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基因工程的基本操作程序 基因操作的基本步驟 基因工程基本操作的四個(gè)步驟 1 目的基因的獲取 2 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 3 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 4 目的基因的檢測(cè)與鑒定 基因操作的基本步驟 一 目的基因的獲取 目的基因主要是 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 獲取目的基因的常用方法有哪些 1 從基因文庫(kù)中獲取 2 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增 3 人工合成 1 從基因文庫(kù)中獲取目的基因 1 基因文庫(kù)的概念 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷 導(dǎo)入到受體菌的群體中 各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因 2 基因文庫(kù)的種類 基因組文庫(kù) 含有一種生物的全部基因 部分基因文庫(kù) 只包含了一種生物的部分基因 如 cDNA文庫(kù) 基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系 3 基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù) 某生物體內(nèi)全部DNA 許多DNA片段 受體菌群體 與運(yùn)載體連接導(dǎo)入 基因組文庫(kù) cDNA 受體菌群體 與運(yùn)載體連接導(dǎo)入 cDNA文庫(kù) 某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA 基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù) cDNA文庫(kù) 比較 怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢 依據(jù) 目的基因的有關(guān)信息 如 根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性 4 從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法 1 構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)時(shí) 首先應(yīng)分離細(xì)胞的A 染色體DNAB 線粒體DNAC 總mRNAD tRNA 2 目的基因可從基因文庫(kù)中獲得 下列有關(guān)基因文庫(kù)的描述正確的是A 某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫(kù)B 將含有某種生物不同的許多DNA片段 導(dǎo)入某個(gè)生物體內(nèi) 則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫(kù)C 含有一種生物所有基因的基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù)D 含有一種生物的一部分基因的基因文庫(kù)叫cDNA文庫(kù) A C 2 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù) 通過此技術(shù) 可獲取大量的目的基因 以 方式擴(kuò)增 即 n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù) 指數(shù) 2n 方式 使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增 結(jié)果 原理 DNA雙鏈復(fù)制 PCR技術(shù) 前提 條件 PCR擴(kuò)增儀 一段已知目的基因的核苷酸序列 模板DNA DNA引物 四種脫氧核苷酸 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 Taq酶 PCR技術(shù)的操作過程 a DNA變性 90 95 雙鏈DNA模板在熱作用下 斷裂 形成 b 退火 復(fù)性55 65 系統(tǒng)溫度降低 引物與DNA模板結(jié)合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成與模板互補(bǔ)的 氫鍵 單鏈DNA 雙鏈 DNA鏈 d 重復(fù)a b c步驟 每重復(fù)一次 目的基因增加 倍 一 PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 四種脫氧核苷酸 模板 酶 ATP 四種脫氧核苷酸 模板 酶 引物 DNA在高溫下變性解旋 解旋酶催化解旋 半保留復(fù)制 邊解旋邊復(fù)制 半保留復(fù)制 全解旋再?gòu)?fù)制 體外復(fù)制 主要在細(xì)胞核內(nèi) 大量的DNA片段 形成整個(gè)DNA分子 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶 解旋酶等 反轉(zhuǎn)錄法 目的基因的信使RNA 目的基因 化學(xué)合成法 肽鏈氨基酸序列 信使RNA序列 基因的核苷酸序列 目的基因 合成 推測(cè) 推測(cè) 單鏈DNA 合成 3 人工合成 化學(xué)合成法 基因較小 核苷酸序列已知 可以利用DNA合成儀人工合成 變式遷移 1 多選 下圖表示限制酶切割某DNA的過程 從圖中可知 該限制酶能識(shí)別的堿基序列及切點(diǎn)是 A CTTAAGB GAATTCC 切點(diǎn)在G和A之間D 切點(diǎn)在C和T之間 P4 2 在遺傳工程中 若有一個(gè)控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG TACAC 要使其數(shù)量增多 可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制 復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是 雙鏈DNA分子為模板 ATGTG或TACAC模板鏈 四種脫氧核苷酸 四種核苷酸 DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 引物 溫度變化 恒溫A B C D D 3 在基因工程中 把選出的目的基因 共1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì) 其中腺嘌呤脫氧核苷酸是460個(gè) 放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4代 那么 在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是A 540個(gè)B 8100個(gè)C 17280個(gè)D 7560個(gè) B 1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì) 即2000個(gè)核苷酸 由于A T 460個(gè) 所以 C G 540個(gè) 所以 一個(gè)目的基因有胞嘧啶脫氧核苷酸540個(gè) 擴(kuò)增4代可產(chǎn)生16個(gè)DNA分子 根據(jù)DNA半保留復(fù)制原則 其中有一個(gè)DNA分子 相當(dāng) 于親代的DNA 所以 在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸數(shù)為 16 1 540 8100個(gè) 4 在已知序列信息的情況下 獲取目的基因的最方便方法是A 化學(xué)合成法B 基因組文庫(kù)法C cDNA文庫(kù)法D 聚合酶鏈反應(yīng) 5 下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是 從基因文庫(kù)中獲取目的基因 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 反轉(zhuǎn)錄法 通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A B C D A D 二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心 1 目的 所需物質(zhì) 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在 并且可以遺傳給下一代 同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用 它們各自的作用是什么 2 基因表達(dá)載體的組成 復(fù)制原點(diǎn) 目的基因 啟動(dòng)子 終止子 標(biāo)記基因 它們各自的作用是什么 啟動(dòng)子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷 它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì)終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因 從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來 載體與表達(dá)載體的區(qū)別 二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段 表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因 啟動(dòng)子 終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶 既用到限制酶切割載體 又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接 兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動(dòng)子 終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞 必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去 注意 啟動(dòng) 終止 轉(zhuǎn)錄 啟動(dòng) 終止 翻譯 作用 位于DNA上 位于mRNA上 位置 DNA片段 三個(gè)相鄰堿基 本質(zhì) 啟動(dòng) 終止 子 啟始 終止 密碼子 三 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 1 轉(zhuǎn)化 2 方法 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法 感受態(tài)細(xì)胞 目的基因進(jìn)入 內(nèi) 并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持 和 的過程 受體細(xì)胞 穩(wěn)定 表達(dá) 1 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn) 易感染雙子葉植物和裸子植物 對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力 原理 Ti質(zhì)粒上的T DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞 并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上 過程 優(yōu)點(diǎn) 經(jīng)濟(jì)和有效 2 基因槍法 3 花粉管通道法 2 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 方法 顯微注射法 程序 目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷?受精卵 顯微注射受精卵新性狀動(dòng)物 3 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 原核生物特點(diǎn) 繁殖快 單細(xì)胞 遺傳物質(zhì)少 方法 用Ca2 處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 四 目的基因的檢測(cè)與鑒定 導(dǎo)入過程完成后 全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎 真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少 目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后 是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá) 不一定 需要檢測(cè) 1 鑒定 分子水平的鑒定 轉(zhuǎn)基因生物的DNA 探針 15N 15N 1 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 基因探針 指用熒光或放射性同位素標(biāo)記的DNA分子 方法 DNA分子雜交技術(shù) 變性 變性 1 鑒定 分子水平的鑒定 變性 方法 分子雜交技術(shù) 2 檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 探針 15N 15N 轉(zhuǎn)基因生物的mRNA 1 鑒定 分子水平的鑒定 提取 3 檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 方法 抗原 抗體雜交 Bt毒素蛋白 將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi) 從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體 抗體 蛋白質(zhì) 出現(xiàn)雜交帶 脫分化 組織培養(yǎng) 思考 不能 受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀 才能說明目的基因完成了表達(dá) 受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎 2 鑒定 個(gè)體水平的鑒定 抗蟲 抗病接種實(shí)驗(yàn) 活性比較實(shí)驗(yàn) 例 用棉鈴飼喂棉鈴蟲 如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀 說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá) 如蟲吃后中毒死亡 則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá) 變式遷移 4 下列技術(shù)中不是依據(jù)DNA分子雜交原理的是 A 檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入了受體細(xì)胞B 檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄了mRNAC 檢測(cè)目的基因是否翻譯合成蛋白質(zhì)D 快速靈敏地檢測(cè)飲用水中病毒的含量 C 點(diǎn)評(píng) 1 涉及目的基因的檢測(cè)與鑒定習(xí)題時(shí) 應(yīng)注意審題 辨清是要求從 分子水平 還是從 個(gè)體水平 2 DNA探針及其應(yīng)用 DNA探針是指用熒光或放射性同位素標(biāo)記的DNA分子 其應(yīng)用依據(jù)的原理是DNA分子雜交 應(yīng)用 DNA探針可用來檢測(cè)DNA或RNA分子 因此其應(yīng)用廣泛 如a 從基因文庫(kù)中準(zhǔn)確提取目的基因 b 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因和檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA c 鑒定物種親緣關(guān)系 d 疾病的診斷和治療 e 環(huán)境監(jiān)測(cè) 歸納 基因工程的基本操作程序 獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因 啟動(dòng)子 終止子 標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè) 是否插入 轉(zhuǎn)錄 翻譯鑒定 變式遷移 3 采用基因工程方法培育抗蟲棉 下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是 將毒素蛋白質(zhì)注射到棉花受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到受精卵中 將編碼毒素蛋白質(zhì)的DNA序列 與質(zhì)粒重組 導(dǎo)入細(xì)菌 用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞再進(jìn)行組織培養(yǎng) 將編碼毒素蛋白質(zhì)DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組 注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵A B C D P10 C 點(diǎn)評(píng) 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中有二次拼接和二次導(dǎo)入 第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒上T DNA的中間部位 第二次拼接 非人工操作 指被插入目的基因的T DNA被拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上 第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌 第二次導(dǎo)入 非人工操作 是指含目的基因的T DNA進(jìn)入受體細(xì)胞 2 因?yàn)閯?dòng)物體細(xì)胞的全能性受到一定限制 故一般將目的基因?qū)雱?dòng)物的受精卵或卵細(xì)胞 而不是體細(xì)胞 而植物體細(xì)胞的全能性相對(duì)容易表達(dá) 故一般將目的基因?qū)胫参锏捏w細(xì)胞 然后再通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴(kuò)大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注 我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 1 獲得耐鹽基因后 構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的處 DNA連接酶作用于處 填 a 或 b a a 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴(kuò)大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注 我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 2 將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和法 3 由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用技術(shù) 該技術(shù)的核心是和 4 為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功 既要用放射性同位素標(biāo)記的作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè) 又要用方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性 基因槍法 花粉管通道法 植物組織培養(yǎng) 脫分化 去分化 再分化 耐鹽基因 目的基因 一定濃度鹽水澆灌 移栽到鹽堿地中 基因組文庫(kù)的構(gòu)建 2 基因文庫(kù)的構(gòu)建方法 通過對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 反轉(zhuǎn)錄法 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板 反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA 然后在酶的作用下合成雙鏈DNA 從而獲得所需的基因 目的基因的mRNA 單鏈DNA 反轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 雙鏈DNA 目的基因 1 基因組文庫(kù) 是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段 再與合適的載體在體外重組后 導(dǎo)入受體細(xì)菌的群體中儲(chǔ)存 這個(gè)群體就稱為該生物的基因組文庫(kù) 其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因 一 目的基因的獲取 一 從基因文庫(kù)中直接獲取 1 基因文庫(kù) 1 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 啟動(dòng)子 終止子 啟動(dòng)子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷 它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì)終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 RNA聚合酶 能夠識(shí)別啟動(dòng)子上結(jié)合位點(diǎn)的一種蛋白質(zhì) 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA 能編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列 包括啟動(dòng)子和終止子 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 啟動(dòng)子 終止子 2 真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 內(nèi)含子 外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子 啟動(dòng)子 終止子 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 內(nèi)含子 外顯子 真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 外顯子 能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子 不能編碼蛋白質(zhì)的序列 有調(diào)控作用的核苷酸序列 包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 啟動(dòng)子 非編碼序列 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子 3 原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較 思考 編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì) 原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎 連續(xù) 不連續(xù) 編碼區(qū) 非編碼