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1、第四章 高效液相色譜法 第一節(jié) 概述 一、定義與分類(lèi) 液相色譜是指流動(dòng)相為液體的這類(lèi)色譜法的總稱(chēng)。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC），是一種在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的實(shí)用、快速，高效及高靈敏度的分離分析方法。 根據(jù)固定相的不同，HPLC可分為以下幾類(lèi)： 1、 液－固吸附色譜法 2、 液－液分配色譜法 3、 化學(xué)鍵合相色譜法 4、 離子交換色譜法 5、 離子對(duì)色譜法 6、 凝膠色譜法（又稱(chēng)分子篩色譜法，分子排阻色譜法，尺寸排阻色譜法） 二、HPLC的特點(diǎn)和其它色譜法的比較 （一）與經(jīng)典液相色譜比

2、較 1、 高分離效能 H=A+B/u+Cu (A=2dp，C與dp2呈線(xiàn)性關(guān)系，dp↑→C↑，A↑) 經(jīng)典柱色譜填料顆粒粒徑一般大于100um，顆粒較大，傳質(zhì)擴(kuò)散緩慢，手工裝柱不易裝均勻，渦流擴(kuò)散現(xiàn)象較嚴(yán)重，因此經(jīng)典液相色譜法柱效較低，分離能力差，只能勝任各組分分配系數(shù)相差較大的樣品（各組分性質(zhì)相差較大的樣品）的分離，HPLC填料粒徑一般為5-10μm，傳質(zhì)快，采用高壓均漿技術(shù)裝柱，裝柱均勻性號(hào)，渦流擴(kuò)散小，因此HPLC柱效很高，比經(jīng)典柱色譜高數(shù)百～數(shù)千倍，25cm長(zhǎng)的硅膠柱柱效可達(dá)2萬(wàn)理論塔板，能勝任復(fù)雜物的分離，峰容量大。 2、 快速，省時(shí)，省材料 經(jīng)典柱色譜中的柱子多為一次性

3、使用，且體積大（0.1～2m長(zhǎng)，0.5～5cm粗），分離速度慢（幾小時(shí)～幾周），每次均要重新裝柱，造成人力，物力及時(shí)間上的浪費(fèi)，而一根HPLC柱能重復(fù)使用數(shù)百次，此外，由于配備了高壓輸液泵可實(shí)現(xiàn)快速分析。 3、 靈敏度高，準(zhǔn)確度高，可達(dá)1％的分析精度 柱色譜及薄層色譜（TLC）在進(jìn)行定量分析時(shí)影響因素較多，故準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性均不如高效液相色譜。 HPLC與經(jīng)典液相色譜的比較 HPLC 經(jīng)典液相色譜法 色譜柱入口壓力/MPa 高壓，2 - 20MPa 柱口壓力低,0.001～0.1 固定相粒度：粒徑/μm 2 - 5 >100 色譜柱柱效/（理論塔板數(shù)/m） 2000

4、 - 50000 2 - 50 分析速度 分析速度快 分析速度慢 色譜柱使用情況 可重復(fù)多次使用 色譜柱只用一次 在線(xiàn)檢測(cè)情況 能在線(xiàn)檢測(cè) 不能在線(xiàn)檢測(cè) 定性定量的準(zhǔn)確度 好 差 （二）與GC比較 1、 適合于熱不穩(wěn)定性樣品的分析 GC中使用氣體為流動(dòng)相，要求被測(cè)樣品在氣化室高溫氣化后方可在柱上分離，這就使得熱不穩(wěn)定性樣品用GC分析比較困難，需衍生化以保護(hù)被測(cè)物的不穩(wěn)定基團(tuán) 2、 有利于有機(jī)酸，堿等極性化合物的分離 這些物質(zhì)用GC直接來(lái)測(cè)定時(shí)，由于有較大的極性，一方面易產(chǎn)生托尾的現(xiàn)象，另一方面，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因而測(cè)定困難，需利用衍生化來(lái)減小其極性后方可GC分

5、析 3、 可分離離子型化合物及蛋白質(zhì)，肽類(lèi)等大分子化合物 這些物質(zhì)無(wú)法氣化，不可GC分析。 總之，HPLC與GC各有所長(zhǎng)，互相補(bǔ)充，均成現(xiàn)代分析中不可缺少的工具。 HPLC與GC的比較 GC HPLC 揮發(fā)性物質(zhì)，適用于20％ 的化合物 幾乎可以分析各種物質(zhì) 對(duì)熱不穩(wěn)定的物質(zhì)不能分析 可以用于熱不穩(wěn)定的物質(zhì) 用毛細(xì)管柱色譜可得到很高的柱效 色譜柱不能很長(zhǎng)，柱效不會(huì)太高 載氣不影響分配，靠改變固定相來(lái)改變選擇性 固定相：沒(méi)有GC那樣種類(lèi)繁多靠改變流動(dòng)相來(lái)改變選擇性 回收困難 可定量回收，可用于制備 第二節(jié) 液－固吸附色譜及液－液分配色譜 一 液－固吸附

6、色譜（LSC） (一) 定義 色譜分離是基于吸附效應(yīng)的色譜法稱(chēng)為吸附色譜，又稱(chēng)液－固吸附色譜、正相色譜法（normal phase chromatography，NPC）。 液－固吸附色譜是最早出現(xiàn)的，也是最基本的一種柱色譜類(lèi)型。在吸附色譜中，樣品組分（溶質(zhì)）受到兩種力的作用，一是固定相對(duì)它的吸附力，二是流動(dòng)相的“拉力”或溶解力，即溶質(zhì)處于這兩相作用力場(chǎng)的平衡之中。吸附力強(qiáng)而溶解能力差時(shí)，溶質(zhì)有較大的保留；反之，則較先流出色譜柱。溶質(zhì)，吸附劑和流動(dòng)相溶劑分子三者間的相互作用，涉及偶極之間的誘導(dǎo)力，靜電力，氫鍵力，色散力，電荷轉(zhuǎn)移或∏絡(luò)合物形成等相互作用類(lèi)型。在氧化物型極性吸附型上，靜電，

7、誘導(dǎo)，氫鍵等特殊作用力為主要的作用力，色散力微不足道。但在非極性的固定相，例如多孔碳的情況下，非特殊的色散力是固定相與溶質(zhì)分子間唯一的相互作用力。 （二）固定相 液—固吸附色譜固定相分類(lèi)如下： 酸性吸附劑： 硅膠、硅酸鎂 極性吸附劑 極性 堿性吸附劑：氧化鋁、氧化鎂 非極性吸附劑：活性碳 薄殼型（表面多孔層）：優(yōu)點(diǎn)：傳質(zhì)快，滲透性好； 缺點(diǎn)：比表面積小，樣品容量小（<0.1mg/g） 硅膠結(jié)構(gòu) 球 形 無(wú)定形 全多孔型（表面多孔層）： 優(yōu)點(diǎn)：比表面積大，樣品容量大（mg/g） HPLC中液—固吸附色譜固定

8、相用的主要是硅膠。其次是氧化鋁。結(jié)構(gòu)類(lèi)型主要采用薄殼型及全為多孔微粒型兩種。 薄殼型及全為多孔微粒型硅膠的示意圖 硅膠表面上的活性作用點(diǎn)： 液—固吸附色譜的保留機(jī)理：極性。極性小的組分先出峰（正相色譜）。 液—固吸附色譜樣品的分離主要是因分子中的極性官能團(tuán)與固定相表面上活性作用點(diǎn)（如硅醇基）之間的相互作用，這種極性相互作用的強(qiáng)弱歸納如下： 硅膠上各類(lèi)化合物或官能團(tuán)吸附強(qiáng)弱的分類(lèi) 吸附強(qiáng)弱 樣品類(lèi)型 無(wú)吸附 脂肪烴 弱吸附 烯烴、硫醇、硫醚、單環(huán)和雙環(huán)芳烴、鹵代烴 中等吸附 綢環(huán)芳烴、醚、腈、硝基化合物和大多數(shù)羰基化合物

9、 強(qiáng)吸附 醇、酚、酰胺、亞胺、砜、酸 一般規(guī)律 1. F化物＜Cl化物＜Br化物＜I化物 2. 順式比反式幾何異構(gòu)體保留值大 3. 官能團(tuán)之間的分子內(nèi)氫鍵將使保留值減小 4. 極性基團(tuán)旁邊有龐大烷基存在時(shí)，保留值減小 5. 環(huán)己烷衍生物和甾體化合物的中位取代基比軸端取代基有更強(qiáng)的保留 例如：環(huán)丙氟哌酸的中間體2，4—二氯氟苯的合成工藝如下： (1) (2) (3) (4)

10、 (5) 現(xiàn)對(duì)合成的最終產(chǎn)品2，4—二氯氟苯進(jìn)行純度檢查。采用的檢查方法為HPLC，以硅膠柱分析得到如下色譜。試判斷圖中各峰所對(duì)應(yīng)的化合物（歸屬）。 ⑤ ④ ① ② ③ 0min 20min （三）流動(dòng)相 LSC中使用的流動(dòng)相為各種有機(jī)溶劑，主要為非極性的烴類(lèi)（如己烷、庚烷），某些有機(jī)溶劑（如二氟甲烷、甲醇、二乙胺等）作為緩和劑加入其中以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的溶劑強(qiáng)度、極性及PH值，即進(jìn)行所謂正相色譜、極性越大的組分保留時(shí)間越長(zhǎng)。 1. 混合溶劑 液固色譜中廣泛使用混合溶劑（二元、三元體系等），這是因?yàn)殡m然不同

11、的純?nèi)軇┯胁煌娜軇?qiáng)度。但他們不一定是進(jìn)行LSC的最佳溶劑強(qiáng)度。我們可以利用不同組成的混合溶劑獲得任意需要的溶劑強(qiáng)度。 流動(dòng)相主體：弱極性的戊烷、己烷、庚烷等。 改 性 劑：調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度與峰形。 中等極性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯。 極性溶劑：四氫呋喃、乙腈、異丙醇、甲醇、水等。 堿性物質(zhì)：如三乙胺等→分離堿性樣品，避免峰拖尾或不可逆的保留。 2. 水的影響 硅膠及氧化鋁為良好的干燥劑。水的含量對(duì)該類(lèi)吸附劑的活度有很大的影響，即使有極微量的水吸附在其表面上，也會(huì)使吸附劑活性大大降低。 （四）液—固色譜的應(yīng)用 隨著HPLC技術(shù)的發(fā)展，雖然原來(lái)許多使用LSC模式的分

12、離分析被更方便、穩(wěn)定的化學(xué)鍵合相所代替，但在以下幾個(gè)方面仍有其獨(dú)特的意義： 1. 異構(gòu)體的分離 許多異構(gòu)體使用化學(xué)鍵合相來(lái)分離是不可能的或者是很困難的，而采用以硅膠為固定相的LSC卻很容易分開(kāi)。 2. 樣品預(yù)處理 許多生物樣品可使用經(jīng)典LSC來(lái)進(jìn)行純化，除去蛋白質(zhì)等干擾物，然后再進(jìn)一步以GC或HPLC等分離分析。 3. 制備色譜 由于硅膠比較便易。所以進(jìn)行分離比較有利，同時(shí)流動(dòng)相為有機(jī)溶劑，容易揮發(fā)。便于產(chǎn)物提取。 4. 常用于HPLC-GC聯(lián)用技術(shù) 由于流動(dòng)相為有機(jī)溶劑，易于汽化，所以目前90%的HPLC-GC中的HPLC部分采用LSC，進(jìn)行正相HPLC。 二、液-

13、液分配色譜法（LLC） （一）定義 色譜分離是基于樣品組分在固定液和流動(dòng)相之間分配的不同色譜法稱(chēng)為液-液分配色譜法。 這種方法的基本原理是物質(zhì)在兩種液相間的分配。它類(lèi)似于實(shí)驗(yàn)中常用的液-液萃取法。其保留機(jī)理為溶解度。物質(zhì)在固定液中的溶解度越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。 （二）固定相 LLC的固定相為載體上涂漬的固定液。 1. 載體 原則上，所有多孔性的吸附材料均可作為固定液的載體。一般常用硅膠，硅藻土等。結(jié)構(gòu)類(lèi)型主要采用多孔層微珠及全多孔微粒型二種。多孔層微珠是較早使用的一種載體，它柱效好，分析時(shí)間短；但它的多孔層很薄，只能涂漬少量固定液（最大涂漬1~2%），故柱容量低，柱穩(wěn)定性也差，因?yàn)?/p>

14、少量的固定液流失將大大改變保留體積。全多孔微粒（如硅膠）孔容大（≈1ml/g），可涂漬較多的固定液，涂漬量可達(dá)1克固定液/每克載體（稱(chēng)為100%涂漬），其柱效比前者高，且柱容量高，柱子穩(wěn)定性也好——載體上涂漬的固定液越多，則因固定液流失對(duì)樣品保留體積的影響就越不顯著，理想的載體應(yīng)該具有如下特點(diǎn)： 1）孔容大 2）孔徑應(yīng)為100~500埃之間，孔徑太小較大的分子可能被完全排阻，而保留時(shí)間更短，分離不佳。孔徑太大，則固定液易流失，柱穩(wěn)定性差，由于毛細(xì)管作用，固定液在小孔要比大孔內(nèi)保持的好。 2. 固定液 固定液可采用氣相色譜中常用的某些固定液，如不同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撐二醇等。然

15、而，對(duì)這些固定液，適合作為流動(dòng)相的只有非極性鏈烴，最多再加入少量（最高10%）的氯仿，四氫呋喃和其他醚。所有常見(jiàn)的洗脫液都是這些固定液的良溶劑。但由于許多有機(jī)物樣品在上述洗脫液中的溶解度很小，所以這類(lèi)體系的適用性是有限的。 LLC的固定液的選擇也可參考紙色譜法中使用的體系或從多組分中萃取已知組分的分配體系。如在紙色譜里，甾體藥物可以在浸漬甲酰胺的紙上容易地分離，如果把甲酰胺涂在硅膠上，那么甾族化合物就能用高效液相色譜分離，因?yàn)榧柞０芳词乖谥械葮O性的溶劑苯、二氯甲烷中也幾乎是不溶解的。 3.載體的涂漬 采用GC中常用的固定液涂漬方法。 （三）流動(dòng)相 采用與固定液性質(zhì)相差很大的不混溶的溶

16、劑為流動(dòng)相，流動(dòng)相使用前需預(yù)先用固定液飽和，或在分析柱前增加預(yù)飽和柱，以避免固定液流失。 （四）應(yīng)用 LLC較適合于分離中等極性和極性物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)LSC來(lái)說(shuō)極性太高，LLC的應(yīng)用范圍幾乎全被鍵合相色譜所包含，故現(xiàn)在已很少使用。 三、正相硅膠反相洗脫（NS/RE）色譜法 （一）固定相 本法采用未改性的原形硅膠為固定相，以水性溶液作流動(dòng)相。常用于分析中藥中的生物堿成分，或化學(xué)合成的生物堿類(lèi)藥物。 該方法的保留機(jī)制是基于硅膠表面的硅羥基在一定的條件下具有離子交換特性，改變?nèi)我涣鲃?dòng)相條件（pH, 離子強(qiáng)度，含水量），都會(huì)對(duì)保留時(shí)間產(chǎn)生影響。 （二）流動(dòng)相 該法常用的流動(dòng)相為：乙醇（

17、或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸調(diào)節(jié)pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。該法的色譜保留機(jī)理相當(dāng)于離子交換機(jī)理，主要依堿性強(qiáng)弱出峰。色譜峰的對(duì)稱(chēng)性很好，峰形尖銳。適合于分離在反相HPLC中不宜分離的生物堿類(lèi)混合物（反相HPLC中生物堿可能拖尾及峰展寬，有時(shí)tR相差很大）。 影響NS/RE色譜保留的因素如下： 1. 水的比例增加，洗脫能力減??； 2. 三乙胺濃度升高，對(duì)含堿性基團(tuán)組分的洗脫能力提高，保留時(shí)間縮短。流動(dòng)相中三乙胺為陰離子競(jìng)爭(zhēng)離子，用于競(jìng)爭(zhēng)硅羥基，以消除硅羥基對(duì)生物間的吸附。 3. pH值對(duì)NS/RE的色譜保留具有兩面性。一方面，增大pH值，硅醇基解離

18、程度提高，離子交換特性增強(qiáng)，使保留時(shí)間增大。但另一方面，對(duì)于堿性化合物，增大pH會(huì)壓制該化合物的解離，反而會(huì)使保留時(shí)間縮短。流動(dòng)相的pH值以pH 6~7為好。原因有三：（1）pH太低，硅羥基失去離子交換能力。（2）pH值太高弱堿性藥物不易離子化。（3）pH值太高，硅叫在堿性溶液中有一定的溶解度。 4. 非解離型物質(zhì)在該系統(tǒng)的出峰順序類(lèi)似于RP-HPLC（硅氧烷基疏水） （三）柱子的培養(yǎng) 由于流動(dòng)相中含有三乙胺，三乙胺吸附在硅羥基上。很難以甲醇清洗，所以每次做完樣品，先以0.1%冰乙酸沖洗15-20min,洗去三乙胺，然后再用甲醇沖洗20min。經(jīng)這樣處理后，柱壓可長(zhǎng)期保持不變，達(dá)到保護(hù)柱

19、子的目的。 第三節(jié) 化學(xué)鍵合相色譜 一、 意義和特點(diǎn) 化學(xué)鍵合相色譜使用的固定相是借助于化學(xué)反應(yīng)的方法將有機(jī)分子以共價(jià)鍵連接在色譜擔(dān)體上的，主要用于反相、正相、離子交換及離子對(duì)色譜中。據(jù)統(tǒng)計(jì)。鍵合相色譜在高效液相色譜的整個(gè)應(yīng)用中占80%以上。 要形成化學(xué)鍵合固定相，有兩個(gè)必要條件：一是所用的擔(dān)體材料應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性，如硅膠、氧化鋁、硅藻土等表面都具有化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)；但以硅膠為最理想的和最常用。二是有機(jī)分子應(yīng)含有能與擔(dān)體表面發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)（詳見(jiàn)下節(jié)討論）。硅膠（SiO2·xH2O）之所以是理想的化學(xué)鍵合相擔(dān)體，主要由它的表面性質(zhì)所決定。硅膠表面硅原子主要以硅醇基（≡Si-OH）

20、和硅氧烷形成存在，這種硅醇基是進(jìn)行鍵合的活性官能團(tuán)。 自由型硅醇基 硅氧烷型 按照晶體點(diǎn)陣計(jì)算，硅膠表面羥基數(shù)目可達(dá)到8個(gè)/nm2,但用化學(xué)方法測(cè)定的羥基數(shù)一般認(rèn)為是約5個(gè)/nm2。硅膠表面存在著足夠的可反應(yīng)硅膠基，再加上硅膠本身的許多特點(diǎn)，例如強(qiáng)度好，孔結(jié)構(gòu)和表面積易于人為控制，有較好的化學(xué)穩(wěn)定性等，因而是各種化學(xué)鍵合相理想基質(zhì)材料。 化學(xué)鍵合相在HPLC中的應(yīng)用，引起了一場(chǎng)巨大的變革。使得較早出現(xiàn)的液-固吸附色譜及液-液分配色譜大量地被鍵合相色譜所取代，某些離子型的物質(zhì)也從用傳統(tǒng)的離子交換樹(shù)脂分離改用離子交換鍵合相或反相離子

21、對(duì)色譜分離。歸納起來(lái)，化學(xué)鍵合相主要有以下幾個(gè)優(yōu)越性。 1. 消除了擔(dān)體上的表面活性作用點(diǎn)，清除了某些可能的催化活性。 這樣就緩和了一些復(fù)雜樣品在固定相表面上的不可逆化學(xué)吸附，使得操作簡(jiǎn)化，峰形對(duì)稱(chēng)；對(duì)溶劑中微量水分含量的變化要求不苛刻；此外，溶劑的殘留效應(yīng)小，梯度沖洗平衡快。這是鍵合相色譜在許多方面取代液固吸附色譜的主要原因。 2. 耐溶劑沖洗。 這是傳統(tǒng)的液-液分配色譜（LLC）逐漸被鍵合相色譜取代的根本原因。LLC中固定液的流失十分嚴(yán)重，為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，曾采取溶劑預(yù)先用固定液飽和及柱前增加預(yù)飽和柱的方法，但這樣做既不方便，柱系統(tǒng)的穩(wěn)定性也差?；瘜W(xué)鍵合相色譜的固定相永久性的鍵合在

22、擔(dān)體上，不會(huì)流失。 3. 熱穩(wěn)定性好 每種鍵合相均有其相應(yīng)的最高使用溫度，在此溫度下可進(jìn)行升溫HPLC。如十八烷基鍵合相的流失溫度在220℃以上。 4. 表面改性靈活，容易獲得重復(fù)性產(chǎn)品 。改變鍵合用有機(jī)硅烷，可得到不同的鍵合相填料，以適用于各種類(lèi)型的試樣分離?？刂乒枘z的質(zhì)量和鍵合工藝，可得到重復(fù)性產(chǎn)品。 二、制備和性能評(píng)價(jià) （一）制備 在制備鍵合相時(shí)，首先作為擔(dān)體的硅膠需要酸處理，使表面的硅氧烷鍵打開(kāi)，形成盡可能多的自由羥基，有利于反應(yīng)。 酸處理也可除去表面層的金屬氧化物雜質(zhì)和孔隙中的細(xì)粉。然后中和，在200℃以下烘干除去物理吸附水（不得超過(guò)200℃，否則硅醇基脫水形成硅

23、氧烷結(jié)構(gòu)），再以過(guò)量的硅烷化試劑進(jìn)行化學(xué)鍵合。 （1）反應(yīng) 鍵合反應(yīng)的類(lèi)型：Si-O-Si-C鍵型（硅膠與有機(jī)硅烷反應(yīng)產(chǎn)物） 這是一類(lèi)目前占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的鍵合相類(lèi)型，具有良好的熱穩(wěn)定性及化學(xué)穩(wěn)定性，能在pH 2～7.5的介質(zhì)中使用。它是利用氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠反應(yīng)而得。 X為Cl、CH3O或C2H5O。 R為辛烷基、十八烷基、苯基等。 如Bondapak-C18鍵合相，即為R = 十八烷基。 X：-Cl、-OH、-OCH3、-OC2H5 R：-C8H17、-C18H37、-(CH2)nCN、-(CH2)nNH2 （2）端基封尾(endcap)－－消

24、除殘余的硅羥基 由于空間位阻的緣故，較大的硅烷分子不可能與擔(dān)體表面上較小的硅醇基全部發(fā)生反應(yīng)。因而殘余羥基是不可避免的。為了進(jìn)一步消除殘留的游離硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后再用一氯三甲基硅烷或六甲基二硅氨烷鈍化。也可用十八烷基三氯硅烷再鍵合一次。 （3）常見(jiàn)的官能團(tuán) 十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS） 氰基 苯基 氨基 （4）常用的鍵合相商品牌號(hào) 安捷倫公司（Agilent）：Zorbax ?：Zorbax ?由著名的色譜科學(xué)家Kickland研制，并由杜邦公司所生產(chǎn)和銷(xiāo)售的系列色譜填料的注冊(cè)

25、商標(biāo)?，F(xiàn)在，Zorbax的全部生產(chǎn)線(xiàn)已并入Agilent公司。 Waters公司：Bondapak ?、μ BondapakTM、XterraTM：μ BondapakTM C18性能重現(xiàn)性非常好。能經(jīng)歷20多年但性能基本上保持一致的HPLC并不多， μ BondapakTM C18是其中一個(gè)代表性的品種。 瑞典Akzo Nobel公司：Kromasil ?：Kromasil 硅膠的質(zhì)量較穩(wěn)定，但柱壓較高。 Merck公司：LiChrosorb、LiChrospher、Nucleosil （二）化學(xué)鍵合相性能評(píng)價(jià) 由于各種鍵合相均以硅膠為基質(zhì)，可以認(rèn)為是一種改性硅膠。在化學(xué)鍵合相

26、色譜中，代表色譜保留ｋ＇是與鍵合在硅膠表面有機(jī)基團(tuán)的覆蓋量直接有關(guān)，因而鍵合相表面改性的完全程度和重現(xiàn)性是色譜用戶(hù)和制造廠(chǎng)家共同關(guān)心的。重復(fù)性和改性完全程度可通過(guò)殘余羥基，覆蓋度和覆蓋均勻性表示。測(cè)定和評(píng)價(jià)的方法有微量元素分析、色譜、光譜、核磁共振法等。 １． 微量元素分析或熱失重法 本法直接測(cè)定鍵合相的碳含量： 這個(gè)值在２～２９％之間變化。由于Ｃ％隨基質(zhì)比表面積（Ｓ）和鍵合有機(jī)基團(tuán)的分子量（Ｍ）變換，所以在研究和比較的工作中采用表面鍵合相濃度α表示，即單位表面積所含鍵合相的濃度(umol/m2)：= 式中，w為1g擔(dān)體上鍵合有機(jī)物的重量（μg）；M為鍵合有機(jī)基團(tuán)的分子量；S為擔(dān)體

27、比表面積（m2/g）。 W用碳含量表示： W=106 式中，12為碳的原子量；Nc為鍵合有機(jī)基團(tuán)的碳數(shù)。 有時(shí)也用表面覆蓋度表示鍵合量。 表面覆蓋度=== 這里假定硅膠表面可反應(yīng)的硅膠基數(shù)目為5個(gè)/nm2，6.02×1017為以微摩爾為基準(zhǔn)的阿佛加德羅常數(shù)。 2. 色譜法 鍵合相的性能用色譜方法評(píng)價(jià)是很自然的，因?yàn)樗罱K用于色譜，所以生產(chǎn)廠(chǎng)家一般都給出產(chǎn)品附上特定標(biāo)準(zhǔn)物苯及聯(lián)苯的保留值和柱效率，或者其它參數(shù)的測(cè)試結(jié)果。例如對(duì)反相填料在甲醇-水條件下考察對(duì)芳烴、苯、萘、聯(lián)苯的分離情況。也有人提出用非極性鍵合相填料正相洗脫的方法檢查殘余羥基的含量，即用庚烷作流動(dòng)相。若殘余羥基甚少，則

28、象甲醇、丙酮等極性化合物的保留時(shí)間與tm相近。且峰形對(duì)稱(chēng)。若殘余羥基甚多。則情況相反。這種方法評(píng)價(jià)較為多客觀(guān)。 3. 光譜法 光譜法也是考察填料表面羥基含量的重要手段。這是基于Si-OH基在3750cm-1處有特征的紅外吸收譜帶，借此可以獲得某些信息。 三、 分類(lèi) 化學(xué)鍵合相的分類(lèi)可以有不同的依據(jù)。按鍵合相的表面結(jié)構(gòu)分為單分子鍵合和聚合鍵合；按鍵合有機(jī)硅烷的官能團(tuán)分為極性鍵合相、非極性鍵和離子交換鍵合相三種。 四．極性鍵合相色譜 極性鍵合相指鍵合有機(jī)分子中含有某種極性基團(tuán)。和空白硅膠相比，這種極性鍵合相的表面能分布相對(duì)均勻，因而吸附活性比硅膠低，可以看成是一種改性過(guò)的硅膠。最常見(jiàn)的

29、極性鍵合相有氰基（-CN，Cyano-）、二醇基（diol）、氨基（-NH2，amino-）等。商品鍵合相一般均以上述基團(tuán)命名，如Lichrosorb NH2，u-Bondapak CN等。也有的商品鍵合相并不注明是什么基團(tuán)。 對(duì)于極性鍵合相來(lái)講，一般鍵合表面由三部分組成：鍵型、主體基團(tuán)、極性端基。 鍵型：如Si-O-Si-C。它是整個(gè)極性鍵合基團(tuán)與硅膠母體直接相連的橋梁。 主體基團(tuán)：一般由直鍵烴基或醚基所組成，其作用為使硅膠表面與特定的極性基團(tuán)之間保持一定距離。 極性端基：由帶極性基團(tuán)（如NH2，ＯＨ）的烴基或芳基組成。 大多數(shù)情況下，極性鍵合相的制備分三步進(jìn)行。第一步是在硅膠

30、表面先接一個(gè)正烴基或正芳基硅烷，然后再以相應(yīng)的取代反應(yīng)引入極性基團(tuán)。由于空間位阻的影響，上述反應(yīng)不能象相似相溶液那樣完全，一般靠碳和氮含量來(lái)計(jì)算表面覆蓋程度。 上述三種極性鍵合相都是一氫鍵力作用，其中氰基是一種氫鍵接受體，而后兩種兼具氫鍵接受體和給予體兩種性能。對(duì)于有較強(qiáng)氫鍵作用力的樣品，在后兩種鍵合相上的保留值大，所得ｋ＇值也大。 極性鍵合相一般都用作正相色譜，即用非極性或極性小的溶劑（如烴類(lèi)溶劑）加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇類(lèi)、乙腈等），以調(diào)節(jié)控制洗脫液的洗脫強(qiáng)度。分離組分的出峰順序與組分的極性大小順序相同，即極性弱的先出峰，極性強(qiáng)的后出峰。但對(duì)強(qiáng)極性的化合物，上述極性鍵合相也可用反

31、相色譜，如分離糖類(lèi)或多肽化合物時(shí)，用乙腈-水作洗脫液也可以得到良好的分離效果。 極性鍵合相的保留機(jī)理既有吸附的因素，也有分配的因素。一般認(rèn)為吸附過(guò)程是主要的相互作用過(guò)程，通過(guò)填料表面極性基團(tuán)的偶極誘導(dǎo)，或氫鍵，或靜電作用和溶質(zhì)分子發(fā)生相互作用，達(dá)到分離目的。 極性鍵合相色譜提綱： 1、鍵合表面的基團(tuán)組成 鍵型：Si-O-Si-C或Si-O-Si-N 主體基團(tuán)：直鏈烴基或醚基 極性的端基：氨基（-NH2）、氰基（-CN）、二醇基（diol）、芳硝基、醚基 LiChrosorb NH2、 LiChrosorb Diol 2、分離機(jī)理 作用力：氫鍵力 氰基：氫鍵接受體 氨基

32、、二醇基：氫鍵接受體與給予體 聯(lián)苯胺、苯胺k’:氨基>氰基（學(xué)生思考原因） 3、色譜分離方式 1）一般用作正相色譜 流動(dòng)相：弱極性溶劑 ＋ 適量極性溶劑 （烴類(lèi)） （氯仿、醇、乙腈） 溶質(zhì)保留規(guī)律： A 溶質(zhì)的分離是基于親水結(jié)構(gòu)的差異； B 溶質(zhì)的極性越大，保留值越大； C 流動(dòng)相極性越大，洗脫強(qiáng)度越大。 2）也用作反相色譜 分離樣品：強(qiáng)極性化合物，如糖類(lèi)、多肽 五．離子交換鍵合相色譜 離子交換色譜早期都采用高分子聚合物（如聚苯乙烯樹(shù)脂）為基質(zhì)的離子交換樹(shù)脂作用定相。在HPLC中，這種固定相由于溶脹性，不耐

33、高壓，以及表面的微孔型結(jié)構(gòu)影響傳質(zhì)速率，現(xiàn)已被離子交換鍵合相所代替。 在化學(xué)鍵合的有機(jī)硅烷分子中帶上固定的離子交換基團(tuán)，便成了離子交換鍵合相。若帶上磺酸基(-SO3), 羧酸基（-COOH），就是陽(yáng)離子交換劑，若帶上季氨基（-R4N+）或氨基（-NH4）就是陽(yáng)離子交換劑。 離子交換鍵合相多以薄殼型或全多孔微粒硅膠為基質(zhì)，具有較高的耐壓性，化學(xué)及熱穩(wěn)定性。由于有較好的機(jī)械強(qiáng)度，耐壓，這類(lèi)微粒型鍵合相可以高壓勻漿裝柱。但它們的pH適用范圍只能在pH 2~8。pH＞9時(shí)，硅膠便容易溶解。特別是未鍵合的殘留硅羥基容易生成硅酸鹽。 離子交換容量是很重要的。交換容量越大，負(fù)載能力越大，ｋ＇值也越大。

34、離子交換鍵合相的交換容量與固定相的表面積直接有關(guān)。全多孔微粒型固定相的交換容量較大，一般為毫克當(dāng)量水平（0.2~0.5毫克當(dāng)量/克）；薄殼型由于表面積較小，一般只有微克當(dāng)量級(jí)（30~60微克當(dāng)量/克）。交換容量可用酸堿滴定法測(cè)定。 在離子交換鍵合相色譜中，離子交換鍵合相色譜的流動(dòng)相多為控制一定的pH的緩沖液。流動(dòng)相中往往加入有機(jī)成分作為改性劑。溶質(zhì)的保留值受流動(dòng)相的pH值、離子強(qiáng)度以及有機(jī)改性劑的影響，溶質(zhì)的保留兼有離子交換和吸附雙重機(jī)理。 1. pH值對(duì)保留時(shí)間的影響 腺嘌呤 胞嘌呤 K’ PH 弱酸及弱堿的保留值與洗脫液的pH值有關(guān)，它們或者先解離并參加離子交換而被分離；或者

35、不解離。不參加離子交換，而以分子形式幾乎無(wú)保留地通過(guò)柱子（實(shí)際上由于極性基團(tuán)微弱的吸附作用而產(chǎn)生很小的保留作用）。 在強(qiáng)陰離子交換鍵合相上分離弱酸性有機(jī)陰離子時(shí)，當(dāng)pH過(guò)高（如pH＞7時(shí)），有機(jī)酸完全電離，牢固地吸附在固定相上，ｋ＇很大，難于洗脫，此時(shí)便于無(wú)分離作用。又如在陽(yáng)離子交換鍵合相（-SO3H）上分離堿性藥物時(shí)，當(dāng)pH過(guò)高，固定相轉(zhuǎn)變成鈉型（-SO3-+Na），堿性藥物以游離堿形式存在，無(wú)交換能力，ｋ＇很小。也無(wú)法達(dá)到分離目的。例如，在分離腺嘌呤及胞嘧啶時(shí)以正丁基磺酸（鍵合在硅膠上）作為固定相，采用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH2.5~7.5）作為洗脫液。不同的pH對(duì)ｋ＇的影響

36、見(jiàn)圖1。pH大于6時(shí)，兩堿性樣品的ｋ＇都在1~1.5之間，在這樣的pH下，交換集團(tuán)完全是以Na+的形式存在的，而游離的胞嘧啶及腺嘌呤無(wú)法與Na+離子交換。當(dāng)pH值減小時(shí)，堿性樣品的ｋ＇值增加。在低pH值得情況下，ｋ＇重新與pH無(wú)關(guān)，因?yàn)檫@時(shí)堿完全被質(zhì)子化而牢固地吸附在固定相上，ｋ＇很大，不易洗脫。曲線(xiàn)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)近似相當(dāng)于兩堿性藥物的pkb值，在這種情況下，堿與它們的鹽以1：1的比例平衡。 由上述可見(jiàn)流動(dòng)相的pH選擇應(yīng)適中，最好選擇在被分離的酸或堿的pka或pkb附近，使它們解離適中，達(dá)到最佳分離。 為提高分離度，可采用不同pH的緩沖液作為梯度淋洗，通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件，可以得到很好的分離效

37、果。如在分離有機(jī)酸混合物時(shí)，隨著pH值得減低，酸性弱（pka較大）的組分先洗脫出，然后再降低pH，酸性較強(qiáng)（pka較?。┑慕M分也被洗脫出來(lái)。 （1）在用強(qiáng)陰離子交換鍵合相分離酸性藥物時(shí)，pH↑→藥物解離度↑→ｋ＇↑，保留時(shí)間↑。 （2）在用強(qiáng)陽(yáng)離子交換鍵合相分離堿性藥物時(shí)，pH↑→游離堿↑→ｋ＇↓，保留時(shí)間↓。 2. 離子強(qiáng)度對(duì)保留值得影響 離子強(qiáng)度（緩沖鹽濃度）增加，ｋ＇減小。如圖2，在前述固定相分離腺嘌呤及胞嘧啶時(shí)，ｋ＇隨NaH2PO4鹽濃度的變大而減小，成反比。原因歸結(jié)于離子交換平衡的移動(dòng)。 3. 有機(jī)改性劑對(duì)保留的影響 如果洗脫液中加入極性有機(jī)組分（如乙醇），則抑制離子交換

38、，并且產(chǎn)生按分配機(jī)理進(jìn)行的分離。六、非極性鍵合相色譜（Non-polar bonded phase chromatography） 又稱(chēng)反相鍵合相色譜（Reversed phase chromatography）, 這主要是因?yàn)樗玫逆I合固定相表面都是極性很小的烴基，如十八烷基、辛烷基、甲基、苯基等，而洗脫液大都采用強(qiáng)極性溶劑（水、醇、乙腈）或無(wú)機(jī)鹽的緩沖液。在這種鍵合相色譜中，洗脫次序恰與正相色譜相反，即極性大的化合物先洗脫（ｋ＇小），極性小的化合物不易洗脫（ｋ＇大）。該類(lèi)鍵合相中最常用的是十八烷基硅烷鍵合硅膠，又稱(chēng)ODS。 （一）反相鍵合相色譜的分離機(jī)理 1．疏溶劑作用理論（Sol

39、vophobic interaction） 當(dāng)一個(gè)溶質(zhì)分子的非極性部分與極性溶劑接觸時(shí)，相互產(chǎn)生斥力。這種效應(yīng)稱(chēng)為“憎水”或“疏溶劑效應(yīng)”。當(dāng)溶質(zhì)進(jìn)入到極性流動(dòng)相中時(shí)，分子中的非極性部分總是趨向與其它非極性部分聚集在一起，以減少與極性溶劑接觸的面積．而使體系的能量最低。圖中黑箭頭表示疏溶劑力，空心箭頭表示溶質(zhì)分子與極性溶劑的作用力。 疏溶劑作用理論以解釋單分子層鍵合相的色譜保留機(jī)理：該理論認(rèn)為非極性烷基鍵合相是在硅膠表面蒙覆了一層以Si-C鍵化學(xué)鍵合的十八烷基（或其他烴基）的“分子毛”。 這種構(gòu)成“分子毛”的長(zhǎng)鍵烴基具有強(qiáng)的疏水特性。對(duì)于一個(gè)被分離的有機(jī)化合物來(lái)講，可把整個(gè)分

40、子看成是非極性部分和極性官能團(tuán)部分所組成。溶質(zhì)分子與鍵合相表面的烷基之間的疏溶劑作用是溶質(zhì)分子S與鍵合烷基L間的一種可逆締合作用。 S + L LS 締合作用強(qiáng)度和溶質(zhì)的色譜保留值取決于以下三個(gè)因素： （1） 溶質(zhì)分子中非極性部分的總表面積； （2） 鍵合相上烷基的總表面積； （3） 洗脫液的表面張力 （1） 溶質(zhì)分子中的非極性部分總表面積越大，締合作用越強(qiáng)。 在一定的洗脫液和溫度下，logｋ＇與該總表面積成正比。但如分子中非極性部分相同，而增加極性基團(tuán)，則因?yàn)樵黾恿巳苜|(zhì)分子與洗脫液的極性分子間的作用力而使ｋ＇減小。 （2）logｋ＇與鍵合相表面烷基的總表面積也成線(xiàn)性關(guān)

41、系，烷基越大，ｋ＇越大。 烷基數(shù)量越多，溶質(zhì)保留越強(qiáng)。 烷基碳鏈越長(zhǎng)，溶質(zhì)保留越強(qiáng) 圖2為幾種酚類(lèi)化合物在不同長(zhǎng)短碳鏈的非極性鍵和相上所得logｋ＇比較，OH數(shù)越多，ｋ＇越小，鍵合相鏈長(zhǎng)越長(zhǎng)，ｋ＇越大。 logk’ 鍵合相固定液 圖2溶質(zhì)極性，鍵合相鏈長(zhǎng)與logｋ＇關(guān)系 （2） 洗脫液的表面張力也是影響ｋ＇的重要因素。表面張力越大，則S與L締合時(shí)釋放的能量越多，ｋ＇也越大。 洗脫液中極性有機(jī)溶劑增加。其表面張力就越小，ｋ＇也隨之減小，如果把電解質(zhì)（如緩沖液或中性鹽）加入到洗脫液，則表面張力隨著鹽濃度的增加而增加，ｋ＇也就越大。這也是反相鍵合相的選擇原則。如醇-水洗脫

42、液中增加醇的比例ｋ＇就減小，增加水的比例ｋ＇就增加。加入無(wú)機(jī)鹽ｋ＇增加。 2．雙保留機(jī)理 烷基鍵合相表面往往還有殘余硅醇基，這是一種微量酸性的基團(tuán)，可與溶質(zhì)陽(yáng)離子或氫鍵基團(tuán)相互作用，這種作用叫做“親硅醇基效應(yīng)”（Silanophilic interaction）。雙保留機(jī)理認(rèn)為溶質(zhì)的保留值應(yīng)包括兩部分的貢獻(xiàn)，即疏溶劑效應(yīng)和親硅醇基效應(yīng)。 色譜中的雙保留機(jī)理往往導(dǎo)致一些不利的影響，如柱效低，峰形拖尾等。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，在一些特定的場(chǎng)合下，例如進(jìn)行堿性化合物的分離時(shí)，往往向流動(dòng)相中加入某種胺類(lèi)添加劑，讓游離的-NH2基與殘余Si-OH首先作用，從而掩蓋了溶質(zhì)分子與鍵合相的親硅醇基

43、效應(yīng)。 （二）流動(dòng)相 反相HPLC的流動(dòng)相一般選擇（1）甲醇—水及（2）乙腈—水兩種系統(tǒng)。此外，還可考（3）四氫呋喃—水。 系統(tǒng)（2）較系統(tǒng)（1）好，原因如下： A) 系統(tǒng)（2）的粘度較系統(tǒng)（1）小，柱效好些。 （注：粘度↑→ 柱壓↑，傳質(zhì)阻力↑（溶質(zhì)擴(kuò)散阻力↑）→ 柱效↓） B) 乙腈的紫外末端吸收較甲醇小，在低波長(zhǎng)處測(cè)定時(shí)，基線(xiàn)波動(dòng)較甲醇小，測(cè)定誤差小。 1．對(duì)于中性藥物而言 （1）待測(cè)物極性較大時(shí)，則選擇：水相比例較大。 甲醇—水，乙腈—水的常用比率為（20-35：80-65）。即（20：80）—（35：65） 例1. 柴胡皂甙C（Saikosaponin C

44、） 色譜柱：YWG ODS A-311 (6.0 mm, I.D.×10 cm) 流動(dòng)相：乙腈：水（28：72） 流速：3 ml/min 檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm 例2. 梔子甙（Geniposide） 色譜柱：Spheri-5 RP-18, 5mm (4.0 mm, I.D.×25 cm) 流動(dòng)相：甲醇：水（35：65） 流速：0.8 ml/min 檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm tR：7.77 min （2）當(dāng)待測(cè)物的極性較小時(shí)，則選擇：有機(jī)相比例較大。 甲醇—水，乙腈—水的常用比率為（60-80：40-20）。即（60

45、：40）—（80：20） 例：醋酸甲羥孕酮（Medroxyprogesterone acetate） 色譜柱：Hypersil ODS (4.6 mm, I.D.×25 cm) 流動(dòng)相：甲醇：水（70：30） 檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm tR：7.3 min 2．對(duì)于堿性藥物而言 由于“親硅醇基效應(yīng)”，固定相上殘余的硅醇基往往使生物堿峰拖尾或被吸附。解決辦法如下： （1）向流動(dòng)相中加入胺類(lèi)添加劑—作為掃尾劑，同時(shí)又起到離子抑制的作用。 如：三乙胺（0.05 %），二乙胺（0.0125 %），正丁胺（10mmol/L） 例：替諾昔康（Tenoxicam）—西藥

46、：非甾體抗炎藥。解熱、鎮(zhèn)痛、消炎。 在甲醇—水的系統(tǒng)中，該藥出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，加入少量的三乙胺作為掃尾劑，峰形改善。 色譜柱：Spherisob C18, 5mm (4.6 mm, I.D.×15 cm) 流動(dòng)相：甲醇：水：三乙胺（18：86：0.05） 流速：1 ml/min 檢測(cè)波長(zhǎng)：361 nm （2）加入反離子，利用離子對(duì)色譜來(lái)解決。（Pair ion Chromatography, PIC） 常用離子對(duì)試劑：烷基磺酸鹽。如：正戊磺酸鈉（PIC-B5），正己磺酸鈉（PIC-B6），正庚磺酸鈉（PIC-B7），正辛磺酸鈉（PIC-B8），十二烷基磺酸鈉（

47、SDS）。 在相同的色譜條件下，反離子的烷基增加一個(gè)碳將使保留時(shí)間延長(zhǎng)很多。十二烷基硫酸鈉有時(shí)使保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，此時(shí)可換低碳烷基的離子對(duì)試劑，如庚基磺酸鈉（PIC-B7）或辛基磺酸鈉（PIC-B8）等。 流動(dòng)相配制： 在甲醇—水（或乙腈—水）系統(tǒng)中加入PIC試劑（市售為濃溶液）使其濃度為3-10 mmol/L,并以磷酸二氫鉀及磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相至適當(dāng)?shù)膒H值。 用離子對(duì)色譜法分離測(cè)定堿性藥物時(shí)，流動(dòng)相pH=3-3.5即可。 例1. 左卡尼汀（Levocarnitine） 色譜柱：Hypersil ODS, 5mm (4.6 mm, I.D.×20 cm) 流動(dòng)相：以含有2.

48、8 mmol/L庚烷磺酸鈉的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（取11.5 ml磷酸至1900 ml水中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為2.4，每98 ml上述溶液中加入55.5 mg庚烷磺酸鈉，搖勻）—甲醇（98：2） 流速：1 ml/min 檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm tR：7.5 min 例2. 鹽酸苯乙雙胍（Phenformin Hydrochloride） 流動(dòng)相：甲醇：水（1：1），含0.02 %冰乙酸和5 mol/L庚烷磺酸鈉（pH 3.7） （3）pH控制離子化以控制保留 低pH值可加快堿性化合物出峰，并抑制“親硅醇基效應(yīng)”。 例：止咳化痰丸重麻黃

49、堿及偽麻黃堿的測(cè)定 色譜柱： ODS, 10 mm (3.9 mm, I.D.×30 cm) 流動(dòng)相：0.01 mol/L磷酸氫二鉀（用磷酸調(diào)至pH 2.5）— 甲醇（96：4）。 3．對(duì)于酸性待測(cè)物而言 先用甲醇—水，乙腈—水兩種系統(tǒng)。很多酸性藥物能用這兩種系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。 例：厚樸酚（Magnobol） 色譜柱：YWG ODS 10 mm (4.6 mm, I.D.×25 cm) 流動(dòng)相：甲醇：水（75：25） 流速：1 ml/min 檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm tR：9.6 min 當(dāng)甲醇—水，乙腈—水，四氫呋喃—水系統(tǒng)不行時(shí)，可考慮以下辦法。

50、（1）離子抑制色譜法（Ion Suppression Chromatography）： 通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，抑制組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離目的。 （1） 適用范圍： 適合于3.0≦ pKa ≦7.0的弱酸。 對(duì)于pKa < 3.0的酸性藥物應(yīng)采用離子對(duì)色譜法或離子交換色譜法。 （2） 抑制劑： 通過(guò)向流動(dòng)相中加入少量弱酸（常用醋酸）或緩沖鹽（常用磷酸鹽急促酸鹽）為抑制劑，調(diào)節(jié)pH，抑制組分解離，增加中性分子存在幾率。對(duì)于酸性藥物，pH小于pKa時(shí)，藥物多數(shù)以分子形式存在。pH ↓→ k↑,tR ↑ 離子抑制色譜中流動(dòng)相的pH需在2-7.8之間，以防鍵

51、合相脫落。 分析酸性藥物時(shí)，常在流動(dòng)相中加入0.3-2%的冰醋酸。 例1：血樣中二氟尼柳（diflunisal） 色譜柱：Spherisorb C18 5 mm (4.5 mm, I.D.×25 cm) 流動(dòng)相：甲醇：水：冰醋酸（66：30：1） 例2：血樣中醋氯芬酸（aceclofenac） 色譜柱：Spherisorb C18 5 mm (4.0 mm, I.D.×15 cm) 流動(dòng)相：甲醇：水：冰醋酸（65：35：2） （2）離子對(duì)色譜 對(duì)酸性藥物：流動(dòng)相pH≈7.5 常用離子對(duì)試劑：四丁基季銨鹽（PIC-A） 四丁基

52、胺磷酸鹽（TBA等） 例1：蒽環(huán)類(lèi)抗生素（8種） 色譜柱：m Bondapak C18 (4.6 mm, I.D.×30cm) 流動(dòng)相：甲醇：水(含10mmol/L四丁基磷酸鹽)（65：35） 流速：1 ml/min （三） 反相HPLC分析酸性和堿性藥物時(shí)的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法 1、分析堿性藥物時(shí)會(huì)遇見(jiàn)的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法： 常見(jiàn)問(wèn)題：（1）拖尾或不出峰（親硅醇基效應(yīng)所致） 解決方法：（a）流動(dòng)相中添加小分子有機(jī)胺 （b）離子對(duì)技術(shù) （c）緩沖液 （2）峰裂分或多重峰（二次化學(xué)平衡所致）

53、 解決方法：（a）流動(dòng)相溶樣后再進(jìn)樣 （b）調(diào)整進(jìn)樣溶液的pH值。 2、分析酸性藥物時(shí)會(huì)遇見(jiàn)的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法： 常見(jiàn)問(wèn)題：（1）峰形拖尾或不對(duì)稱(chēng)（主要由待測(cè)物離子化所致） 解決方法：調(diào)整流動(dòng)相pH值至酸性或加入酸性緩沖液進(jìn)行離子抑制。 （2）峰裂分或多重峰（二次化學(xué)平衡所致） 解決方法：（a）流動(dòng)相溶樣后再進(jìn)樣 （b）調(diào)整進(jìn)樣溶液的pH值。

54、第四節(jié) 離子對(duì)色譜（Ion-pair chromatography, IPC） 一、基本原理 定義：離子對(duì)色譜是通過(guò)加入合適的反離子（Counter ion）與離子化的試劑形成離子對(duì)，這種離子對(duì)類(lèi)同中性或非極性分子一樣，從而可采用分配色譜的方法進(jìn)行分離的一種色譜分離分析方法。 離子對(duì)的形成： 試樣離子±+反離子±（試樣離子反離子試樣離子（以A±表示）和反離子（以B±表示）均溶于水相，而組成的離子對(duì)復(fù)合物（以A±·B±表示）易溶于有機(jī)相中，可表示為（設(shè)試樣離子為A±） Aaq+ + Baq-（A+·B-）org 這一平衡的平衡常數(shù)即提取常數(shù)，可表示為EAB。 EAB =

55、 1. 在正相離子對(duì)色譜中 流動(dòng)相中被測(cè)樣品離子A+與固定相或流動(dòng)相中帶相反電荷的平衡離子（反離子）B-相結(jié)合，生成離子對(duì)化合物A·B，然后在兩相之間進(jìn)行分配分離。A+在兩相之間的分配系數(shù)KA為： KA= 容量因子ｋ＇ 討論： a) 反離子濃度[B-]aq↑ｋ＇↓，保留時(shí)間↓； b) AB易被有機(jī)相萃取 EAB↑ｋ＇↓，保留時(shí)間↓ 水 水 水 # AB # AB B- B- B- A+ A+ 離子對(duì)色譜分離過(guò)程示意圖 AB AB AB # 固定相 流動(dòng)相 正相 反相 流動(dòng)相 2.在反相離子對(duì)色譜中 固定相為疏水性的鍵合

56、相（如ODS），被分離的離子A+和反離子B-同時(shí)存在于強(qiáng)極性的流動(dòng)相中，生成的離子對(duì)復(fù)合物AB在流動(dòng)相和鍵合相中進(jìn)行分配分離，其分配系數(shù)和容量因子ｋ＇為： ｋ＇ 討論： a) 增加反離子濃度[B-]aq↑ｋ＇↑，保留時(shí)間↑； b) AB易被有機(jī)相萃取 EAB↑ｋ＇↑，保留時(shí)間↑ 然而，無(wú)論在正相還是反相離子對(duì)色譜中。當(dāng)[B-]aq增大到一定濃度時(shí)，樣品離子基本上都已轉(zhuǎn)化成離子對(duì)AB（不可能100%轉(zhuǎn)化），于是ｋ＇基本保持不變。為了使ｋ＇有合適的數(shù)值，即保持ｋ＇在1~10之間，關(guān)鍵是選擇合適的反離子種類(lèi)和濃度。ｋ＇太大，分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；ｋ＇太小，則分離不開(kāi)。 離子對(duì)色譜保留機(jī)理的解釋

57、尚有爭(zhēng)論，上述假設(shè)只是一種離子對(duì)模式，除此之外還有動(dòng)力學(xué)離子交換模式和離子相互作用機(jī)理。 二、基本方法 1. 正相離子對(duì)色譜 采用硅膠、硅藻土或纖維素為擔(dān)體，合適pH的以一定濃度溶于水或緩沖液的反離子涂于擔(dān)體上。流動(dòng)相為弱極性的與水不相容有機(jī)溶劑（如氯仿，二氯甲烷等）。有時(shí)加入5~10%的親脂性醇改善峰形。樣品溶于有機(jī)溶劑或含有反離子的意有機(jī)溶劑后進(jìn)樣。（A+·B-）離子對(duì)存在于流動(dòng)相中，可通過(guò)不同的反離子改善檢測(cè)。如使用萘-乙-磺酸或苦味酸（）為反離子時(shí)，能使沒(méi)有紫外吸收的物質(zhì)也能被檢測(cè)。 正相離子對(duì)色譜中的反離子是加在固定相中的。色譜過(guò)程中要消耗反離子而使色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定，所以在應(yīng)

58、用上受到限制。 2. 反相離子對(duì)色譜 固定相為化學(xué)鍵合相的非極性表面，尤以O(shè)DS（C18）及C8反相柱最適宜，流動(dòng)相同RPHPLC一樣，常用甲醇-水，乙腈-水。反相離子對(duì)色譜系統(tǒng)穩(wěn)定，且不存在固定液流失問(wèn)題。ｋ＇的調(diào)節(jié)也很方便，可隨時(shí)改變反離子濃度及pH等。此外，還適宜于梯度洗脫。所以反相離子對(duì)色譜乙獲得廣泛的應(yīng)用。 三、影響分離的因素 1. pH的影響 合適的pH是離子對(duì)色譜的重要條件，它將決定離子型化合物的解離度，為了有最大的保留和響應(yīng)，希望有最大的解離，但又不能超出柱子所能承受的范圍，一般pH為2~7.5，最多不超過(guò)9。 分離強(qiáng)酸性藥物，pH低也能充分解離，故對(duì)pH要求不嚴(yán)；

59、對(duì)于弱酸性藥物，如磺胺類(lèi)，巴比妥類(lèi)藥物等，需在pH高時(shí)才能充分解離，若pH低，含抑制解離，樣品組分呈不解離溶質(zhì)，則按一般色譜進(jìn)行。堿性試樣的分析可控制在較低pH，能在柱適應(yīng)范圍內(nèi)較方便地進(jìn)行。 樣品類(lèi)型 pH值范圍 備注 強(qiáng)酸型（pKa<2)，如磺酸化染料 2～7.4 均解離，離子對(duì)色譜法分析 弱酸性（ pKa>2)，如氨基酸、羧酸 6～7.4 解離，離子對(duì)色譜法 2～5 解離受到抑制，離子抑制法 樣品類(lèi)型 pH值范圍 備注 強(qiáng)堿型（pKa>8)，如季銨類(lèi)藥物 2～8 均解離，離子對(duì)色譜法分析 弱堿性（ pKa<8)，如兒茶酚胺 6～7.4

60、 解離受到抑制，離子抑制法 2～5 均解離，離子對(duì)法 2. 不同反離子（B-）對(duì)離子對(duì)提取常數(shù)（EAB）和ｋ＇的影響 不同的反離子所形成的離子對(duì)的提取常數(shù)是不同的，因此ｋ＇也不同。一般來(lái)講，在正相IPC中，反離子的非極性部分越大（如季胺離子的烷基越大），則提取常數(shù)越大，ｋ＇就越??；而反相IPC中，反離子的非極性部分越大，ｋ＇也越大。 3. 改變流動(dòng)相的種類(lèi)和性質(zhì)是提高分離選擇性的重要途徑 流動(dòng)相中采用不同的有機(jī)溶劑，則EAB不同。 四．舉例 例1、鹽酸腎上腺素(Adrenaline; Epinephrine) ChP: 填充劑：ODS； 流動(dòng)相：0.14％

61、庚烷磺酸鈉溶液－甲 醇（65:35），用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0±0.1； 檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。 理論板數(shù)應(yīng)不低于3000。 例2． 鹽酸嗎啡 磷酸可待因 色譜柱：μ－BondapakC18 流動(dòng)相：甲醇-水（含有0.010mol/L磷酸鹽緩沖溶液和0.015mol/L庚烷磺酸鈉，pH＝2.0）＝41：59 例3、聯(lián)邦止咳露 通用名是“復(fù)方磷酸可待因溶液”，其有效成分為：每1ml含磷酸可待因1mg，鹽酸麻黃堿0.8mg，馬來(lái)酸氯苯那敏22mg。 輔料：色素、防腐劑、矯味

62、劑 色譜條件： 色譜柱: Spherisorb C18；10μm, 4.6mm×250mm； 流動(dòng)相:甲醇-水-冰醋酸-己烷磺酸鈉 (30∶66∶2∶2)； 流速: 0.8ml/min； 檢測(cè)波長(zhǎng):256 nm ; 溶液配制： 供試品溶液的配制：精密量取聯(lián)邦止咳露3 ml ,置10 ml 量瓶中,加醇3 ml ,加水稀釋至刻度,搖勻,即得供試品溶液。 對(duì)照品溶液的配制:精密稱(chēng)取磷酸可待因?qū)φ掌?50 mg 和鹽酸麻黃堿120 mg ,置同一個(gè)50 ml量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,即為貯備液。精密量取貯備液1 ml 置10 ml 量瓶中,加甲醇1 ml

63、,加水稀釋至刻度,搖勻,即得對(duì)照品溶液。 第五節(jié) 分子篩色譜法（體積排阻色譜法） 一、概述 溶質(zhì)與固定相或流動(dòng)相無(wú)相互作用的分離方式。 主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來(lái)進(jìn)行分離的方法，即固定相（多孔凝膠）能有效的進(jìn)行分子量大小的分離。具有不同分子大小的樣品通過(guò)柱時(shí)，溶質(zhì)分子能夠被柱填料的孔徑分類(lèi)。 分析樣品：多肽、蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子、高聚物 流動(dòng)相為有機(jī)溶劑：凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）； 流動(dòng)相為水：凝膠過(guò)濾色譜（gel filtration chromatography，GFC） 二、分離原理

64、 1、大分子：大分子不能進(jìn)入凝膠孔洞而被完全排除，只能沿著凝膠顆粒之間的空隙通過(guò)色譜柱，最先被流動(dòng)相洗脫出來(lái)。 2、小分子：小分子能進(jìn)入凝膠的絕大部分孔洞，在柱中收到更強(qiáng)的滯留，會(huì)更慢地被洗脫出來(lái)。 3、中等大小分子：中等大小分子只能進(jìn)入凝膠中一些適當(dāng)?shù)目锥粗?，但不能進(jìn)入更小的微孔，所以在柱中受到的滯留作用介于大分子與小分子之間。 4、溶劑分子：溶解樣品的溶劑分子，分子量最小，可進(jìn)入凝膠的所有孔洞，最后從柱中流出。 洗脫體積 VR＝Vm+Kd·Vs 溶質(zhì)分子能夠滲入填料內(nèi)孔體積的分?jǐn)?shù)： 當(dāng)VR＝Vm，Kd＝0：說(shuō)明溶質(zhì)完全不進(jìn)入凝膠內(nèi)部，此現(xiàn)象稱(chēng)為全排斥，此也為

65、凝膠的排阻極限。 當(dāng)VR＝Vm+Vs，Kd＝1：說(shuō)明溶質(zhì)完全進(jìn)入凝膠內(nèi)部，此現(xiàn)象稱(chēng)為全滲透，此也為凝膠的滲透極限。 大部分溶質(zhì)：0

66、 3. 與使用的凝膠固定相互相匹配 4. 與所使用的檢測(cè)器相匹配 五、色譜柱的標(biāo)定 目的：用以測(cè)定分子量及分子量分布 方法：用一系列已知分子量的標(biāo)樣制作標(biāo)定曲線(xiàn)。 舉例：中國(guó)藥典中測(cè)定多糖的分子量與分子量分布 1) 系統(tǒng)校正：根據(jù)供試品分子量的大小，選用5個(gè)已知分子量的多糖標(biāo)準(zhǔn)品（如葡聚糖）作標(biāo)定曲線(xiàn)。 lgMw= a + b*tR Mw：標(biāo)樣的已知重均分子量 2）樣品測(cè)定 取供試品溶液，進(jìn)樣，根據(jù)tR帶入標(biāo)定曲線(xiàn)，即可求出多糖的每個(gè)組分相應(yīng)的分子量。 六、應(yīng)用舉例：頭孢曲松鈉中聚合物的檢查 第六節(jié) 高效液相色譜儀及其操作 第七節(jié) 液相色譜儀的基本操作 1．開(kāi)機(jī)前準(zhǔn)備工作：過(guò)濾流動(dòng)相；檢查儲(chǔ)液瓶中是否具有足夠的流動(dòng)相，吸液砂芯過(guò)濾器是否已插入儲(chǔ)液瓶底部；廢液瓶是否已倒空，所有排液管是否已妥善插在廢液瓶中。確定無(wú)誤后，可開(kāi)始操作。 2．開(kāi)啟穩(wěn)壓電源后，依次打開(kāi)輸液泵、柱溫箱、檢測(cè)器和色譜處理機(jī)電源。 3．在輸液泵及檢測(cè)器上設(shè)定所需要的流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等參數(shù)。 4．排出管路氣泡或沖洗管