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課時規(guī)范練36　基因工程 非選擇題 1.(2018全國Ⅱ理綜)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光,這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達,某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5末端,獲得了L1-GFP融合基因(簡稱為甲),并將其插入質粒P0,構建了真核表達載體P1,其部分結構和酶切位點的示意圖如下,圖中E1~E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。 回答下列問題。 (1)據(jù)圖推斷,該團隊在將甲插入質粒P0時,使用了兩種限制酶,這兩種酶是　　　　　　,使用這兩種酶進行酶切是為了保證　　　　　　,也是為了保證　　　　　　　　　　。 (2)將P1轉入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后,若在該細胞中觀察到了綠色熒光,則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了　　　　和　　　　過程。 (3)為了獲得含有甲的牛,該團隊需要做的工作包括:將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的　　　　移入牛的　　　　　　　　中,體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中,某同學用PCR方法進行鑒定,在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的　　　　(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。 答案(1)E1和E4　甲的完整　甲與載體正確連接　(2)轉錄　翻譯　(3)細胞核　去核卵母細胞　(4)核DNA 解析本題考查基因工程、細胞工程和胚胎工程的相關內(nèi)容。 (1)由題意可知,E1~E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同,將甲(L1-GFP)插入質粒時,使用E1和E4兩種限制酶進行酶切,既保證了甲的完整,又防止了甲的自身環(huán)化,保證了甲與載體的正確連接。 (2)將P1轉入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后,若在該細胞中觀察到了綠色熒光,則說明該細胞中合成了熒光蛋白,即L1基因在牛皮膚細胞中完成了遺傳信息的轉錄和翻譯。 (3)為了獲得含有甲的牛,可通過體細胞核移植技術、體外培養(yǎng)和胚胎移植來實現(xiàn)。 (4)克隆牛的不同組織細胞中的基因選擇性表達,轉錄出的mRNA不同,總RNA也不同,但不同組織細胞中的核DNA相同,因此檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中,用PCR方法進行鑒定時,應以核DNA作為模板。 2.P5CS是植物合成脯氨酸的關鍵酶,脯氨酸有助于植物抵御干旱。下圖是將P5CS基因轉入煙草細胞獲得耐旱煙草植株過程的示意圖。 請回答下列問題。 (1)要將P5CS基因成功插入Ti質粒中,Ti質粒的　　　　　　　　　　　中應含有HindⅢ、SalⅠ限制酶切割位點。③過程需在培養(yǎng)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基中添加　　　　　　　　　　　才能篩選出含P5CS基因的Ti質粒的農(nóng)桿菌。 (2)檢測P5CS基因是否整合到煙草細胞染色體DNA上,采用　　　　　　　　　　　　　　技術,判斷轉基因是否成功,可以直接在個體水平上對轉基因植物與非轉基因植物的　　　　　　　　性進行比較。 (3)將轉入P5CS基因的煙草細胞培育成完整的植株需要用　　　　　　　　　　　　　　　技術,愈傷組織通過　　　　　　　　　　　　　　　發(fā)育成完整植株,在此過程中,除營養(yǎng)物質外,還必須向培養(yǎng)基中添加　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案(1)T-DNA　四環(huán)素　(2)DNA分子雜交　抗旱(耐旱)　(3)植物組織培養(yǎng)　再分化(細胞增殖和分化)　植物激素(生長素和細胞分裂素) 解析(1)質粒中的T-DNA又稱為可轉移的DNA,可以將攜帶的目的基因轉移到受體植物細胞的染色體中去,所以該基因工程要成功,最好將目的基因重組到T-DNA中;因此Ti質粒的T-DNA中應含有HindⅢ、SalⅠ限制酶切割位點。由于重組質粒中含有完整的抗四環(huán)素基因,因此③過程需在培養(yǎng)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基中添加四環(huán)素才能篩選出含P5CS基因的Ti質粒的農(nóng)桿菌。(2)檢測目的基因(P5CS基因)是否整合到煙草細胞染色體DNA上,應采用DNA分子雜交技術;根據(jù)題意,P5CS是植物合成脯氨酸的關鍵酶,脯氨酸有助于植物抵御干旱,因此轉基因是否成功可以直接在個體水平上對轉基因植物與非轉基因植物的抗旱性進行比較。(3)將轉入目的基因(P5CS基因)的煙草細胞培育成完整的植株需要用植物組織培養(yǎng)技術,愈傷組織通過再分化成完整植株,此過程除營養(yǎng)物質外還必須向培養(yǎng)基中添加生長素和細胞分裂素。 3.(2017全國Ⅱ理綜)幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分,幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內(nèi),可增強其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉栴}。 (1)在進行基因工程操作時,若要從植物體中提取幾丁質酶的mRNA,常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　。提取RNA時,提取液中需添加RNA酶抑制劑,其目的是　　　　　　　　　。 (2)以mRNA為材料可以獲得cDNA,其原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)若要使目的基因在受體細胞中表達,需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出兩點即可)。 (4)當幾丁質酶基因和質粒載體連接時,DNA連接酶催化形成的化學鍵是　　　　　　　　　。 (5)若獲得的轉基因植株(幾丁質酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高,根據(jù)中心法則分析,其可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案(1)嫩葉組織細胞易破碎　防止RNA降解 (2)在逆轉錄酶的作用下,以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA (3)目的基因無復制原點;目的基因無表達所需啟動子 (4)磷酸二酯鍵 (5)目的基因的轉錄或翻譯異常 解析(1)選取嫩葉為實驗材料提取mRNA的原因是嫩葉細胞的細胞壁易破碎。提取RNA時加入RNA酶抑制劑的目的是防止RNA降解。 (2)以mRNA為材料獲得cDNA的過程為逆轉錄,其原理是在逆轉錄酶的作用下,以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA。 (3)目的基因無復制原點,無表達所需的啟動子、終止子等,其不能在受體細胞內(nèi)表達,要使目的基因在受體細胞中表達,需要通過含有這些結構的質粒載體將目的基因導入受體細胞。 (4)當幾丁質酶基因和質粒載體連接時,DNA連接酶催化形成的化學鍵是磷酸二酯鍵。 (5)如果目的基因已經(jīng)整合到植物的基因組中,但植物未表現(xiàn)出相應性狀,可能的原因是目的基因未轉錄,或是轉錄出的mRNA未翻譯出相應的幾丁質酶。 4.(2017全國Ⅲ理綜)編碼蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五個片段組成,編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成,如圖1所示。 圖1 圖2 回答下列問題。 (1)現(xiàn)要通過基因工程的方法獲得蛋白乙,若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA),則所構建的表達載體轉入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙,原因是 　。 (2)某同學在用PCR技術獲取DNA片段B或D的過程中,在PCR反應體系中加入了DNA聚合酶、引物等,還加入了序列甲作為　　　　,加入了　　　　作為合成DNA的原料。 (3)現(xiàn)通過基因工程方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白,要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細胞增殖的作用,某同學做了如下實驗:將一定量的含T淋巴細胞的培養(yǎng)液平均分成四組,其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙,另一組作為對照,培養(yǎng)并定期檢測T淋巴細胞濃度,結果如圖2。 ①由圖2 可知:當細胞濃度達到a時,添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細胞濃度不再增加,此時若要使T淋巴細胞繼續(xù)增殖,可采用的方法是　。 細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度,CO2的作用是　。 ②僅根據(jù)圖1、圖2可知,上述甲、乙、丙三種蛋白中,若缺少　　　(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所編碼的肽段,則會降低其刺激T淋巴細胞增殖的效果。 答案(1)編碼乙的DNA序列起始端無ATG,轉錄出的mRNA無起始密碼子 (2)模板　dNTP (3)①進行細胞傳代培養(yǎng)　維持培養(yǎng)液的pH?、贑 解析(1)由基因乙的堿基序列可知,由該序列轉錄出的mRNA無起始密碼子,所以在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列后,所構建的表達載體轉入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙。(2)PCR反應體系中除了加入了DNA聚合酶、引物等,還應加入序列甲作為模板,加入四種脫氧核苷酸(dNTP)作為合成DNA的原料。(3)當細胞濃度達到a時,T淋巴細胞的濃度不再增加,是因為出現(xiàn)了接觸抑制現(xiàn)象,所以可以進行細胞傳代培養(yǎng),使T淋巴細胞繼續(xù)增殖;培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度,CO2的作用是維持培養(yǎng)液中的pH。根據(jù)圖2可知,甲、乙兩組的T淋巴細胞數(shù)量多,丙組的T淋巴細胞數(shù)量少,根據(jù)圖1比較可知,丙組T淋巴細胞少的原因是蛋白丙缺少C片段所編碼的肽段。 5.科學家將魚抗凍蛋白基因轉入番茄,使番茄的耐寒能力大大提高。圖一是轉基因抗凍番茄培育過程的示意圖,圖二為質粒限制酶酶切圖譜。魚的抗凍蛋白基因不含圖中限制酶識別序列,Ampr為抗氨芐青霉素基因,其中①~④是轉基因抗凍番茄培育過程中的相關步驟,Ⅰ、Ⅱ表示相關結構或細胞。請據(jù)圖作答。 圖一 圖二 (1)獲取魚的抗凍蛋白基因的途徑主要有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。為了在番茄中獲得抗凍蛋白必須將抗凍蛋白基因連接在質粒中的　　　　　　　之后。圖中③④依次表示組織培養(yǎng)過程中番茄組織細胞的　　　　　　　　　　　　　　　　過程。 (2)在構建基因表達載體時,可用一種或者多種限制酶進行切割。該酶的特點是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。在此實例中,應該選用限制酶　　　　　　　　 　　　　　切割。 (3)要利用培養(yǎng)基篩選出已導入含魚的抗凍蛋白基因的番茄細胞,應使基因表達載體Ⅰ中含有　　　　　　　　　　　　　　　　　作為標記基因。 (4)研究人員通常采用　　　　　　　　　　法將魚抗凍蛋白基因導入番茄細胞內(nèi)。通常采用　　　　　　　　　　　　技術,在分子水平檢測目的基因是否翻譯形成了相應的蛋白質。 答案(1)從體細胞中分離和化學方法人工合成　啟動子　脫分化、再分化 (2)識別特定的DNA序列并在特定位點切割　Nde Ⅰ、BamH Ⅰ (3)抗氨芐青霉素基因(Ampr) (4)農(nóng)桿菌轉化(或基因槍法等)　抗原—抗體雜交 解析(1)獲取目的基因的主要途徑有從體細胞中分離和化學方法人工合成;構建基因表達載體時,必須將目的基因插入啟動子之后;分析題圖可知,圖中③為脫分化過程,形成愈傷組織,④為再分化過程,形成胚狀體。 (2)限制酶的作用特點是能識別特定的DNA序列并在特定位點切割DNA分子;分析題圖可知,啟動子和終止子之間有三個限制酶位點:NdeⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ,其中質粒中的XbaⅠ酶切位點有兩個,會把終止子切掉,因此不能用XbaⅠ進行切割,而NdeⅠ、BamHⅠ的位點都只有一個,因此最好用NdeⅠ、BamHⅠ兩種限制酶進行切割,可以防止目的基因插入時出現(xiàn)反向連接。 (3)分析題圖,Ampr為抗氨芐青霉素基因,為標記基因,可以用于目的基因的檢測與鑒定。 (4)把目的基因導入植物細胞的方法最常見的是農(nóng)桿菌轉化法;檢測目的基因是否翻譯成蛋白質的方法是抗原—抗體雜交技術。 6.(2018天津理綜)甲型流感病毒為RNA病毒,易引起流感大規(guī)模流行。我國科學家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法,主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主細胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板,逆轉錄成對應DNA后,利用　　　技術擴增,并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比,改造后的基因表達時不能合成完整長度的　　　　,因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構建重組質粒,并保存。 (2)構建適合改造病毒增殖的轉基因宿主細胞。設計合成一種特殊tRNA的基因,其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結合,并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與　　　　　　連接后導入宿主細胞。提取宿主細胞的　　　　　　　進行分子雜交鑒定,篩選獲得成功表達上述tRNA的轉基因宿主細胞。 (3)利用轉基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質粒導入(2)中的轉基因宿主細胞,并在補加　　　　　　　　　　　　　　的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA,翻譯出改造病毒基因的完整蛋白,產(chǎn)生大量子代病毒,用于制備疫苗。 特殊tRNA基因轉錄時,識別其啟動子的酶是　　　(單選)。 A.病毒的DNA聚合酶 B.宿主的DNA聚合酶 C.病毒的RNA聚合酶 D.宿主的RNA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖,沒有致病性,因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比,該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起　　　　免疫,增強免疫保護效果。 答案(1)PCR　多肽(或蛋白質)　(2)載體　總RNA　(3)非天然氨基酸(Uaa)　D　(4)細胞 解析本題考查基因工程、基因表達、免疫等知識。 (1)利用逆轉錄得到病毒DNA后,可利用PCR技術對該DNA進行擴增。據(jù)題意,改造后的某些基因在表達時會提前終止,不能合成改造前完整長度的多肽或蛋白質。(2)導入宿主細胞的是攜帶目的基因的載體,故需將該特殊基因與載體連接。該特殊基因的表達產(chǎn)物是攜帶Uaa的tRNA,故檢測該基因是否表達時可提取宿主細胞的總RNA進行分子雜交。(3)(1)中改造基因表達時,因終止密碼子提前出現(xiàn),無法合成子代病毒的蛋白質而不能產(chǎn)生子代病毒。經(jīng)過(2)改造的宿主細胞,在基因表達遇到終止密碼子時,因有特殊的攜帶Uaa的tRNA與之結合,故可繼續(xù)完成翻譯表達出完整蛋白?？僧a(chǎn)生子代病毒用于制備疫苗。與正常培養(yǎng)基相比,(3)中所用培養(yǎng)基需補加Uaa以完成翻譯。特殊tRNA基因轉錄形成RNA,所需的酶是宿主細胞的RNA聚合酶。(4)因正常宿主細胞不含特殊tRNA基因,也無Uaa,故子代病毒侵入正常細胞后,無法合成病毒蛋白質,不能表現(xiàn)出致病性。該病毒與不具侵染性的流感疫苗相比,因其還可侵入體細胞,故除引起體液免疫外,還可引起細胞免疫。