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目的基因的原核誘導表達及SDS PAGE凝膠電泳 現(xiàn)代分子生物學大實驗 實驗目的 重點掌握表達載體構(gòu)建的原理及方法掌握目的基因原核誘導表達的原理及方法了解目的蛋白質(zhì) 標簽 純化的基本原理和方法掌握PAGE變性凝膠電泳的原理及方法掌握考馬斯亮藍染色的方法 目的蛋白質(zhì)的誘導表達目的蛋白質(zhì)的純化目的蛋白質(zhì)的檢測 實驗原理 蛋白質(zhì)的表達 將克隆基因插入合適載體后導入宿主細胞表達大量蛋白質(zhì)的方法 體內(nèi)很難分析單個蛋白質(zhì)的作用進行大量表達和純化是為了在體外進行研究應(yīng)用于蛋白純化 定位及功能分析等方面 實驗原理 圖pET14b His TAT EGFP p38 16peptides融合蛋白在Hela細胞中的熒光顯微鏡檢測 400 例 酵母表達系統(tǒng)昆蟲表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達的蛋白具有正常的活性 構(gòu)象技術(shù)難度較大 耗時 耗資 大腸桿菌表達系統(tǒng)實驗技術(shù)簡單 時間較短 費用低 系統(tǒng)比較完備不能有效地對重組蛋白質(zhì)進行修飾加工 易形成包涵體 原核細胞表達系統(tǒng)真核細胞表達系統(tǒng) 實驗原理 原核細胞表達系統(tǒng)菌株菌株內(nèi)源的蛋白酶過多 可能會造成外源表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定 所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達菌株 堪稱經(jīng)典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型 也是我們非常熟悉的表達菌株 大名鼎鼎的BL21 DE3 融源菌則是添加T7聚合酶基因 為T7表達系統(tǒng)而設(shè)計 實驗原理 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建目的基因表達載體 實驗原理 目的基因 DNA PCR 酶切 Primer例 p38中抑制多肽16肽序列GGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTGATCAGTTGAAGCTCF5 ACGGATCCTAGGAAGAACATTGTTTCCTGGT 3 R5 ACGGATCCTTAGAGCTTCAACTGATCAATATGG 3 5 端引物中AC是隨機保護堿基 GGATCC是BamHI酶切位點 TA是為防止移碼而引入的兩個堿基 隨后是編碼16肽前7個氨基酸的堿基序列 3 端引物中AC是隨機保護堿基 GGATCC是BamHI酶切位點 TAA是終止密碼子的反向互補序列 隨后是從編碼16肽堿基序列的最后一個堿基開始的反向互補序列 實驗原理 表達載體能將外源基因運載到大腸桿菌細胞中 在基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達元件 就構(gòu)成了表達載體 元件啟動子 終止子 核糖體識別序列誘導性表達所需要的元件操縱子序列調(diào)控基因多克隆位點融合Tag復制起始序列篩選標記 報告基因各種表達載體的不同之處在于其表達元件的差異 實驗原理 啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一 從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達和誘導調(diào)控型表達 lac和Tac PL和PR T7是最常用的啟動子 轉(zhuǎn)錄終止子核糖體結(jié)合位點 啟動子 終止子 核糖體識別序列 操縱子序列及配套的調(diào)控基因 誘導性表達所需要的元件 多克隆位點復制起始序列 實驗原理 用作分離的載體蛋白被稱為標簽蛋白或標簽多肽 Tag 標簽位于表達載體的多克隆位點的N端或者C端 能夠與目的基因融合表達 N端或者C端融合表達 目前常用的標簽有組氨酸標簽 His Tag 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶 glutathioneStransferase 標簽 GST Tag 硫氧還蛋白 thioredoxin Trx 標簽麥芽糖結(jié)合蛋白 MaltoseBindingProtein MBP 蛋白質(zhì)A proteinA 纖維素結(jié)合位點 cellulosebindingdomain 標簽等 一般對于小分子用較大的Tag 如GST 以獲得穩(wěn)定表達 而一般的基因多選擇小Tag 如His 減少對目的蛋白的影響 實驗原理 篩選標記 報告基因表達抗藥性基因 Amp是最常見的篩選標記 kana 新霉素 四環(huán)素 紅霉素和氯霉素 抗性基因的選擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾 比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用 GFP 綠色熒光蛋白 是最常用的報告基因了 半乳糖苷酶 熒光素酶 一些融合表達Tag也有報告基因的功能 實驗原理 常用表達載體pGEX系列載體是谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶 GST 融合蛋白表達系統(tǒng)的載體 PtacPromoterAmppGEX KGpET系列的載體是His6融合蛋白的表達載體 T7KanapET 14b 實驗原理 目的蛋白質(zhì)的誘導表達lacIq Lactose lacI是大腸桿菌中l(wèi)ac操縱子 Operon 的調(diào)節(jié)基因 它所表達的阻遏蛋白是lac操縱基因 Operator 的抑制因子 抑制轉(zhuǎn)錄啟動 當有乳糖存在時 這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結(jié)合而失去對操縱基因的抑制 使lac操縱子上的結(jié)構(gòu)基因lacZ 半乳糖苷酶 lacY 透性酶 lacA 乙酰基轉(zhuǎn)移酶 得以正常表達 啟動轉(zhuǎn)錄 IPTG 異丙基 D 1 硫代半乳糖苷 作為乳糖的類似物與lacI阻遏蛋白結(jié)合而使操縱基因不被抑制 因此IPTG經(jīng)常作為lac操縱子的誘導劑而使用 實驗原理 實驗原理 BamHI 酶切 NdeI 基因片段 酶切后的目的基因 酶切 連接 轉(zhuǎn)化 篩選 藍白斑 鑒定 PCR 酶切 測序 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建成功 原核表達的誘導條件IPTG濃度 0 01 5mmol L誘導時間 3h誘導溫度 15 42 實驗原理 目的蛋白質(zhì)的純化破碎細胞超聲破碎溶菌酶裂解從細胞蛋白中純化出GST和His融合蛋白GST可以通過谷胱甘肽 瓊脂糖親和層析進行純化 由于GST對谷胱甘肽的親和力非常高 因此可以利用谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST及其融合蛋白進行純化 最后通過含有游離的谷胱甘肽的緩沖液 洗脫結(jié)合的GST融合蛋白 PolyHis多聚組氨酸能與多種過渡金屬或過渡金屬鰲和物結(jié)合 因此帶HIS 6的蛋白能結(jié)合與固化的Ni2 樹脂 用適當?shù)木彌_液 PBS 洗沖洗去除其他雜蛋白后 再用可溶的競爭性鰲合劑 咪唑 洗脫可以回收靶蛋白 實驗原理 目的蛋白質(zhì)的檢測蛋白質(zhì)分子量的檢測SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的分析 實驗原理 十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS PAGE 是目前用于測定蛋白質(zhì)分子量最好的方法 SDS是一種強陰離子型去污劑 能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵 使分子去折疊 破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu) 在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后 強還原劑例如 巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂 通過加熱使蛋白質(zhì)解離 解離后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì) SDS復合物 實驗原理 蛋白質(zhì)中加入SDS并加熱 SDS分子上的非極性區(qū) 黃色尾巴 會與蛋白質(zhì)上的非極性區(qū)結(jié)合 使蛋白質(zhì)變性 成為一線狀長條分子 上面布滿SDS分子 SDS分子的極性區(qū) 洋紅色圓點 則露在外面 以增加親水性 SDS是一種陰離子表面活性劑 能打斷氫鍵和疏水鍵 并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復合物 使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷 掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子間的天然的電荷差異 SDS最終使蛋白質(zhì)變成具有高負電荷的線狀分子 97 0kDa 實驗準備 誘導 培養(yǎng)37 恒溫搖床電泳檢測HoeferminiVEVerticalElectrophoresisSystem 儀器與設(shè)備 LB培養(yǎng)基 Amp IPTG30 丙烯酰胺貯液1 0MTris PH6 8 濃縮膠 1 5MTris PH8 8 分離膠 10 SDS 10 過硫酸銨 AP 四甲基乙二銨 TEMED 1XTris 甘氨酸電泳緩沖液 25mMTris 250mM甘氨酸 0 1 SDS1xSDS上樣緩沖液 50mMTris HCl 6 8 100mMDTT 2 SDS 10 甘油 0 1 溴酚藍染色液 90甲醇 90冰乙酸 20水 0 5gR 250脫色液 90甲醇 90冰乙酸 20水 實驗試劑 實驗步驟 培養(yǎng)誘導樣品制備SDS PAGE凝膠檢測 實驗步驟 1 挑取單菌落 接入3ml含氨芐青霉素 50ug ml 的LB培養(yǎng)液 37 培養(yǎng)過夜 2 取50ul過夜培養(yǎng)物接入3ml含氨芐青霉素 50ug ml 的LB培養(yǎng)液 37 振蕩培養(yǎng)2h以上 至對數(shù)中期 A600 0 5 0 6 3 吸出500ul未經(jīng)誘導的培養(yǎng)物放在一個微量離心管中 室溫高速離心1min 沉淀懸浮于100ul1xSDS凝膠加樣緩沖液 100度加熱3min 室溫高速離心1min 冰上放置 4 在剩余培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度1mmol L 37 繼續(xù)培養(yǎng)3h 取500ul樣品放于微量離心管中 室溫高速離心1min 5 沉淀懸浮于100ul1xSDS凝膠加樣緩沖液 100度加熱3min 室溫高速離心1min 冰上放置 待全部樣品處理完后上樣 目的蛋白質(zhì)的誘導表達及檢測 6 將電泳槽玻璃板洗凈 吹干 并用凡士林封邊 安裝好7 配12 分離膠 將配好的分離膠立即倒入凝膠槽內(nèi) 至凝膠槽高三分之二處 加蒸餾水密封 待膠凝固后 約需30min倒掉水 用吸水紙吸干8 配5 濃縮膠將配好的濃縮膠立即倒入凝膠槽內(nèi) 以插入梳子不溢出為宜 插入梳子9 待膠凝固后 拔出梳子 放入電泳槽中10 制備好的樣品加入上樣孔11 連接電泳儀12 打開電源 調(diào)整電壓至80V 待樣品跑過濃縮膠 大約需30min 后將電壓調(diào)至120V 待指示劑 溴酚蘭 到達凝膠的底部距離下緣1cm時停止電泳 大約需2h 電泳結(jié)束 SDS PAGE 聚丙烯酰胺凝膠配制 miniVE 目的蛋白質(zhì)的檢測 考馬斯亮藍染色 考馬斯亮藍R250 coomassiebrilliantblue 是一種三苯甲烷紡織染料 又稱酸藍83 分子上含有兩個S03H基團 偏酸性 能結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團上 能夠檢測出大于0 1ug蛋白條帶 將凝膠浸泡在染色液中 室溫在搖床上緩慢染色4小時 或過夜 脫染 將染液回收 凝膠先用蒸餾水漂洗一次 浸入脫染液中脫染 室溫浸泡凝膠或37 加熱使其脫色 更換幾次脫色液 直至出現(xiàn)清晰的電泳帶為止 脫色后 將凝膠保存在水中或是20 甘油的水中 凝膠染色 作業(yè) 按要求認真撰寫報告 包括實驗目的 實驗原理 實驗材料 實驗用品及藥品 實驗步驟 實驗結(jié)果 闡述目的基因表達載體的構(gòu)建 分析實驗結(jié)果 包涵體的出現(xiàn)是目的基因的原核表達中常見問題 其發(fā)生原因是什么 如何解決 實驗結(jié)果與分析 Thankyouforyourattention