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1、無色孔雀石綠、環(huán)丙沙星和四環(huán)素殘留的分析檢測 Turbo Flow 聯(lián)合LC-MS/MS 方法進(jìn)行食物樣品中孔雀石綠、 無色孔雀石綠、環(huán)丙沙星和四環(huán)素殘留的分析檢測 簡介: 為了保證食物供應(yīng)鏈的安全性和全球健康風(fēng)險(xiǎn)管理的有效性,對食品和農(nóng)產(chǎn)品中化學(xué)物 質(zhì)殘留水平進(jìn)行精確的檢測是非常必要的。而化學(xué)物質(zhì)的殘留分析要求檢測技術(shù)具有足夠高 的靈敏度,能夠在污染物的最大檢出限(MRL)或最大檢出限(MRL)水平以下從給定樣品中 檢出被污染物并對其進(jìn)行定量。另外,因?yàn)槭称钒踩嚓P(guān)規(guī)定日益嚴(yán)格,所要檢測的樣品數(shù) 量也在不斷增大,因此

2、分析技術(shù)是否具備高通量處理樣品的能力也是非常關(guān)鍵的。 隨著水產(chǎn)業(yè)持續(xù)快速的發(fā)展,人們對水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中未批準(zhǔn)藥物和不安全化學(xué)物質(zhì)的使 用也越來越關(guān)注?？兹甘G(MG) ,是一種三苯甲烷類人工合成有機(jī)化合物,既是染料,也 是高效殺菌劑,而且價(jià)格低廉。因此它在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中被廣泛使用,特別是在亞洲地區(qū)。 (孔雀石綠、無色孔雀石綠的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖 1) 圖1 孔雀石綠、無色孔雀石綠的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 孔雀石綠(MG)在代謝過程中降解成無色孔雀石綠(LMG) ,研究發(fā)現(xiàn):無色孔雀石綠在 含脂肪的魚的器官中會發(fā)生累積現(xiàn)象,因?yàn)槿藗冊谝呀?jīng)檢測不到孔雀石綠的樣品中仍然會發(fā) 現(xiàn)無色孔雀石綠的殘留。而

3、研究證明,無論是孔雀石綠還是無色孔雀石綠,都有潛在的致癌 活性。因此,在許多國家,包括美國、加拿大和歐盟,孔雀石綠已經(jīng)被禁止作為獸用藥在水 產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)使用。因?yàn)橐恍┗瘜W(xué)物質(zhì)被禁止在動(dòng)物肉類加工制作的食品中使用,歐盟法規(guī)規(guī)定 了這些物質(zhì)的最低允許限量(MRPL)。魚肉中有關(guān)孔雀石綠和無色孔雀石綠的殘留總量的最 低允許限量為2μg/kg(ppb)。 環(huán)丙沙星是一種廣譜性抗菌素(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖 2) ,屬于氟喹諾酮家族的成員之一。 氟喹諾酮類是近年來人工合成的一系列新型殺菌性抗菌藥物,因其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)等 特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于畜禽飼養(yǎng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的多種感染性疾病的防治當(dāng)中。然而,食

4、品中氟喹諾酮類殘留會誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性。因此,隨著氟喹諾酮類藥物在動(dòng)物源性食品中 的廣泛應(yīng)用,其殘留問題越來越引起社會各界的廣泛關(guān)注和有關(guān)部門的高度重視。FDA 禁止 動(dòng)物食品中氟喹啉的超標(biāo)使用。歐盟法規(guī)規(guī)定氟喹諾酮類藥物?恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙 沙星的總量在所有生產(chǎn)食品的動(dòng)物肌肉和豬肝臟中的最大殘留限MRLs分別為100μg/kg (ppb)和200μg/kg(ppb)。 圖2 環(huán)丙沙星的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 四環(huán)素是一種聚酮類抗生素,它對一些革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有高效作用(化 學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖 3)。和其他獸用抗生素一樣,四環(huán)素用于食用動(dòng)物后,在動(dòng)物體內(nèi)和畜禽產(chǎn) 品中會有殘

5、留現(xiàn)象,殘留的四環(huán)素同樣會使得人們對這些藥物的耐藥性提高。歐盟獸藥殘留 也對此作了相關(guān)規(guī)定,四環(huán)素在所有生產(chǎn)食品的動(dòng)物肌肉和豬肝臟中最大殘留限MRLs 分 別為100μg/kg(ppb)和300μg/kg(ppb )。圖3 四環(huán)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 Thermo Scientific 針對以上殘留檢測需求提出了相應(yīng)的解決方案--Aria TLX系統(tǒng),該 系統(tǒng)是將 Turbo Flow 技術(shù)與 TSQ Quantum Access 質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行完美結(jié)合。它為 LC-MS/MS 質(zhì)譜配置了在線樣品提取功能,與傳統(tǒng)的脫機(jī)提取方法相比,該方法進(jìn)行食品中化學(xué)物質(zhì)殘 留分析更快捷,更可靠。Turb

6、o Flow 技術(shù)通過擴(kuò)散溶解、尺寸排阻、柱層析技術(shù)將蛋白等一些大分子物質(zhì)濾掉,將小分子保留。工作人員可以直接注射檢測樣品進(jìn)入LC-MS系統(tǒng)進(jìn)行 分析,大大的簡化了樣品制備過程,并提高了檢測通量。 研究目標(biāo): 驗(yàn)證該技術(shù)與液液提取或固相萃取等傳統(tǒng)技術(shù)相比具備的以下優(yōu)勢:樣品分析所需的總 時(shí)間減少了,同時(shí)降低了食品中的離子抑制和基質(zhì)效應(yīng)的影響。 實(shí)驗(yàn)條件: 1.樣品制備 乙腈提取法:蝦(具頭) 、羅非魚和豬肝臟分別各稱取3~4g,與 30ml乙腈充分混勻, 室溫放置10min,上層液體被移入到 0.22?m 的微孔離心管中,10000rpm 離心10min,轉(zhuǎn)移 上清

7、到 50mL玻璃閃爍瓶中,即為制備的樣品。該樣品制備過程總共需要 25min。 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:1mg/L 的孔雀石綠、無色孔雀石綠、環(huán)丙沙星、四環(huán)素混合溶液為儲存 溶液,用甲醇將之稀釋到 0.1mg/mL(1000?g/ml)。標(biāo)準(zhǔn)溶液是通過梯度稀釋的方法將儲存 溶液稀釋到合適濃度并加入到三個(gè)已制備樣品中,其濃度范圍為 10?g/kg~5ng/kg。 以上總的樣品制備過程大致需要 30到40分鐘。 2.Turbo Flow方法 Aria TLX-1系統(tǒng)Thermo Fisher Scientific, Franklin, MA:多柱模塊(MCM)允許 6根上樣柱和6根分析

8、柱一次性檢測,使得方法開發(fā)更為容易。首先,上樣柱能使得每一種 分析物都達(dá)到高的回收率。由于所有的被分析物都溶解在一種儲存溶液中,運(yùn)行所需時(shí)間就 被最大程度地縮短了。所選擇的分析柱也具有高的分離性能。Turbo Flow方法條件如下: 制備柱: Turbo Flow XL C18柱 Thermo Fisher Scientific, Franklin, MA TM 分析柱:50×3mm,5?m Hypersil GOLD 色譜柱 Thermo Fisher Scientific, Bellefonte, PA 流動(dòng)相A:水(含0.1% 甲酸) 流動(dòng)相B:乙腈(含

9、0.1% 甲酸) 流動(dòng)相D: 20%丙酮/40%甲醇/40%乙腈 自動(dòng)進(jìn)樣器: 10?L 樣品提取液: 50:50(A/B) Aria TLX Turbo Flow方法的具體運(yùn)行情況見圖4,該分析方法所需的運(yùn)行時(shí)間少于 6min。圖4 Aria TLX Turbo Flow 方法 3.MS條件: TSQ Quantum Access三重四極桿質(zhì)譜儀Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA.MS 條件如下: 離子源極性: 陽離子模式 噴霧電壓: 3500V 氣化溫度: 472°C 鞘氣壓N2: 40 arb 輔助

10、氣壓N2:50 arb 離子傳輸管管溫度: 270°C 錐孔電壓:5V 碰撞氣體(Ar):1.5mTorr Q1/Q3峰分辨度:0.7 u 單位分辨質(zhì)量 掃描模式:選擇反應(yīng)監(jiān)測 圖5 MS方法及SRM監(jiān)測到的離子對 結(jié)果討論: 隨著國際食品貿(mào)易的日益頻繁,對食物供應(yīng)過程進(jìn)行密切監(jiān)測的要求也越來越迫切,以 確保藥物殘留水平和其他化學(xué)污染物殘留水平在相關(guān)規(guī)定以下。在該研究中,多種食物基質(zhì) 中的環(huán)丙沙星、四環(huán)素、孔雀石綠、無色孔雀石綠都可以同時(shí)被檢出。 LC-MS/MS 在進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)的殘留分析之前,需要進(jìn)行大量樣品預(yù)處理,而此過程是費(fèi) 時(shí)費(fèi)力的。帶有Tur

11、bo Flow技術(shù)的Aria TLX系統(tǒng)可以消除冗長的樣品預(yù)處理步驟。該研究中 每個(gè)樣品只需要進(jìn)行一次離心去除顆粒狀雜質(zhì)即可直接進(jìn)樣,省去了樣品預(yù)處理中大多數(shù)費(fèi) 時(shí)的步驟,它不僅提高了樣品處理的通量,還減小了由于操作步驟中的錯(cuò)誤和可變因素而帶 來的誤差。 Aria TLX系統(tǒng)的分析軟件在一個(gè)單獨(dú)的系統(tǒng)中HPLC和Turbo Flow方法都可運(yùn)行,您所需 要的操作僅僅只是注射樣品,其余的事情都由分析軟件完成。為了評價(jià)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的HPLC和 Turbo Flow方法在性能上的差異,本研究中提取的每一個(gè)樣品都分別用兩種方法進(jìn)行了分析。兩者的不同在于:標(biāo)準(zhǔn)的HPLC 方法中,樣品僅通過分析

12、柱。Turbo Flow方法中,樣品 既通過Turbo Flow上樣柱又通過分析柱。圖6 給出了兩種方法分析500 ng/kg(萬億分之一) 四環(huán)素污染的魚樣品的檢測結(jié)果。從圖上可以看出:Turbo Flow法檢測譜圖中已經(jīng)沒有了在 標(biāo)準(zhǔn)的HPLC檢測譜圖中出現(xiàn)的干擾峰。而且Turbo Flow技術(shù)中渦流的特點(diǎn)也成功的去除了導(dǎo) 致離子抑制的基質(zhì)干擾。 圖6 兩種方法進(jìn)行500 ng/kg(萬億分之一)四環(huán)素污染的魚樣品的檢測結(jié)果 相同的情況在其他食品藥物分析中也被觀察到。圖7是兩種方法分別對500 ng/kg(ppt) 和50 ng/kg(ppt)無色孔雀石綠污染的蝦進(jìn)行的檢測

13、結(jié)果。從圖上的結(jié)果可以看出:Turbo Flow檢測結(jié)果中信噪比有了很大的改善,離子抑制也有相當(dāng)大的減少。效果最為明顯的是進(jìn) 行豬肝臟中500 ng/kg ppt四環(huán)素的分析結(jié)果(請見圖8)。圖7 兩種方法分別對500 ng/kg(ppt)和50 ng/kg(ppt)無色孔雀石綠污染蝦的檢測結(jié)果圖8 豬肝臟中500 ng/kg ppt四環(huán)素的檢測 圖9 兩種方法所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線 通過峰面積法對豬肝臟中環(huán)丙沙星進(jìn)行定量,分別得到兩種方法所測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線 (見圖9)。同時(shí)根據(jù)以上結(jié)果分別計(jì)算出兩種方法的定量限(LOD)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)、 2 2 R 等參數(shù),詳情請見表1。

14、從表1中可以看出Turbo Flow法檢測的結(jié)果有優(yōu)異的R 值,在給定 2 的濃度檢測范圍內(nèi), R值都大于0.99。 TLX系統(tǒng)檢測結(jié)果相比標(biāo)準(zhǔn)的HPLC結(jié)果各個(gè)方面都 有明顯改善。 通過對表1中魚、蝦和豬肝臟提取物中環(huán)丙沙星、孔雀石綠、無色孔雀石綠和四環(huán)素的檢測結(jié)果的比較分析可以看出, LC-MS/MS配置的Turbo Flow 在線提取法進(jìn)行分析所得的定 量限LOQs明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)HPLC方法所獲得的定量限LOQs。檢測限的提高緣于在Aria TLX 系統(tǒng)中內(nèi)源性組織的污染消除和離子抑制效應(yīng)的降低。 表1 魚、蝦和豬肝臟提取物中環(huán)丙沙星、孔雀石綠、無色孔雀石綠和四環(huán)素的檢測

15、結(jié)果匯總 魚標(biāo)準(zhǔn)HPLC Turbo Flow 方法 2 2 LOD %RSD LOD? %RS R LOD? %RSD LOD? %RSD R ?g/kg N3 g/kg D g/kg N3 g/kg N3 N3 環(huán)丙沙星 0.5 32.0 1.0 8.0 0.9875 0.1 15.9 0.5 7.1 0.9968 孔雀石綠 0.1 23.0 0.5 1.4 0.9988 0.1 6.8 0.1 8.2 0.9984 無色孔雀石綠 0.5 7.4 0.5 7.4 0.9990 0.1 12.0 0.1 12.0 0.9983 蝦 環(huán)丙沙星 5.0 10

16、.5 5.0 10.5 0.9580 0.5 16.0 1.0 2.0 0.9906 孔雀石綠 0.1 21.4 0.5 7.2 0.9991 0.05 7.9 0.05 7.9 0.9990 無色孔雀石綠 0.1 20.5 0.5 11.0 0.9975 0.05 13.5 0.1 11.2 0.9988 豬肝臟 環(huán)丙沙星 0.5 38.8 1.0 10.4 0.9707 0.1 29.0 0.5 8.6 0.9969 四環(huán)素 0.5 14.8 1.0 10.5 0.9932 0.1 11.5 0.5 11.3 0.9953 結(jié)論: Aria TLX-1系統(tǒng)與TSQ

17、 Quantum Access質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行食物樣品中獸藥殘留的定量檢測, 靈敏度高、分析時(shí)間短、可靠性強(qiáng)。Turbo Flow方法允許樣品直接進(jìn)樣,大大減少了樣品預(yù) 處理的步驟。相比傳統(tǒng)離線進(jìn)行樣品預(yù)處理的方法來說,分析所需要的總時(shí)間大大縮短。另 外,與標(biāo)準(zhǔn)的HPLC方法相比,Aria TLX-1系統(tǒng)有效降低了離子抑制和基質(zhì)效應(yīng)。 參考文獻(xiàn): 1. Plakas, S. M.; Doerge, D. R.; Turnipseed, S. B. Disposition and Metabolism of Malachite Green and Other Therapeutic

18、Dyes in Fish. In Xenobiotics in Fish; Smith, D. J., Gingerich, W. H., Beconi-Barker, M. G., Eds.; Plenum Press: New York City, 1999; p. 149-1662. European Commission, Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, as amended by Decision 2003/181/EC4, Official Journal of the European Communities L 221, 17.08.2002, p. 8-36