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專題十六　基因工程和細(xì)胞工程 1．(2018深圳調(diào)研)葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因整合到葉綠體基因組中，該技術(shù)能有效改良植物的品質(zhì)。請(qǐng)回答： (1)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心步驟是__基因表達(dá)載體的構(gòu)建__，完成該步驟所需要的酶有__限制酶和DNA連接酶__。 (2)將植物體細(xì)胞處理得到原生質(zhì)體，再通過__農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法__或__基因槍__法，將目的基因?qū)朐|(zhì)體，使原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁之后，通過__植物組織培養(yǎng)__技術(shù)培養(yǎng)可得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因幼苗。 (3)來自原核生物中有重要價(jià)值的外源基因，無需改造和修飾就可在葉綠體中高效表達(dá)，就此分析，原因是__葉綠體DNA與原核生物DNA結(jié)構(gòu)類似(由于葉綠體大多數(shù)基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)均與原核生物類似)__。 (4)對(duì)大多數(shù)高等植物而言，與傳統(tǒng)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因相比，葉綠體轉(zhuǎn)基因更穩(wěn)定，其遺傳方式__不遵循__(答“遵循”或“不遵循”)分離定律，不會(huì)隨__花粉__(“花粉”或“卵細(xì)胞”)傳給后代，從而保持了__母本__(“父本”或“母本”)的遺傳特性。 [解析]　(1)基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，所需要的酶有限制酶和DNA連接酶；(2)植物細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁之后，通過植物組織培養(yǎng)獲取幼苗；(3)葉綠體DNA與原核生物DNA結(jié)構(gòu)類似。(4)分離定律適用于有性生殖過程中細(xì)胞核遺傳，故葉綠體轉(zhuǎn)基因不遵循分離定律，為母系遺傳。 2．(2018天津市和平區(qū)生物一模)已知某傳染性疾病的病原體為RNA病毒，該病毒表面的A蛋白為主要抗原。疫苗的生產(chǎn)和抗體的制備流程如圖1所示。請(qǐng)回答下列問題： (1)過程①代表的是__逆轉(zhuǎn)錄__，過程③構(gòu)建A基因重組載體時(shí)，啟動(dòng)子和終止子是重新構(gòu)建的，它們應(yīng)該能被受體細(xì)胞的__RNA聚合酶__所識(shí)別，以便于其催化轉(zhuǎn)錄過程。 (2)如圖2為A基因的結(jié)構(gòu)示意圖，已知Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個(gè)，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個(gè)，空白區(qū)域中G和C的總數(shù)共有400個(gè)，則由該區(qū)域能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA中A和U總數(shù)是__400__個(gè)。 (3)在給小鼠皮下注射A蛋白時(shí)，要重復(fù)注射幾次的目的是通過二次免疫，增加小鼠體內(nèi)的__漿細(xì)胞__數(shù)目。 (4)在將X進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)前，至少需要經(jīng)過2次篩選，第一次是將__雜交瘤細(xì)胞__篩選出來，第二次是將__能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞__篩選出來。 (5)對(duì)健康人進(jìn)行該傳染病免疫預(yù)防時(shí)，可選用圖中基因工程生產(chǎn)的__A蛋白__來制備疫苗。對(duì)該傳染病疑似患者確診時(shí)，可以從疑似患者體內(nèi)分離出病毒與已知病毒進(jìn)行核酸序列比較，或用圖中的__抗A蛋白的單克隆抗體__與分離出的病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)。 [解析]　(1)由以上分析可知①是逆轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。(2)已知圖中Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個(gè)，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個(gè)，則空白區(qū)域中堿基總數(shù)為1200個(gè)，又已知空白區(qū)域中G和C的總數(shù)為400個(gè)，則A＋T總數(shù)為800個(gè)，每條鏈中A＋T總數(shù)為400個(gè)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，由該區(qū)轉(zhuǎn)錄形成的成熟mRNA中A和U總數(shù)也是400個(gè)。(3)在給小鼠皮下注射A蛋白時(shí)，要重復(fù)注射幾次的目的是通過二次免疫，增加小鼠體內(nèi)的漿細(xì)胞數(shù)目。(4)在將X進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)前，至少需要經(jīng)過2次篩選，第一次是用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次是采用抗體陽性檢測(cè)法篩選出能夠產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。(5)對(duì)健康人進(jìn)行該傳染病免疫預(yù)防時(shí)，可選用圖中基因工程生產(chǎn)的A蛋白所制備的疫苗。對(duì)該傳染病疑似患者確診時(shí)，可以從疑似患者體內(nèi)分離出病毒，與已知病毒進(jìn)行核酸序列比較；或采用抗原—抗體雜交法，即用圖中的抗A蛋白的單克隆抗體進(jìn)行特異性結(jié)合檢測(cè)。 3．如圖為三種質(zhì)粒和一個(gè)含目的基因的DNA片段，其中ApR為氨芐青霉素抗性基因，TcR為四環(huán)素抗性基因，lacZ為藍(lán)色顯色基因，EcoR Ⅰ(0.7 kb)、Pvu Ⅰ(0.8 kb)等為限制酶和其切割位點(diǎn)及其與復(fù)制原點(diǎn)之間的距離。已知1 kb＝1 000個(gè)堿基對(duì)，請(qǐng)回答下列問題： (1)片段D為目的基因中的某一片段，則DNA聚合酶和DNA連接酶的作用形成的鍵依次是__②__(填圖中數(shù)字)。 (2)圖中作為目的基因運(yùn)載體最理想的質(zhì)粒是__B__(填“A”“B”或“C”)，請(qǐng)據(jù)圖分析，其他兩種質(zhì)粒一般不能作為運(yùn)載體的理由分別是__質(zhì)粒A不含有標(biāo)記基因；質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時(shí)，復(fù)制原點(diǎn)會(huì)被破壞，使該質(zhì)粒無法進(jìn)行復(fù)制__。 (3)用EcoR Ⅰ全酶切目的基因和質(zhì)粒B形成的重組質(zhì)粒，并進(jìn)行電泳觀察，可出現(xiàn)長(zhǎng)度分別為1．1 kb和__5.6__kb的兩個(gè)片段，或者長(zhǎng)度分別為__3.6_kb和3.1_kb__的兩個(gè)片段(重組質(zhì)粒上目的基因的插入位點(diǎn)與EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn)之間的堿基對(duì)忽略不計(jì))。 (4)將分別用限制酶PvuⅠ切開的質(zhì)粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，進(jìn)行大腸桿菌受體細(xì)胞導(dǎo)入操作，則受體細(xì)胞的類型包含__ABD__(多選)。 A．ApR藍(lán)色　　 B．ApR白色 C．ApS、藍(lán)色　　 D．ApS白色 (5)動(dòng)物基因工程通常以受精卵作為受體細(xì)胞的根本原因是__B__。 A．受精卵能使目的基因高效表達(dá) B．受精卵可發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體 C．受精卵更易接受DNA的插入 D．受精卵體積較大，便于DNA導(dǎo)入操作 [解析]　(1)DNA聚合酶和DNA連接酶的作用形成的鍵均為磷酸二酯鍵，因此都應(yīng)為②。(2)由題圖可知，切割目的基因應(yīng)用PvuⅠ，但該限制酶會(huì)將c質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)破壞，使該質(zhì)粒無法進(jìn)行復(fù)制，而質(zhì)粒A不含有標(biāo)記基因，因此兩者都不能作為運(yùn)載體。(3)根據(jù)題意，質(zhì)粒B長(zhǎng)度為2.7 kb，目的基因長(zhǎng)度為4.0 kb，所以重組質(zhì)粒長(zhǎng)度為6.7 kb，如果出現(xiàn)長(zhǎng)度為1．1 kb的一個(gè)片段，則另外一個(gè)片段的長(zhǎng)度為5.6 kb。若目的基因與運(yùn)載體反向連接，可形成長(zhǎng)度分別為3.1 kb和3.6 kb的兩個(gè)片段。(4)將分別用限制酶PvuⅠ切開的質(zhì)粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，可得到質(zhì)粒自身環(huán)化形成的普通質(zhì)粒、重組質(zhì)粒和目的基因自身連接的DNA環(huán)三種類型。如果導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒，受體細(xì)胞的類型為A(ApR、藍(lán)色)，如果導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，受體細(xì)胞的類型為B(ApR、白色)，如果導(dǎo)入的是DNA環(huán)，受體細(xì)胞的類型為D(ApS、白色)。(5)動(dòng)物基因工程通常選用受精卵作為受體細(xì)胞的根本原因是受精卵可發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。 4．人乳頭狀瘤病毒(HPV)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，抗HPV的單克隆抗體可以準(zhǔn)確檢測(cè)出HPV，從而及時(shí)監(jiān)控宮頸癌的發(fā)生，以下是以HPV衣殼蛋白為抗原制備出單克隆抗體的過程，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題： (1)單克隆抗體制備過程中涉及的細(xì)胞工程技術(shù)有__動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞融合__。 (2)若要分析雜交瘤細(xì)胞中染色體，可通過__解離、漂洗、染色和制片__等過程制成裝片，然后在顯微鏡下觀察。雜交瘤細(xì)胞中染色體數(shù)目與普通淋巴細(xì)胞相比具有的特點(diǎn)是__染色體數(shù)目加倍__，在HAT培養(yǎng)基上存活的細(xì)胞可能包括__①②③__(填下列序號(hào))。 ①無抗體分泌的細(xì)胞 ②抗HPV抗體的分泌細(xì)胞 ③其他無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞 (3)對(duì)于抗體檢測(cè)呈__陽__性的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，克隆化的方法最常用的是有限稀釋法，即稀釋細(xì)胞到3～10個(gè)/ mL，每孔加入細(xì)胞稀釋液__0.1__mL，使每個(gè)孔內(nèi)不多于一個(gè)細(xì)胞，達(dá)到單克隆培養(yǎng)的目的。 (4)由上述過程生產(chǎn)出的單克隆抗體不能直接用于人體，理由是__小鼠形成的抗體對(duì)人體來說是抗原，存在著排異反應(yīng)__。 (5)科學(xué)家從某些無限增殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分離出了無限增殖調(diào)控基因(prG)，該基因能激發(fā)動(dòng)物細(xì)胞分裂，這為單克隆抗體的制備提供了更多的思路。除本題描述的制備單克隆抗體技術(shù)外，請(qǐng)?jiān)俸?jiǎn)要寫出一種制備單克隆抗體的思路。 __通過基因工程向漿細(xì)胞中導(dǎo)入prG；利用核移植技術(shù)將漿細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的無限增殖細(xì)胞中(答對(duì)其一即可)__。 [解析]　(2)利用顯微鏡觀察有絲分裂過程中的染色體，需先制作臨時(shí)裝片；雜交瘤細(xì)胞中含有漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的染色體，所以比普通淋巴細(xì)胞的染色體數(shù)目多一倍；在HAT培養(yǎng)基上生存的細(xì)胞均為雜交細(xì)胞，這些雜交細(xì)胞中有分泌HPV抗體的細(xì)胞，有分泌其他抗體的細(xì)胞，也有不能分泌抗體的細(xì)胞。(3)抗體檢驗(yàn)呈陽性，說明該雜交瘤細(xì)胞可產(chǎn)生所需抗體；為保證每個(gè)小孔不多于一個(gè)細(xì)胞，根據(jù)濃度可推斷加入細(xì)胞稀釋液的量：設(shè)加入細(xì)胞稀釋液的最大量是X，則10個(gè)/ mLX＝1個(gè)，X＝0.1 mL。(4)小鼠形成的抗體與人體抗體不同，故在人體內(nèi)可引起免疫反應(yīng)，所以上述過程生產(chǎn)出的單克隆抗體不能直接用于人體。(5)根據(jù)所給信息可知，還可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或核移植技術(shù)獲得既能大量增殖，又能產(chǎn)生特定抗體的雜交細(xì)胞。 5．(2017陜西西安長(zhǎng)安一中第一次檢測(cè))下圖是植物體細(xì)胞雜交過程示意圖，請(qǐng)據(jù)圖回答： (1)植物體細(xì)胞雜交的第①步是去掉細(xì)胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體。目前此步驟最常用的方法是酶解法，也就是在溫和的條件下用__纖維素酶、果膠酶__等分解植物的細(xì)胞壁。 (2)②過程的發(fā)生，必須進(jìn)行人工誘導(dǎo)。人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的化學(xué)方法是用__聚乙二醇__試劑作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合。動(dòng)物細(xì)胞融合還常用到__滅活的病毒__作為誘導(dǎo)劑。 (3)與過程③密切相關(guān)的具有單層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器為__高爾基體__。 (4)④過程稱為__脫分化__，⑤過程稱為__再分化__。若利用此技術(shù)生產(chǎn)治療癌癥的藥物——紫杉醇，培養(yǎng)將進(jìn)行到__e__(填字母編號(hào))即可。 (5)植物體細(xì)胞雜交在育種工作中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，其突出的優(yōu)點(diǎn)是可以__克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙__。 [解析]　(1)植物體細(xì)胞雜交的第①步是用纖維素酶和果膠酶去掉細(xì)胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體。(2)人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的化學(xué)方法是用聚乙二醇試劑作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合。動(dòng)物細(xì)胞融合還常用到滅活的病毒作為誘導(dǎo)劑。(3)過程⑧是雜種細(xì)胞生出細(xì)胞壁，高爾基體與植物細(xì)胞壁形成有關(guān)。(4)④⑤過程分別為脫分化和再分化，治療癌癥的藥物——紫杉醇是從紫杉細(xì)胞中提取的，只需將植物組織培養(yǎng)進(jìn)行到愈傷組織階段即可。(5)植物體細(xì)胞雜交在育種工作中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，其突出的優(yōu)點(diǎn)是可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，大大擴(kuò)展可用于雜交的親本組合范圍。 6．(2018全國卷Ⅱ)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。某科研團(tuán)隊(duì)將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1－GFP融合基因(簡(jiǎn)稱為甲)，并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達(dá)載體P1，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點(diǎn)的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。 回答下列問題： (1)據(jù)圖推斷，該團(tuán)隊(duì)在將甲插入質(zhì)粒P0時(shí)，使用了兩種限制酶，這兩種酶是__E1和E4__。使用這兩種酶進(jìn)行酶切是為了保證__甲的完整__，也是為了保證__甲與載體正確連接__。 (2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細(xì)胞后，若在該細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細(xì)胞中完成了__轉(zhuǎn)錄__和__翻譯__過程。 (3)為了獲得含有甲的牛，該團(tuán)隊(duì)需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的__細(xì)胞核__移入牛的__去核卵母細(xì)胞__中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)為了檢測(cè)甲是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，某同學(xué)用PCR方法進(jìn)行鑒定，在鑒定時(shí)應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的__核DNA__(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。 [解析]　(1)由題意可知，L1基因和GFP基因合成了L1－GFP融合基因(簡(jiǎn)稱為甲)，題圖中顯示了四個(gè)酶切位點(diǎn)，當(dāng)將L1－GFP融合基因插入質(zhì)粒P0時(shí)，可用E1和E4限制酶進(jìn)行酶切，用這兩種酶進(jìn)行酶切不會(huì)破壞甲的完整性，同時(shí)能保證甲按照正確的方向與載體連接。 (2)若在牛皮膚細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1－GFP融合基因得到表達(dá)，即目的基因在受體細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)錄和翻譯合成了熒光蛋白。 (3)為了獲得含有甲的牛，可將含有目的基因的細(xì)胞的細(xì)胞核移入牛的去核卵母細(xì)胞中，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，可以檢測(cè)目的基因是否存在。PCR擴(kuò)增的模板是DNA。 7．(2018天津卷)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成對(duì)應(yīng)DNA后，利用__PCR__技術(shù)擴(kuò)增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個(gè)別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達(dá)時(shí)不能合成完整長(zhǎng)度的__多肽(或蛋白質(zhì))__，因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒，并保存。 (2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。設(shè)計(jì)合成一種特殊tRNA的基因，其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對(duì)結(jié)合，并可攜帶一個(gè)非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與__載體__連接后導(dǎo)入宿主細(xì)胞。提取宿主細(xì)胞的__總RNA__進(jìn)行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達(dá)上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。 (3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，并在補(bǔ)加__非天然氨基酸(Uaa)__的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，則該宿主細(xì)胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產(chǎn)生大量子代病毒，用于制備疫苗。 特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，識(shí)別其啟動(dòng)子的酶是__D__(單選)。 A．病毒的DNA聚合酶　　 B．宿主的DNA聚合酶 C．病毒的RNA聚合酶　　 D．宿主的RNA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主細(xì)胞中增殖，沒有致病性，因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優(yōu)勢(shì)之一是可引起__細(xì)胞__免疫，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。 [解析]　(1)體外進(jìn)行DNA擴(kuò)增采用的技術(shù)手段是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))。將基因內(nèi)個(gè)別編碼氨基酸的序列改造成編碼終止密碼子的序列后，在翻譯時(shí)終止密碼子提前出現(xiàn)，不能合成完整長(zhǎng)度的多肽(或蛋白質(zhì))。 (2)為了使目的基因能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并正常表達(dá)，需要將目的基因與載體(運(yùn)載體)連接后導(dǎo)入受體細(xì)胞。利用分子雜交技術(shù)鑒定，篩選獲得成功表達(dá)目的RNA的細(xì)胞時(shí)，需提取宿主細(xì)胞的總RNA。 (3)將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞內(nèi)由于沒有Uaa，翻譯將會(huì)在終止密碼子處停止，將不能翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻譯出完整蛋白，需要在培養(yǎng)基中加入U(xiǎn)aa。轉(zhuǎn)錄時(shí)，識(shí)別啟動(dòng)子的酶為RNA聚合酶，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄在宿主細(xì)胞中進(jìn)行，所以轉(zhuǎn)錄用的酶為宿主細(xì)胞的RNA聚合酶。 (4)不具有感染性的滅活病毒不能進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，只會(huì)引發(fā)體液免疫，而減毒的活疫苗雖然不能在人體細(xì)胞內(nèi)正常增殖，但可以侵入人體細(xì)胞，能引起人體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。 8．(2018江蘇卷)為生產(chǎn)具有特定性能的α－淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α－淀粉酶基因(1 656個(gè)堿基對(duì))，利用基因工程大量制備α－淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程見下圖。請(qǐng)回答下列問題： (1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α－淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的__基因組DNA__。 (2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的__5′__端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是__使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連__。 (3)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中__②__的設(shè)定與引物有關(guān)，__⑥__的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。(填序號(hào)) ①變性溫度?、谕嘶饻囟取、垩由鞙囟取、茏冃詴r(shí)間?、萃嘶饡r(shí)間　⑥延伸時(shí)間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α－淀粉酶的mRNA的部分堿基序列： 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含__8__個(gè)密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測(cè)虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有__13__種。 (5)獲得工程菌表達(dá)的α－淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性，結(jié)果如下： 緩沖液 50 mmol/L Na2HPO4－KH2PO4 50 mmol/L Tris－HCl 50 mmol/L Gly－NaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對(duì)活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該α－淀粉酶活性最高的條件為__pH為8.5，緩沖液為50_mmol/L Tris－HCl__。 [解析]　(1)利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增α－淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的基因組DNA作為模板，并依據(jù)α－淀粉酶基因兩端的部分核苷酸序列合成兩條引物。 (2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，只能從3′端延伸DNA子鏈，為了便于擴(kuò)增的 DNA 片段與表達(dá)載體連接，需在引物的5′端加上限制性酶切位點(diǎn)，并且要注意在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，這樣既能防止目的基因、載體的自身連接，又能確保目的基因與表達(dá)載體的定向連接。 (3)PCR技術(shù)包括變性、退火(復(fù)性)和延伸三步，變性溫度決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA的解鏈，且時(shí)間很短；退火時(shí)引物結(jié)合到互補(bǔ)的DNA單鏈上，退火溫度由引物復(fù)性溫度決定，其溫度設(shè)定與引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度等有關(guān)；延伸時(shí)間與產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度有關(guān)，產(chǎn)物在1 kb以內(nèi)的延伸時(shí)間為1 min左右，3～4 kb的延伸時(shí)間為3～4 min。 (4)圖中虛線框內(nèi)共含有24個(gè)堿基，mRNA上3個(gè)相鄰的堿基編碼1個(gè)氨基酸，故共包含8個(gè)密碼子。虛線框后的第1個(gè)密碼子的第1個(gè)堿基是U，第2和第3個(gè)堿基各有4種可能性，因此共16種可能性。題干表明控制α－淀粉酶的基因有1 656個(gè)堿基對(duì)，說明圖中虛線框后的第一個(gè)密碼子肯定不是終止密碼子(3種終止密碼子為UAA、UAG、UGA)，故虛線框后第一個(gè)密碼子實(shí)際最多有16－3＝13種可能性。 (5)分析表格中的數(shù)據(jù)，酶相對(duì)活性最高為99.5%，對(duì)應(yīng)的條件是pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris－HCl。