kuò)增過程。 3．(2016江蘇，33)下表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列問題： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識(shí)別序列 及切割位點(diǎn) ↓　　　 G GATC C C CTAG G 　　　↑ ↓　　　 T GATC A A CTAG T 　　　↑ ↓　　　 GATC CTAG 　　　↑ ↓　　　 A AGCT T T TCGA A 　　　↑ (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于________態(tài)的大腸桿菌。 (2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長(zhǎng)出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為________，對(duì)于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接　感受 (2)四環(huán)素　引物甲和引物丙 (3)　都不能　(4)7 解析　(1)選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識(shí)別位點(diǎn)，且至少有一個(gè)標(biāo)記基因，BamHⅠ會(huì)破壞兩個(gè)標(biāo)記基因，因此只能選BclⅠ和HindⅢ。酶切后的載體和目的基因片段，通過DNA連接酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于感受態(tài)的大腸桿菌。(2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，根據(jù)質(zhì)粒上的抗性基因，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素。PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈。(3)根據(jù)BamH Ⅰ和Bcl Ⅰ的酶切位點(diǎn)，BamH Ⅰ酶切的DNA末端與Bcl Ⅰ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為，與兩種酶的酶切位點(diǎn)均不同。(4)根據(jù)BamHⅠ、BclⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點(diǎn)，Sau3AⅠ在質(zhì)粒上有三個(gè)酶切位點(diǎn)，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點(diǎn)被切開，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。 4．(2015江蘇，33)熒光原位雜交可用熒光標(biāo)記的特異DNA片段為探針，與染色體上對(duì)應(yīng)的DNA片段結(jié)合，從而將特定的基因在染色體上定位。請(qǐng)回答下列問題： (1)DNA熒光探針的制備過程如圖1所示，DNA酶Ⅰ隨機(jī)切開了核苷酸之間的__________鍵從而產(chǎn)生切口，隨后在DNA聚合酶Ⅰ作用下，以熒光標(biāo)記的____________為原料，合成熒光標(biāo)記的DNA探針。 (2)圖2表示探針與待測(cè)基因結(jié)合的原理。先將探針與染色體共同煮沸，使DNA雙鏈中________鍵斷裂，形成單鏈。隨后在降溫復(fù)性過程中，探針的堿基按照________________________原則，與染色體上的特定基因序列形成較穩(wěn)定的雜交分子。圖中兩條姐妹染色單體中最多可有________條熒光標(biāo)記的DNA片段。 (3)A、B、C分別代表不同來源的一個(gè)染色體組，已知AA和BB中各有一對(duì)同源染色體可被熒光探針標(biāo)記。若植物甲(AABB)與植物乙(AACC)雜交，則其F1有絲分裂中期的細(xì)胞中可觀察到________個(gè)熒光點(diǎn)；在減數(shù)第一次分裂形成的兩個(gè)子細(xì)胞中分別可觀察到________個(gè)熒光點(diǎn)。 答案　(1)磷酸二酯　脫氧核苷酸　(2)氫　堿基互補(bǔ)配對(duì)　4　(3)6　2和4 解析　(1)由圖1所知，DNA酶Ⅰ使DNA鏈斷裂，即該酶作用于相鄰脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵；DNA探針的本質(zhì)是被熒光標(biāo)記的DNA片段，合成原料為脫氧核苷酸。(2)通過熱變性，使DNA堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，復(fù)性時(shí)能重新形成氫鍵，并且遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，形成雜交DNA分子。兩條姐妹染色單體中含有四條模板鏈，最多可與四個(gè)被熒光標(biāo)記的DNA探針結(jié)合形成4條熒光標(biāo)記的DNA片段。(3)植物甲(AABB)形成的配子染色體組成為AB，植物乙AACC的配子染色體組成為AC，受精后的合子染色體組成為(AABC)，又由于 AA 和 BB 中各有一對(duì)同源染色體可被熒光探針標(biāo)記，則AABC將會(huì)有3條染色體被標(biāo)記，在有絲分裂中期即可觀察到6條染色單體上的6個(gè)熒光點(diǎn)。該植株(AABC)細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，AA染色體組可以正常聯(lián)會(huì)，并且會(huì)發(fā)生同源染色體分離，減數(shù)第一次分裂形成的兩個(gè)子細(xì)胞分別獲得一個(gè)A染色體組，而B染色體組內(nèi)沒有同源染色體存在，B中的染色體隨機(jī)進(jìn)入兩個(gè)子細(xì)胞中，因此其中一個(gè)子細(xì)胞含有A和B染色體組內(nèi)含有2條能被標(biāo)記的染色體，即可標(biāo)記4條染色單體，可以看到4個(gè)熒光點(diǎn)；另一子細(xì)胞只含有A中1條能被標(biāo)記的染色體，即2條染色單體，可以觀察到2個(gè)熒光點(diǎn)。 5．(2015江蘇，32)胰島素A、B鏈分別表達(dá)法是生產(chǎn)胰島素的方法之一。圖1是該方法所用的基因表達(dá)載體，圖2表示利用大腸桿菌作為工程菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程(融合蛋白A、B分別表示β半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白)。請(qǐng)回答下列問題： (1)圖1基因表達(dá)載體中沒有標(biāo)注出來的基本結(jié)構(gòu)是__________。 (2)圖1中啟動(dòng)子是____________酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動(dòng)目的基因的表達(dá)；氨芐青霉素抗性基因的作用是________________________________________________。 (3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)必需的工具酶有___________________________________。 (4)β半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達(dá)，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點(diǎn)隱藏在內(nèi)部，其意義在于____________________________________________________。 (5)溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，用溴化氰處理相應(yīng)的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β半乳糖苷酶被切成多個(gè)肽段，這是因?yàn)開_________________________ ________________________________________________________________________。 (6)根據(jù)圖2中胰島素的結(jié)構(gòu)，請(qǐng)推測(cè)每個(gè)胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量。你的推測(cè)結(jié)果是________，理由是_______________________________________________________。 答案　(1)終止子　(2)RNA聚合　作為標(biāo)記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來　(3)限制酶和DNA連接酶　(4)防止胰島素的A、B 鏈被菌體內(nèi)的蛋白酶降解 (5)β半乳糖苷酶中含多個(gè)甲硫氨酸，而胰島素A、B 鏈中不含甲硫氨酸　(6)至少2個(gè)　兩條肽鏈的一端各有一個(gè)游離的氨基，氨基酸R 基團(tuán)中可能還含有游離的氨基 解析　(1)基因表達(dá)載體包含啟動(dòng)子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因等。(2)啟動(dòng)子是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。氨芐青霉素抗性基因可作為標(biāo)記基因。(3)基因工程中使用的工具酶包括限制酶和DNA 連接酶。(4)胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點(diǎn)隱藏起來，將無法被蛋白酶所識(shí)別，防止被水解。(5)溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，若經(jīng)溴化氰處理相應(yīng)融合蛋白能獲得完整的A鏈和B鏈，表明胰島素A鏈、B鏈上并無溴化氰作用位點(diǎn)，溴化氰不能將胰島素A鏈、B鏈切斷；同理，β半乳糖苷酶能被切成“多個(gè)肽段”，表明其具有多個(gè)切點(diǎn)(即“甲硫氨酸”)。(6)胰島素分子含有兩條鏈，至少有2個(gè)游離氨基分別位于2條肽鏈的一端，并且R 基團(tuán)中可能也含有游離的氨基。 6．(2014江蘇，29)為了獲得植物次生代謝產(chǎn)物，先用植物外植體獲得愈傷組織，然后在液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。請(qǐng)回答下列問題： (1)外植體經(jīng)誘導(dǎo)后形成愈傷組織的過程稱為______________________________。 (2)在愈傷組織懸浮培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞干重、蔗糖濃度和pH的變化如下圖所示。細(xì)胞干重在12 d后下降的原因有________________________________；培養(yǎng)液中蔗糖的作用是________________、________________。 (3)多倍體愈傷組織細(xì)胞產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物量常高于二倍體。二倍體愈傷組織細(xì)胞經(jīng)______________處理，會(huì)產(chǎn)生染色體加倍的細(xì)胞。為檢測(cè)愈傷組織細(xì)胞染色體數(shù)目，壓片前常用纖維素酶和________酶解離愈傷組織。若愈傷組織細(xì)胞(2n)經(jīng)誘導(dǎo)處理后，觀察到染色體數(shù)為8n的細(xì)胞，合理的解釋是_____________________、__________________。 (4)為了更好地獲得次生代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)中采用植物細(xì)胞的固定化技術(shù)，其原理與酵母細(xì)胞固定化類似。下列說法正確的有________(填序號(hào))。 ①選取旺盛生長(zhǎng)的愈傷組織細(xì)胞包埋?、诒仨氃诠庹諚l件下培養(yǎng)　③培養(yǎng)過程中需通空氣?、芄潭ɑ笾参锛?xì)胞生長(zhǎng)會(huì)變慢 答案　(1)脫分化　(2)蔗糖濃度下降，pH降低　提供能量　調(diào)節(jié)滲透壓　(3)秋水仙素(低溫)　果膠　經(jīng)加倍到4n的細(xì)胞處于有絲分裂后期　經(jīng)加倍到8n的細(xì)胞處于有絲分裂中期　(4)①③④ 解析　(1)外植體經(jīng)誘導(dǎo)形成愈傷組織的過程稱為脫分化。(2)觀察圖示可知，12 d后蔗糖濃度和pH都下降到較低水平，影響能量的供應(yīng)和酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞干重下降。另外，培養(yǎng)液中的蔗糖還具有調(diào)節(jié)滲透壓的作用。(3)在細(xì)胞分裂過程中，用低溫或秋水仙素處理，都可抑制紡錘體的形成，使細(xì)胞中染色體數(shù)目加倍。愈傷組織的細(xì)胞之間含有纖維素和果膠，欲將其分散成單個(gè)細(xì)胞，壓片前需用纖維素酶和果膠酶處理。愈傷組織細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)處理后，有的細(xì)胞染色體數(shù)目加倍(4n)，有的細(xì)胞染色體數(shù)目未加倍(2n)，也可能有的細(xì)胞在連續(xù)分裂中每次都因低溫或秋水仙素的作用抑制了紡錘體的形成，導(dǎo)致細(xì)胞中染色體數(shù)目連續(xù)加倍，出現(xiàn)染色體數(shù)目為8n的細(xì)胞。所以染色體數(shù)目加倍到4n的細(xì)胞處于有絲分裂后期時(shí)染色體數(shù)目為8n，染色體數(shù)目加倍到8n的細(xì)胞處于有絲分裂中期時(shí)染色體數(shù)目也為8n。(4)為了更好地獲得次生代謝產(chǎn)物，應(yīng)選用生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織。愈傷組織細(xì)胞內(nèi)無葉綠體，無法進(jìn)行光合作用，因此不需要光照；培養(yǎng)過程要通入無菌空氣，確保細(xì)胞正常生命活動(dòng)的進(jìn)行。細(xì)胞的固定化通常使用包埋法，由于包埋材料的影響，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的擴(kuò)散都受到一定的影響，所以固定化后植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢。 7．(2018全國(guó)Ⅰ，38)回答下列問題： (1)博耶( H. Boyer)和科恩(S. Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。該研究除證明了質(zhì)?？梢宰鳛檩d體外，還證明了_______________ ________________________________________________________________________ _____________________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)。 (2)體外重組的質(zhì)?？赏ㄟ^Ca2＋參與的______________方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與______________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是________。 (3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用________________的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加________的抑制劑。 答案　(1)體外重組的質(zhì)?？梢赃M(jìn)入受體細(xì)胞；真核生物的基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)　(2)轉(zhuǎn)化　外殼蛋白(或噬菌體蛋白)　細(xì)菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶 解析　(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，該過程證明了體外重組的質(zhì)?？梢赃M(jìn)入受體細(xì)胞，真核生物的基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)等。(2)體外重組的質(zhì)?？赏ㄟ^Ca2＋處理，目的是增大細(xì)胞的通透性，使重組的質(zhì)粒能夠?qū)氲绞荏w細(xì)胞內(nèi)，因此體外重組的質(zhì)?？赏ㄟ^Ca2＋參與的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞。體外重組的噬菌體DNA通常需與蛋白質(zhì)外殼組裝成完整的噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組噬菌體DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，噬菌體侵染并寄生在細(xì)菌中，而不能寄生在其他細(xì)胞中，因此可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是細(xì)菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被酶降解，為防止蛋白質(zhì)被降解，可以選用不能產(chǎn)生該蛋白酶的缺陷細(xì)菌以及使用能夠抑制蛋白酶活性的藥物，因此為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加蛋白酶的抑制劑。 8．(2018全國(guó)Ⅲ，38)2018年《細(xì)胞》期刊報(bào)道，中國(guó)科學(xué)家率先成功地應(yīng)用體細(xì)胞對(duì)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)行克隆，獲得兩只克隆猴——“中中”和“華華”。回答下列問題： (1)“中中”和“華華”的獲得涉及核移植過程，核移植是指_________________。通過核移植方法獲得的克隆猴，與核供體相比，克隆猴體細(xì)胞的染色體數(shù)目______(填“減半”“加倍”或“不變”)。 (2)哺乳動(dòng)物的核移植可以分為胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植，胚胎細(xì)胞核移植獲得克隆動(dòng)物的難度________(填“大于”或“小于”)體細(xì)胞核移植，其原因是________________。 (3)在哺乳動(dòng)物核移植的過程中，若分別以雌性個(gè)體和雄性個(gè)體的體細(xì)胞作為核供體，通常，所得到的兩個(gè)克隆動(dòng)物體細(xì)胞的常染色體數(shù)目________(填“相同”或“不同”)，性染色體組合________(填“相同”或“不同”)。 答案　(1)將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞核，移入一個(gè)已去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中　不變　(2)小于　胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性相對(duì)容易　(3)相同　不同 解析　(1)核移植是指將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞核，移入一個(gè)已去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，形成重組細(xì)胞。重組細(xì)胞形成的早期胚胎可移植到受體子宮內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育，最終分娩得到克隆動(dòng)物。因?yàn)槿旧w在細(xì)胞核中，所以克隆動(dòng)物體細(xì)胞的染色體數(shù)目與提供細(xì)胞核的個(gè)體的體細(xì)胞相同。 (2)由于動(dòng)物的胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性相對(duì)容易，而動(dòng)物的體細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性十分困難，因此，動(dòng)物體細(xì)胞核移植的難度明顯高于胚胎細(xì)胞核移植。 (3)哺乳動(dòng)物雌雄個(gè)體的體細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)常染色體的數(shù)目是相同的，性染色體組合是不同的。若分別以雌性個(gè)體和雄性個(gè)體的體細(xì)胞作為核供體，則得到的克隆動(dòng)物的體細(xì)胞中常染色體的數(shù)目相同，性染色體組合不同。 模擬對(duì)位練(B卷) 1．(2018江蘇揚(yáng)、通、泰、徐、淮、宿、連七市高三調(diào)研)研究人員為探究紫檀芪對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)理，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)一：紫檀芪對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖影響研究 取等量旺盛增殖的胃癌細(xì)胞，分別接種到含不同濃度紫檀芪的培養(yǎng)液中，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞。運(yùn)用臺(tái)盼藍(lán)拒染法統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算癌細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果如圖1(癌細(xì)胞增殖抑制率＝100%)。 實(shí)驗(yàn)二：紫檀芪對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響研究　用含不同濃度紫檀芪的培養(yǎng)液培養(yǎng)旺盛增殖的胃癌細(xì)胞。48 h后電泳比較幾種細(xì)胞凋亡指示蛋白的含量(Caspase9是一種凋亡啟動(dòng)因子；Bax能引起線粒體穿孔導(dǎo)致線粒體內(nèi)物質(zhì)外流；Bcl2蛋白是細(xì)胞存活促進(jìn)因子，能抑制細(xì)胞凋亡)，結(jié)果如圖2。 請(qǐng)回答下列問題： (1)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液中加入胎牛血清的作用是________________________，培養(yǎng)箱中充入5% CO2的作用是__________________。在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)不能使用胃蛋白酶的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)實(shí)驗(yàn)一中用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞存活率時(shí)，活細(xì)胞未被染成藍(lán)色是因?yàn)開_______________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 根據(jù)圖1結(jié)果，研究人員建議臨床上選擇濃度為40 μmol/L的紫檀芪進(jìn)行化療，其依據(jù)是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________， 為了達(dá)到更理想的治療效果還需要注意___________________________________。 (3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)二結(jié)果分析，紫檀芪能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)理有________________________ _________________________________________________________(至少答兩點(diǎn))。 答案　(1)補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)所需的未知營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)　維持培養(yǎng)液的pH基本穩(wěn)定　動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液pH在7.2～7.4之間，在此pH條件下胃蛋白酶已經(jīng)變性失活　(2)活細(xì)胞的細(xì)胞膜具有選擇透過性，臺(tái)盼藍(lán)分子不能被細(xì)胞吸收　紫檀芪使用濃度較低，相對(duì)副作用較小，同時(shí)該濃度處理對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率也比較高　持續(xù)給藥　(3)促進(jìn)Caspase9前體轉(zhuǎn)化為Caspase9，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡；加速Bax合成，引起線粒體破壞；抑制Bcl2基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等 解析　(1)在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)液中加入動(dòng)物血清的主要作用是補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的未知營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。通入CO2的作用是維持培養(yǎng)液pH的基本穩(wěn)定。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的pH條件下，胃蛋白酶已經(jīng)變性失活。(2)臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)活細(xì)胞的原理是：活細(xì)胞的細(xì)胞膜具有選擇透過性，臺(tái)盼藍(lán)分子不能進(jìn)入活細(xì)胞。在臨床上，治療藥物劑量的選擇以用藥安全、有效且副作用小為前提，因此，臨床治療時(shí)紫檀芪濃度選擇40 μmol/L。但由于該濃度時(shí)，紫檀芪對(duì)癌細(xì)胞的抑制率有限，因此需要注意持續(xù)給藥一段時(shí)間。(3)分析圖2，當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞中Bax蛋白增多、Bcl－2蛋白減少、 Caspase9前體轉(zhuǎn)化為Caspase9。 2．豆科植物細(xì)胞壁中含有大量不能被豬消化的甘露聚糖。研究人員通過基因工程等技術(shù)培育出轉(zhuǎn)甘露聚糖酶基因(manA)豬，主要流程如圖，圖中PSP為豬唾液腺分泌蛋白基因啟動(dòng)子，neo為新霉素抗性基因。請(qǐng)回答下列問題： (1)步驟①PCR過程中加入引物的原因是Taq酶___________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)步驟②中選擇將manA基因插入PSP后面的目的是__________________________。 步驟③常用的方法是______________。步驟④中使用的豬卵母細(xì)胞應(yīng)處于____________________期。 (3)步驟⑤前需要對(duì)受體豬群進(jìn)行同期發(fā)情處理，其目的是______________________。 步驟⑥中，科研人員發(fā)現(xiàn)選擇4～6細(xì)胞期的胚胎進(jìn)行移植成功率最高，最可能的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)與飼養(yǎng)普通豬相比，飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因豬的優(yōu)勢(shì)是________________________。 (5)有人提出本研究中使用新霉素抗性基因作為標(biāo)記基因可能會(huì)引起安全性問題，因此最好在圖示步驟______操作前利用相關(guān)技術(shù)敲除neo基因。 答案　(1)只能催化單個(gè)脫氧核苷酸連接到已有的脫氧核苷酸鏈上　(2)使manA基因能在唾液腺細(xì)胞中旺盛表達(dá)并分泌　顯微注射法　減數(shù)第二次分裂中　(3)使受體豬群在預(yù)定時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情　正常情況下豬的受精卵在發(fā)育至4～6細(xì)胞階段時(shí)進(jìn)入子宮　(4)提高飼料的利用率，降低飼養(yǎng)成本　(5)④ 解析　(1)Taq酶是耐高溫的DNA聚合酶，DNA聚合酶只能催化單個(gè)脫氧核苷酸連接到已有的脫氧核苷酸鏈上，因此通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)需加入一小段DNA片段作為引物。(2)根據(jù)題意，PSP為豬唾液腺分泌蛋白基因啟動(dòng)子，步驟②中選擇將manA基因插入PSP后面的目的是使manA基因能在唾液腺細(xì)胞中旺盛表達(dá)并分泌。基因工程中將基因表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞(步驟③)常用的方法是顯微注射法。進(jìn)行核移植時(shí)常用處于減數(shù)第二次分裂中期的次級(jí)卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞。(3)步驟⑤進(jìn)行早期胚胎培養(yǎng)前需要對(duì)受體豬群進(jìn)行同期發(fā)情處理，目的是使受體豬群在預(yù)定時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情，有利于為植入胚胎的發(fā)育提供適宜的生理基礎(chǔ)。步驟⑥胚胎移植過程中，選擇4～6細(xì)胞期的胚胎進(jìn)行移植成功率最高，最可能的原因是正常情況下豬的受精卵在發(fā)育至4～6細(xì)胞階段時(shí)進(jìn)入子宮(著床)。(4)根據(jù)題意，轉(zhuǎn)甘露聚糖酶基因(manA)豬可以分解利用豆科植物細(xì)胞壁中的甘露聚糖，與飼養(yǎng)普通豬相比，飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因豬的優(yōu)勢(shì)是提高了飼料的利用率，降低飼養(yǎng)成本。(5)利用相關(guān)技術(shù)敲除neo基因最好在步驟④核移植之前完成，這樣做的好處是既利用了neo基因作為標(biāo)記基因，又可以最大限度地減少需進(jìn)行基因敲除的細(xì)胞數(shù)量，還可以防止基因敲除操作損傷重組細(xì)胞或早期胚胎。 3．(2018蘇錫常鎮(zhèn)四市調(diào)研)紫杉醇是從紅豆杉中提取的一種高效抗癌的藥物，雖然能造福人類，但卻為瀕危的紅豆杉帶來一場(chǎng)滅頂之災(zāi)。為了緩解紅豆杉資源匱乏的現(xiàn)狀，科研人員開展了系列研究，下表為利用赤霉素(GA3)誘導(dǎo)紅豆杉枝條生根的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。試分析并回答問題： 組別 GA3濃度(mg/L) 培養(yǎng)枝條(株) 生根所需的時(shí)間(d) 平均根數(shù)(條) 1 0 10 45 3.52 2 200 10 36 10.24 3 400 10 24 29.76 4 600 10 27 21.86 5 800 10 36 14.12 6 1 000 10 42 7.62 (1)為了使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更精確，該實(shí)驗(yàn)中的紅豆杉根系培養(yǎng)宜采用________(填“水培”或“土培”)法培養(yǎng)。 (2)表中__________________指標(biāo)可說明一定濃度的GA3可以________(填“促進(jìn)”或“抑制”)紅豆杉生根，并可推測(cè)GA3與生長(zhǎng)素在調(diào)節(jié)植物生根方面具有________作用。從表中________(填“能”或“不能”)得出“GA3對(duì)紅豆杉生根的作用具有兩重性”這一結(jié)論。 (3)除了直接從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇外，還可以利用________________技術(shù)從________組織中提取紫杉醇，從而拯救紅豆杉。 答案　(1)水培　(2)生根所需的時(shí)間(或平均根數(shù))　促進(jìn)　協(xié)同　不能　(3)植物組織培養(yǎng)　愈傷 解析　(1)由題意可知，該實(shí)驗(yàn)以紅豆杉枝條平均生根數(shù)量為因變量并作為觀察指標(biāo)，因此采用水培法培養(yǎng)紅豆杉枝條更利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)。(2)分析表中生根所需的時(shí)間或平均根數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)可知，與空白對(duì)照相比，一定濃度的GA3可以促進(jìn)紅豆杉枝條生根。根據(jù)生長(zhǎng)素和GA3都可以促進(jìn)扦插枝條生根可推測(cè)，GA3與生長(zhǎng)素在調(diào)節(jié)植物生根方面，具有協(xié)同作用。從表中數(shù)據(jù)只能看出一定濃度的GA3對(duì)紅豆杉生根有促進(jìn)作用，不能看出高濃度GA3對(duì)紅豆杉生根有抑制作用，因此不能得出“GA3對(duì)紅豆杉生根的作用具有兩重性”這一結(jié)論。(3)除了直接從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇外，還可以利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)愈傷組織的細(xì)胞，從愈傷組織細(xì)胞中提取紫杉醇。 4．(2017東臺(tái)一中期末)鐮刀型細(xì)胞貧血癥是一種單基因遺傳病，患者的血紅蛋白分子β－肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸代替，導(dǎo)致功能異常?；卮鹣铝袉栴}： (1)異常血紅蛋白的氨基酸序列改變的根本原因是編碼血紅蛋白基因的________________序列發(fā)生改變。 (2)將正常的血紅蛋白基因?qū)牖颊叩墓撬柙煅杉?xì)胞中，可以合成正常的血紅蛋白達(dá)到治療的目的。此操作________________(填“屬于”或“不屬于”)蛋白質(zhì)工程，理由是該操作________________________________________________________________________。 (3)用基因工程方法制備血紅蛋白時(shí)，可先提取早期紅細(xì)胞中的____________，以其作為模板，在____________酶的作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA與載體需在限制酶和________________酶的作用下，構(gòu)建基因表達(dá)載體，導(dǎo)入受體菌后進(jìn)行表達(dá)。 (4)檢測(cè)受體菌是否已合成血紅蛋白，可從受體菌中提取____________，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行______________雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則表明該受體菌已合成血紅蛋白。 答案　(1)堿基對(duì)(或脫氧核苷酸)　(2)不屬于　沒有對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造(或沒有對(duì)基因進(jìn)行修飾) (3)mRNA(或RNA)　逆轉(zhuǎn)錄　DNA連接　(4)蛋白質(zhì)　抗原—抗體 解析　(1)編碼血紅蛋白的基因中因堿基對(duì)的替換導(dǎo)致編碼的氨基酸種類改變。(2)蛋白質(zhì)工程是通過基因修飾或基因合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造或制造出新的蛋白質(zhì)。此操作不屬于蛋白質(zhì)工程。(3)因血紅蛋白基因只在早期紅細(xì)胞中表達(dá)，所以可從其中提取mRNA，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。構(gòu)建基因表達(dá)載體需要限制酶和DNA連接酶。(4)目的基因是否表達(dá)可以通過從受體菌中提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行抗原—抗體雜交實(shí)驗(yàn)加以判斷。 5．(2018鹽城高三第三次調(diào)研)薄荷可產(chǎn)生蚜蟲報(bào)警信息素EβF，用于驅(qū)散蚜蟲并吸引蚜蟲的天敵。通過基因工程可制備含EβF合成酶基因的轉(zhuǎn)基因抗蚜麥。請(qǐng)回答問題： (1)薄荷利用EβF驅(qū)散蚜蟲并吸引蚜蟲的天敵，體現(xiàn)了生態(tài)系統(tǒng)的信息傳遞具有__________________________、維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的功能。 (2)若利用PCR技術(shù)獲得EβF合成酶基因，在PCR反應(yīng)體系中需加入____________________、模板序列、原料及兩種____________。如果提取到薄荷細(xì)胞中EβF合成酶的mRNA，則可用____________方法獲取目的基因。 (3)研究者利用4種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如圖所示。酶切后的產(chǎn)物連接時(shí)，目的基因上SalⅠ切割產(chǎn)生的末端應(yīng)與質(zhì)粒上______切割產(chǎn)生的末端相連接。連接完成后，該連接點(diǎn)______(填“能”或“不能”)被這兩種限制酶中的某一種切割。 (4)欲從個(gè)體水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜麥?zhǔn)欠衽嘤晒?，在小麥葉片上接種蚜蟲后，通過觀察葉片上蚜蟲的____________或____________作為判定的依據(jù)。 (5)下列屬于轉(zhuǎn)基因抗蚜麥推廣種植后引發(fā)的安全性問題的是________(多選)。 A．小麥不再感染蚜蟲 B．目的基因向其他生物擴(kuò)散 C．減少殺蟲劑對(duì)環(huán)境的破壞 D．改變現(xiàn)有生態(tài)結(jié)構(gòu) 答案　(1)調(diào)節(jié)生物的種間關(guān)系　(2)耐高溫的DNA聚合酶(或Taq酶)　引物　逆轉(zhuǎn)錄　(3)XhoⅠ　不能　(4)停留時(shí)間　天敵數(shù)量　(5)BD 解析　(1)薄荷利用EβF驅(qū)散蚜蟲并吸引蚜蟲的天敵，體現(xiàn)了信息傳遞具有調(diào)節(jié)種間關(guān)系，維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的功能。(2)通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在PCR體系中需加入模板序列、原料、引物及耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)。以EβF合成酶的mRNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄法可以合成EβF合成酶基因。(3)分析題圖可知，限制酶XhoⅠ和SalⅠ切割DNA后產(chǎn)生的黏性末端相同，可以相互連接；由于連接后連接點(diǎn)的DNA序列中不含限制酶XhoⅠ和SalⅠ的識(shí)別序列，因此完成連接后，連接點(diǎn)不能被限制酶XhoⅠ和SalⅠ切割。(4)根據(jù)題意，EβF可以驅(qū)散蚜蟲并吸引蚜蟲的天敵。欲從個(gè)體水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜麥?zhǔn)欠衽嘤晒?，可在小麥葉片上接種蚜蟲后，通過觀察葉片上蚜蟲停留時(shí)間或天敵數(shù)量作為判斷的依據(jù)。(5)小麥不感染蚜蟲不是安全性問題，A錯(cuò)誤；轉(zhuǎn)基因抗蚜麥與近緣物種雜交可能造成目的基因向其他生物擴(kuò)散，造成基因污染，B正確；推廣轉(zhuǎn)基因抗蚜麥可減少殺蟲劑對(duì)環(huán)境的破壞，有利于保護(hù)環(huán)境，不是安全性問題，C錯(cuò)誤；EβF在生態(tài)系統(tǒng)中擴(kuò)散，可能導(dǎo)致某些物種具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，破壞現(xiàn)有的生態(tài)結(jié)構(gòu)，D正確。 6．(2018南京、鹽城二模)人類是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染的最有效方法。如圖為“轉(zhuǎn)基因酵母乙肝疫苗”的生產(chǎn)過程示意圖，該過程所用酵母菌為畢赤酵母菌，其體內(nèi)無天然質(zhì)粒，科學(xué)家改造出了如圖所示的pPIC9K質(zhì)粒(松弛控制型，復(fù)制不受宿主細(xì)胞控制)用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。請(qǐng)回答下列問題： (1)如果要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上限制酶________________的識(shí)別序列，這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是可避免質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化。步驟1應(yīng)選用________(填“Ecoli”或“T4”)DNA連接酶。 (2)步驟2的目的是____________________________。已知大腸桿菌每20分鐘分裂一次，若1個(gè)大腸桿菌中導(dǎo)入了10個(gè)重組質(zhì)粒，則1小時(shí)后可從1個(gè)大腸桿菌的后 代中得到重組質(zhì)粒的個(gè)數(shù)________(填“30個(gè)”“60個(gè)”或“不確定”)。 (3)步驟4中應(yīng)選用限制酶________切割重組質(zhì)粒以獲得一段線性DNA，然后將其導(dǎo)入畢赤酵母菌細(xì)胞。為了確認(rèn)畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入__________以便篩選。除此以外，還可以用分子雜交技術(shù)鑒定上圖中的畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，過程如圖所示： 根據(jù)圖中顯示結(jié)果推算，若要獲得16個(gè)成功導(dǎo)入該基因的酵母菌菌落，則上圖A中的酵母菌菌落數(shù)至少要為________個(gè)。 (4)已知質(zhì)粒在細(xì)胞傳代過程中有丟失現(xiàn)象，試分析畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性高于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主要原因：______________________________________________。 答案　(1)SnaBⅠ和AvrⅡ　T4　(2)獲得大量重組質(zhì)粒(擴(kuò)增)　不確定　(3)BglⅡ　卡那霉素　120　(4)目的基因整合到酵母染色體上，不易丟失 解析　(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)不能破壞啟動(dòng)子等重要結(jié)構(gòu)，且應(yīng)該將目的基因插入到質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間，因此，應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ的識(shí)別序列。由于SnaBⅠ和AvrⅡ識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)不同，這樣設(shè)計(jì)可避免酶切后質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化。由于SnaBⅠ和AvrⅡ?qū)NA酶切后分別形成平末端和黏性末端，而Ecoli DNA連接酶只能連接黏性末端，T4 DNA連接酶既可以連接黏性末端也可以連接平末端，因此，步驟1應(yīng)選用T4 DNA連接酶。(2)步驟2的目的是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，使重組質(zhì)粒大量擴(kuò)增。根據(jù)題意可知，pPIC9K質(zhì)粒為松弛控制型，其在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制不受宿主細(xì)胞控制，因此，不能根據(jù)子代細(xì)菌數(shù)量計(jì)算重組質(zhì)粒的數(shù)量。(3)觀察pPIC9K質(zhì)粒結(jié)構(gòu)可知，為保證酶切后得到的線性DNA可以正常表達(dá)，步驟4中應(yīng)選用限制酶BglⅡ切割重組質(zhì)粒。由于用限制酶BglⅡ切割重組質(zhì)粒后，線性DNA中不含氨芐青霉素抗性基因，只含有卡那霉素抗性基因，因此，為了確認(rèn)畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入卡那霉素以便篩選。圖中結(jié)果顯示，成功導(dǎo)入該基因的酵母菌菌落占全部菌落的比為，因此，若要獲得16個(gè)成功導(dǎo)入該基因的酵母菌菌落，圖A中的酵母菌菌落數(shù)至少為16＝120(個(gè))。(4)大腸桿菌屬于原核生物，細(xì)胞內(nèi)無染色體，目的基因在大腸桿菌體內(nèi)易丟失；畢赤酵母菌是真核生物，細(xì)胞內(nèi)有染色體，導(dǎo)入其體內(nèi)的目的基因會(huì)整合到酵母染色體上，不易丟失，這是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性高于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主要原因。