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第二章 天然藥物化學成分提取分離鑒定的方法與技術 1 2 3 內容 第一節(jié)提取方法與技術 第二節(jié)分離精制方法與技術 第三節(jié)結構研究方法與技術 4 第一節(jié)提取方法與技術 常用的方法有 一 溶劑提取法 最常用 二 水蒸氣蒸餾法 三 升華法四 超臨界流體萃取法 提取 選擇適宜的溶劑和適當?shù)姆椒?將所要的成分盡可能完全地從天然藥物中提取出來 而雜質盡可能少地被提出的過程 5 一 溶劑提取法 一 定義 指根據天然藥物中各化學成分的溶解性能 選擇對有效成分溶解度大而對其他成分溶解度小的溶劑 用適當?shù)姆椒▽⑺杌瘜W成分盡可能完全從藥材組織中溶解提出的方法 在實際工作中應用最普遍 6 溶劑對藥材組織細胞不斷作往返的擴散 滲透 溶解 直至藥材組織細胞內外溶液中被溶解的化學成分的濃度達平衡 擴散 滲透 溶解 7 二 基本原理 相似相溶 親脂性的成分易溶于非極性的溶劑中 親水性的成分易溶于極性的溶劑中 三 溶劑的極性 與介電常數(shù) 有關 介電常數(shù)越大 極性越大 極性從低到高的順序依次是 8 水 極性 低 高 親脂性有機溶劑 親水性有機溶劑 與水分層的有機溶劑 能與水分層的極性最大的有機溶劑 與水可以以任意比例混溶的有機溶劑 極性最大的有機溶劑 極性最小的有機溶劑 9 1 水 為極性最大的溶劑 適用于提取水溶性成分 如 苷類 生物堿鹽 糖類 蛋白質 氨基酸 鞣質 小分子有機酸 有機酸鹽 親水性色素 無機鹽 其中蛋白質不溶于熱水 優(yōu)點 價廉 安全 無毒 對組織穿透力強 缺點 提取液易發(fā)霉 蒸發(fā)濃縮耗能大 含多糖類原料過濾困難 常見溶劑的適用范圍 10 2 親水性有機溶劑 丙酮 乙醇 甲醇 以乙醇最常用 提取范圍較廣 除蛋白質 粘液質 果膠 淀粉 部分多糖和油脂等外 大多天然藥物化學成分能在乙醇中溶解 優(yōu)點 對組織細胞穿透力強 提取全面 毒性小 易過濾 不霉變 易濃縮回收 缺點 價高 易燃 需回流設備 11 3 親脂性有機溶劑 與水不相混溶的石油醚 苯 氯仿 乙酸乙酯等有機溶劑 用以提取揮發(fā)油 苷元 蒽醌類 游離生物堿 黃酮等親脂性成分 優(yōu)點 提取專屬性強 提出物較純 雜質少 易回收濃縮 缺點 價高 易燃 有毒 穿透性差 對設備要求高 12 四 溶劑選擇的原則 基本要求 1 對所提取成分的溶解度大 對雜質的溶解度小 2 對目標組分不起化學反應 3 經濟易得 低毒安全 使用方便 4 沸點適中 易回收 選擇適當?shù)娜軇┦翘崛〔襟E的關鍵 主要根據溶劑的極性 被分離成分的性質 共存的其它成分 雜質 的性質三個方面 13 五 操作方式 1 浸漬法2 滲漉法3 煎煮法4 回流提取法5 連續(xù)回流提取法6 超聲提取法 根據目標組分的極性 熱穩(wěn)定性 揮發(fā)性和溶劑的性質等選用合適的方式 14 1 浸漬法 將藥材用適當?shù)娜軇┰诔鼗驕責?40 60 的情況下浸泡一定時間 以溶出其中成分 乙醇 最常用 水 酸 堿 15 粉碎好的藥材放入提取用的容器中 加入溶劑使沒過藥面 浸泡 濾出溶劑 加入新的溶劑繼續(xù)提取 多重浸漬 加入溶劑浸泡 浸泡后 浸漬法 16 本法適用于有效成分遇熱易破壞以及含大量淀粉 樹膠 果膠 粘液質等多糖藥物的藥材的提取 優(yōu)點 操作方便 簡單易行 缺點 浸出效率較低 故對貴重 有效成分含量低 需制成高濃度制劑的藥材的提取不宜采用 耗時長 溶劑用量大 水提液易發(fā)霉 浸漬法 17 2 滲漉法 將藥材粉末裝在滲漉筒中 不斷添加新溶劑 使其滲透過藥材 自上而下從滲漉筒下部流出浸出液的一種浸出方法 本法適用于有效成分遇熱易破壞的藥材及有效成分含量低的藥材 優(yōu)點 提取效率較高 浸出液較澄清 缺點 耗時長 溶劑用量大 操作麻煩 動態(tài)提取良好的濃度差 18 滲漉法 連續(xù)滲漉裝置 提取溶劑 粉碎藥材 棉花或紗布 滲漉液 19 3 煎煮法 熱提取 只能用水做溶劑 煎煮法是我國最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法 所用容器一般為陶器 砂罐或銅制 搪瓷器皿 不宜用鐵鍋 以免藥液變色 適用于有效成分能溶于水且不易被水 熱破壞的天然藥物的提取 優(yōu)點 簡便易行 缺點 提出雜質多 不能用于提取含揮發(fā)油成分及遇熱不穩(wěn)定性成分的提取 含多糖類豐富的藥材 因煎液粘稠 難以濾過 20 煎煮法 加水煮沸 去渣取汁 21 4 回流提取法 用低沸點 易揮發(fā)的有機溶劑加熱提取天然藥物中有效成分時 需采用回流提取法以減少溶劑的揮發(fā)損失 提高浸出效率 乙醇 甲醇 三氯甲烷 苯 適用于脂溶性較強的天然藥物化學成分的提取 22 回流提取法 優(yōu)點 提取效率較高 缺點 受熱時間較長 不能用于熱不穩(wěn)定性成分的提取 且溶劑消耗量仍大 操作較麻煩 23 5 連續(xù)回流提取法 為了彌補回流提取法中需要溶劑量大 操作較煩瑣的不足 可采用連續(xù)提取法 即用最少量溶劑最大限度地提出有效成分 適用范圍 脂溶性化合物 裝置 脂肪提取器或稱索氏提取器 24 連續(xù)回流 索氏提取 優(yōu)點 提取效率最高 最節(jié)省溶劑 缺點 回流時間長 4 10h 不能用于熱不穩(wěn)定性成分的提取 25 6 超聲提取法 原理 利用超聲波的空化作用對細胞膜的破壞 有助于有效成分的溶出與釋放 超聲波使提取液不斷震蕩 有助于溶質擴散 同時超聲波的熱效應使水溫基本在57 對原料有水浴作用 提取速度快 時間短 收率高 無需加熱 是一種利用超聲波浸提有效成分的方法 助溶 26 1 溶劑性質2 操作方式 方法 3 藥材粉碎度4 溫度5 時間6 其他因素 六 影響提取的因素 選擇合適的溶劑和操作方式是關鍵 27 二 其他提取方法 水蒸氣蒸餾法 是將含有揮發(fā)性成分的藥材與水共蒸餾 使揮發(fā)性成分隨水蒸氣一并餾出 經冷凝分取揮發(fā)性成分的浸提方法 道爾頓分壓定律 P P水 P不溶物質 P等于外界大氣壓的時候 混合物沸騰 因此在常壓下應用水蒸氣蒸餾 能在低于100 的情況下將高沸點組分與水一起蒸出 28 水蒸氣發(fā)生部分 蒸餾部分 冷凝部分 接收器 29 進行水蒸氣蒸餾的物質必須具備以下三個條件 該法適用于具有揮發(fā)性 能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的中草藥成分的提取 主要用于揮發(fā)油的提取 1 不溶或難溶于水 2 共沸下與水不發(fā)生化學反應 3 在100 左右時 必須具有一定的蒸氣壓 30 升華法 有些固體物質受熱后會直接汽化 遇冷后又凝固為原來的固體化合物 該現(xiàn)象稱之為升華 對于具有升華性質的有效成分 可采用升華法提取 如從樟木中提取樟腦 從茶葉中提取咖啡因 此法簡單易行 但在實際提取時很少采用 因為升華所需溫度很高 中草藥容易炭化 炭化后產生的揮發(fā)性的焦油狀物 容易黏附在升華物上 不易精制除去 其次 升華不完全 產率低 有時還伴隨有分解現(xiàn)象 31 超臨界流體萃取法 SFE 利用超臨界流體優(yōu)良的溶解性能對成分進行提取和分離的新技術 特點 流體密度近似液體 粘度與氣體相似 擴散力和滲透性優(yōu)于液體 介電常數(shù)隨壓力增大而增加 有利于溶質的萃取 無溶劑殘留 常用作超臨界流體的物質 二氧化碳 氧化亞氮 乙烷 乙烯和甲苯等 32 表1 天然藥物提取方法小結 33 第二節(jié)分離精制方法與技術 天然藥物粗提液是多種物質的混合 需要進行進一步的分離和精制 分離精制前需濃縮提取液 減壓蒸餾為最常用的方法 去其糟粕 取其精華 旋轉蒸發(fā)儀 34 一 系統(tǒng)溶劑分離法 溶解度差異 二 兩相溶劑萃取法 分配比差異 三 沉淀法 溶解度 酸堿度差異 四 結晶與重結晶法 溶解度差異 五 透析法 分子大小差異六 分餾法 沸點差異七 色譜法 吸附 分配以及親和力差異 分離依據 共存成分的性質差異 尋找差異利用差異 35 一 系統(tǒng)溶劑分離法 是一種按極性由小到大的順序 選用不同極性的溶劑組成溶劑系統(tǒng) 依次分離提取液中各種不同成分 使各溶解度有差異的成分得到分段分離的方法 36 表3 天然藥物成分及其較適用的提取分離溶劑 37 38 二 兩相溶劑萃取法 原理 利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)的差異而達到分離的方法 分配系數(shù)K CU CLCU CL分別為溶質在上相 下相的平衡濃度 K相差越大 分離效率越高 舉例 A B兩種溶質在CHCl3 H2O中進行分配 如A B均為1克 KA 10 KB 0 1 兩相溶劑體積比為VCHCl3 VH2O 1 在分液漏斗中作一次振搖分配平衡后 90 以上的溶質A將分配在上相溶劑 水 中 不到10 的A分配到下相溶劑 氯仿 中 同樣的道理 溶質B分配將與A相反 39 分離難易與分離因子 100時一次簡單萃取即可將二者分開 100 10時 需萃取10 12次 2宜用逆流分溶法 1不能用本法分離 定義 A B兩種溶質在同一溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的比值 注 KA KB 分離因子 KA KB 越大 兩種溶質越易分離 40 分配比與pH 對酸性 堿性及兩性化合物來說 分配比還受溶劑系統(tǒng)pH的影響 因為pH的變化可以改變它們的存在狀態(tài) 游離型或解離型 從而影響在溶劑系統(tǒng)中的分配比 如何利用 41 萃取溶劑的選擇 萃取分離必須滿足兩個條件 1 兩相溶劑必須互不相溶 2 被分離各成分有不同分配系數(shù) 42 1 簡單萃取法 2 pH梯度萃取法 3 逆流連續(xù)萃取法 4 逆流分溶法 兩相溶劑萃取常用方法與技術 43 1 簡單萃取法 萃取操作原則 少量多次 操作注意 1 水提液的相對密度應在1 1 1 2之間 2 防止乳化 實驗室用分液漏斗 一般在水和親脂性有機溶劑中進行 44 2 pH梯度萃取法 利用不同成分的酸堿性的差異 在某一定pH下 某些成分可以成鹽或游離 改變該成分在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)而與其它成分分離 45 3 逆流連續(xù)萃取法 原理 利用兩相互不相溶的溶劑相對密度的不同 使相對密度小的液相做為移動相 逆流穿過相對密度大的作為固定相的相液 借以交換溶質而達到分離的目的 優(yōu)點 操作簡單 避免乳化 溶劑用量小 萃取效率高 46 例如 用氯仿從川楝樹皮的水浸液中萃取川楝素 將氯仿盛于萃取管內 而比重小于氯仿的水提取濃縮液貯于高位容器內 開啟活塞 則水浸液在高位壓力下流入萃取管 遇瓷圈撞擊而分散成細粒 使與氯仿接觸面增大 萃取就比較完全 逆流連續(xù)萃取法 如果一種藥材的水浸液需要用比水輕的苯 乙酸乙酯等進行萃取 則需將水提濃縮液裝在萃取管內 而苯 乙酸乙酯貯于高位容器內 47 4 逆流分溶法 此法相當于多次萃取 對于分離具有非常相似性質的混合物效果較好 50時采用 在No 0漏斗中溶入溶質并加入流動相 振搖使兩相溶劑充分混合 靜置分層后 分出流動相 令其移入No 1管 再在No 0管中補加新鮮流動相 再次振搖混合 靜置分層并進行轉移 如此連續(xù)不斷地操作下去 溶質即在兩相溶劑中 不斷地重新分配并達到分離的目的 48 三 沉淀法 指在天然藥物的提取液中加入某些試劑 使部分物質生成沉淀或降低溶解性而從溶液中析出 從而獲得有效成分或去除雜質的方法 49 1 酸堿沉淀法 通過加入酸 堿以調節(jié)溶液pH值改變分子的存在狀態(tài) 從而改變溶解度而達到分離的目的 50 50 A 酸 堿法 酸提取堿沉淀法 生物堿的提取 純化 51 B 堿 酸法 堿提取酸沉淀法 黃酮 蒽醌等酚性成分的提取 純化 52 2 試劑沉淀法 利用一些成分能與某些試劑產生沉淀的性質 或利用某些成分在不同溶劑中溶解度的差異 通過加入特定試劑或者溶劑 使生成沉淀 從而與其他成分分離 舉例1 在生物堿鹽的溶液中 加入某些生物堿沉淀試劑 見生物堿性質下 則生物堿生成不溶性復鹽而析出 水溶性生物堿難以用萃取法提取分出 常加入雷氏銨鹽使生成生物堿雷氏鹽沉淀析出 膽固醇與甾體皂苷生成沉淀 蛋白質與鞣質形成沉淀等 化學反應試劑生成不溶性物質 53 水提醇沉法 除去多糖 蛋白質 淀粉 無機鹽等水溶性雜質 醇提水沉法 除去脂溶性的油脂 樹脂 葉綠素等水不溶性雜質 天然藥物中大多數(shù)化學成分易溶于水和醇 加入極性不同試劑改變溶解度 舉例2 54 3 鉛鹽沉淀法 鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經典方法之一 堿式醋酸鉛在水及醇溶液中 能與多種中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡鹽沉淀 故可利用這種性質使有效成分與雜質分離 中性醋酸鉛可與酸性物質或某些酚性物質結合成不溶性鉛鹽 脫鉛法 1 硫化氫脫鉛法 PbS沉淀 2 硫酸 磷酸及其鈉鹽脫鉛法 3 離子交換脫鉛法 55 四 結晶和重結晶法 結晶和重結晶是利用固體混合物中各種成分在溶劑中的溶解度的差別 使所需成分以結晶狀態(tài)析出 達到分離精制的目的 可獲得較純的單體 使物質從液態(tài)或氣態(tài)形成晶體的方法即結晶法 將不純的結晶進一步精制成較純的結晶的過程稱重結晶 在溶液中 溶質的過飽和是其結晶的驅動力 天然藥化最常采用的結晶法為降溫結晶法 56 結晶溶劑的選擇 1 不與結晶物質發(fā)生化學反應 2 對結晶物質的溶解度隨溫度不同有顯著差異 熱時溶解度大 冷時溶解度小 對可能存在的雜質溶解度非常大或非常小 3 沸點適中 不宜過高或過低 35 135 常用溶劑有水 甲醇 乙醇 丙酮 乙酸乙酯 三氯甲烷等 4 若無理想單一溶劑時 還可用混合溶劑 57 采用試驗的方法選擇合適的溶劑 例如 取0 1g目標物質于一小試管中 滴加約1mL溶劑 加熱至沸 若完全溶解 且冷卻后能析出大量晶體 這種溶劑一般認為合用 如樣品在冷時或熱時 都能溶于1mL溶劑中 則這種溶劑不合用 若樣品不溶于1mL沸騰溶劑中 再分批加入溶劑 每次加入0 5mL 并加熱至沸 總共用4mL熱溶劑 而樣品仍未溶解 這種溶劑也不合用 若樣品溶于4mL以內的熱溶劑中 冷卻后仍無結晶析出 這種溶劑也不合用 如果難于選擇一種適宜的溶劑 可考慮選用混合溶劑 混合溶劑一般由兩種能互相溶解的溶劑組成 目標物質易溶于其中之一種溶劑 而難溶于另一種溶劑 58 食鹽晶體 單晶冰糖 薄荷醇晶體 小檗堿晶體 59 結晶的條件 溶劑 雜質的去除 有效成分的含量 溶液的濃度 溫度 時間等 判斷結晶純度的方法 1 晶形 色澤 初判 2 熔點測定 純品 熔距小 3 薄層色譜法 用三種以上不同展開系統(tǒng) 只出現(xiàn)一個斑點時可初步判斷為單一成分 4 光譜測定 紫外光譜 紅外光譜 60 待分離混合物 飽和溶液 結晶 粗結晶 溶于選擇的溶劑 加熱成飽和溶液 熱過濾 放置 冷藏 析晶 過濾 重復上述操作 重結晶 結晶操作步驟 61 注水孔 加入水的高度為漏斗高度的的3 4 4 5 酒精燈加熱處 手柄 鐵夾固定處 熱濾漏斗 62 放入短頸玻璃漏斗和菊花形濾紙一起加熱 熱過濾操作示意圖 63 五 透析法 利用透析膜具有選擇性透過特點 使提取液中小分子物質可順通過透析膜 而大分子物質不能通過 從而使分子量差異較大的物質獲得分離的方法 適用于分離純化天然藥物化學成分中的大分子物質 如皂苷 蛋白 多肽 多糖等 64 六 分餾法 利用各沸點不同的化合物 在分餾過程中產生高低不同的蒸氣壓 從而收集到不同沸點溫度的餾分 達到分離的目的 一般情況下 液體混合物沸點相差100 以上時 可用蒸餾法 沸點相差25 以下時 需用分餾柱 沸點相差越小 則需要的分餾裝置越精細 適用于分離天然藥物中得到的沸點相差比較小的液體混合物 如揮發(fā)油 一些液體生物堿的分離 65 簡單分餾裝置 分餾柱 66 七 色譜法 下一次課 薄層色譜 柱色譜 紙色譜 67 思考題 1 天然藥物有效成分的提取方法主要有哪幾種 選擇的依據是什么 2 溶劑提取的操作方法有哪些 各有何特點 3 如何選擇合適的重結晶溶劑 4 兩相溶劑萃取法是依據什么原理進行的 在實際工作中如何選擇溶劑 68 69 浸漬法 滲漉法 煎煮法 回流提取法 連續(xù)回流提取法 其使用范圍及特點見下表 70 謝謝 71