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1、基因工程技術(shù)：按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)移等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有物種在較短的時(shí)間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出新的生物類型。 質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子cccDNA，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中，它具有自主的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有二種：緊密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在細(xì)胞周 期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有一個(gè)或幾個(gè)質(zhì) 粒分子；后者在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中 有許多拷貝。 質(zhì)粒的不

2、相容性：利用共同復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共存。 從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA 的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。 溶菌酶：破壞菌體細(xì)胞壁；SDS和Triton X-100：使細(xì)胞膜裂解。 染色體DNA 通常用于構(gòu)建基因組文庫和Southern雜交等。 基因組DNA的提取 植物基因組DNA提?。禾崛【彌_液（Tris.Cl— 保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，異丙醇—沉淀DNA（提染色體），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加鹽

3、，70%乙醇—漂洗。 細(xì)菌基因組DNA提?。篠DS，蛋白酶K，氯仿：異戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，異丙醇/無水乙醇—沉淀上清液。 總RNA制備 mRNA的分子結(jié)構(gòu)容易受到RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上RNA 酶極為穩(wěn)定而且廣泛存在，因此，在提取過程中應(yīng)嚴(yán)格防止RNA 酶的污染并設(shè)法抑制其活性，這是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。儀器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液處

4、理—所有器皿最后硅烷化處理。 RNA酶抑制劑：DEPC--強(qiáng)烈但不徹底，與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物；異硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他-- RNA酶蛋白抑制劑（RNasin）SDS, 尿素等。 細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法：異硫氰酸胍熱苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先將組織在液氮中研磨成粉末） 異硫氰酸胍熱苯酚法：異硫氰酸胍(GIT)與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT與 十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)作用使蛋白質(zhì)變性。 酚/SDS法：用酚和SDS破碎細(xì)胞和去除蛋白質(zhì)，用LiCl選擇沉淀RNA以去除DNA和其它不純物。 Trizol法：Trizol試

5、劑（含酚、異硫氰酸胍和溶解劑等）。 mRNA提取 制備mRNA原理：分離的總RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特點(diǎn)，用oligo(dT)纖維素柱分離，當(dāng)RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。然后經(jīng)過兩次oligo（dT）纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上樣buffer和洗脫buffer）。溶液中無鹽時(shí)要沉淀RNA，必須加鹽NaAC。 瓊脂糖凝膠電泳 DNA凝膠電泳：瓊脂糖-- 分離DNA

6、片段大小范圍廣；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。 瓊脂糖凝膠電泳特性：1.DNA分子大小：DNA分子在一定瓊脂糖濃度下的遷移率；2.瓊脂糖濃度：1.0-1.2%；3.DNA分子構(gòu)象：超螺旋DNA最快，線狀雙鏈最慢；4.電源電壓：不大于5V/cm，負(fù)—正；5.染料：溴化乙錠（EB）--強(qiáng)誘變劑；6.離子強(qiáng)度：0.5*TBE（不能過高，避免buffer發(fā)燙）。 RNA凝膠電泳：RNA分子有很多二級(jí)結(jié)構(gòu)，需經(jīng)變性劑處理，可以破壞RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后，用瓊脂糖凝膠電泳可分級(jí)分離不同大小的mRNA分子。 RNA瓊脂糖凝膠電泳方法有三種：乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞（劇毒）瓊脂變性電

7、泳。 DNA限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶：限制性內(nèi)切酶是指能特異性結(jié)合于一段被稱為限制性識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。 I類酶：結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA；II類酶：由二種酶分子組成的二元系統(tǒng)（核酸酶—切割、甲基化酶—修飾），其識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)是同一位置；III類酶：在識(shí)別位點(diǎn)之外切割DNA 分子，然后從底物上解離。甲基化：保護(hù)DNA分子，越活躍的地方，甲基化程度越低。 切割性能：回文對稱特異核苷酸序列、平末端DNA片段、粘性末端。 酶單位：在合適緩沖液和反應(yīng)溫度下，在20ul反應(yīng)體積中一小時(shí)內(nèi)完全降解1mg DNA 所需要的量

8、。 載體：把一個(gè)有用的目的 DNA片段通過重組DNA 技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具。常見載體：質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒、BAC、YAC等。 質(zhì)粒載體的特性：分子量小、多拷貝、松弛控制型；具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)；能插入較大的外源DNA片段；具有容易操作的檢測表型。 pBR322、pUC18/19（分子量更小、α-互補(bǔ)原理—藍(lán)白篩選、多克隆位點(diǎn)區(qū)MCS）、pBluescript SK(+/-)（MCS）。 乳糖操縱子： α-互補(bǔ)原理：lacZ（β-半乳糖苷酶基因）基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性突變體之間可以實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)

9、的現(xiàn)象。 藍(lán)白斑篩選：X-gal-----IPTG（乳糖類似物—誘導(dǎo)劑）--------藍(lán)色吲哚產(chǎn)物 （當(dāng)外源片段插入后，失去α-互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色）。 λ噬菌體：侵染細(xì)菌的病毒（裂解性侵染、溶源性侵染）。 【堿性磷酸酶--活性好, 但較抗熱和去污劑,在去磷酸化反應(yīng)后很難去除】 細(xì)胞轉(zhuǎn)化（transformation）是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段（E.coli）。 【如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)胞，需誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA.】 感受態(tài)細(xì)胞：

10、受體細(xì)胞經(jīng)一些特殊方法（如CaCl2、RbCl（KCl）等化學(xué)試劑）處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞狀態(tài)。 【LB培養(yǎng)基不含Amp，設(shè)2個(gè)對照（防污染）】 提高轉(zhuǎn)化效率的因素：細(xì)胞生長狀態(tài)和密度（剛進(jìn)入對數(shù)生長期）、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度（DNA溶液體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%）、試劑質(zhì)量（最高純度）、防止雜菌和雜DNA污染（無菌器皿）。 PCR技術(shù)的3個(gè)步驟：變性：目的雙鏈DNA在94℃下解鏈；退火：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50℃左右）下雨模板上的目的序列通過氫鍵配對；延伸：TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為

11、模板進(jìn)行合成。 PCR反應(yīng)5要素：引物、模板、酶、dNTPs和Mg2+ 引物設(shè)計(jì)原則：1.引物長度：（20bp）；2.引物擴(kuò)增跨度：2kb左右最有效；3.引物堿基：G+C含量40-60%為宜，ATGC分布均勻，不要集中；4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)；5.引物3’端的堿基：嚴(yán)格要求配對；6.引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)；7.引物的特異性：與其他序列無明顯同源性；8.擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)（以免產(chǎn)生非特異性）；9.引物量：濃度要控制。 模板：可以是DNA或RNA，可以是線狀或環(huán)狀。 TaqDNA聚合酶：活性半衰期為92.5℃（最后加入）。 dNTPs：質(zhì)量、濃

12、度與PCR擴(kuò)增效率有關(guān)，應(yīng)保存得當(dāng)，不好凍融，最好分裝。 Mg2+：對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著影響，濃度過高，特異性降低，出現(xiàn)非特異性；過低，降低TaqDNA聚合酶活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 反應(yīng)緩沖液：Tris.Cl，KCl，和適當(dāng)濃度的Mg2+。（BSA、DDT） PCR反應(yīng)條件：溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。 溫度：變性：94℃，退火：Tm= 4(G+C)＋2(A+T)，值約低5℃，延伸：72℃。 循環(huán)次數(shù)：25-30循環(huán)。【PCR常見問題：無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性】 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累通過對 P

13、CR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。 檢測模式有：Tagman 探針和SYBR Green I檢測模式。 SYBR Green I 染料方法：是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈 DNA結(jié)合染料，與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值。CT 值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 Tagman 探針：是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。 RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA）：運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標(biāo)記。 原理：

14、利用一系列（通常數(shù)百個(gè)）不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為10聚體）為引物，對所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離，經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性，這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA 片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性?！綝NA提取+選擇隨機(jī)引物—PCR反應(yīng)—凝膠電泳—圖譜分析】。缺點(diǎn)：圖譜中某些弱帶重復(fù)性較差，信息量小，有假陽性結(jié)果等等。 差別表達(dá)基因分析技術(shù)：1.mRNA 差異顯示技術(shù)（DD） 2.代表性差示分析技術(shù)（RDA）3.抑制性差減雜交技術(shù)（SSH）---- 提取目標(biāo)樣和參照樣；將目標(biāo)樣與殘照樣雜交得到產(chǎn)物；合并雜交產(chǎn)

15、物；特異性片段擴(kuò)增 ---- 該方法能使假陽性率降低到6% 4.交互差減RNA 差別顯示技術(shù)（RSDD）。 分子雜交相關(guān)技術(shù)：互補(bǔ)的核苷酸序列通過Watson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈DNA分子的過程稱為雜交。雜交的雙方是所使用的探針和要檢測的核酸。 根據(jù)核酸的性質(zhì)：DNA和RNA探針；根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物：放射性和非放射性標(biāo)記探針；根據(jù)是否存在互補(bǔ)鏈：單鏈和雙鏈；根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況：均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記。 1）雙鏈DNA探針：其合成方法有-- 切口平移法和隨機(jī)引物合成法。 切口平移法：當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí)，E.coli DNA聚合酶I 就

16、可將核苷酸連接到切口的3’羥基末端。通常使用--[α-32P]dNTP。 隨機(jī)引物合成法：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段，合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。具有聚合活性，沒有5’至3’外切酶活性, 稱為Klenow片段。 2）末端標(biāo)記DNA探針： 3’末端標(biāo)記（利用Klenow片段及T4DNA聚合酶） 和DNA 5’末端標(biāo)記（利用T4多核苷酸激酶PNK）。 AKP堿性磷酸酶—去磷酸化 3）單鏈DNA探針：以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成；以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成。 4）Dig標(biāo)記的核苷酸 分子雜交：分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在

17、固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針和被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或 RNA分子所處的位置。Southern雜交和Northern雜交。 Southern雜交：DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。步驟：酶切、DNA片段轉(zhuǎn)移、預(yù)雜交、雜交、顯色反應(yīng)。 硝酸纖維素濾膜所得的結(jié)果背景較低，但易破裂；尼龍膜較耐用，但所得的結(jié)果背景較高。硝酸纖維素膜結(jié)合DNA依賴高鹽溶液。 DNA轉(zhuǎn)移方法：毛細(xì)管轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移、電泳轉(zhuǎn)移。 Northern雜交：RNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后用探

18、針雜交，被檢對象為RNA，探針為DNA或RNA。 影響雜交的因素：核酸分子的濃度和長度、溫度、封閉試劑、離子強(qiáng)度。 變性，酸處理的目的？ 基因的原核表達(dá)：原核表達(dá)系統(tǒng)由原核表達(dá)寄主菌及原核表達(dá)質(zhì)粒組成，優(yōu)點(diǎn):操作簡單、方便、快速、成本低、產(chǎn)量高、純化容易；缺點(diǎn)：產(chǎn)物多以包涵體形式存在；不含內(nèi)含子，沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工過程，表達(dá)產(chǎn)物不能正常修飾；有些表達(dá)的蛋白沒有活性。 基因表達(dá)方式：組成型表達(dá)（不停的表達(dá)目的蛋白）、誘導(dǎo)表達(dá)（只有在誘導(dǎo)劑作用下才表達(dá)）、融合表達(dá)（融合表達(dá)標(biāo)簽）、分泌表達(dá)（信號(hào)肽）、可溶性表達(dá)（E.coli）。 啟動(dòng)子：RNA聚合酶以很高的親和性結(jié)合在基因調(diào)控區(qū)域

19、的特定位子，起始RNA合成的序列。（-10區(qū)和-35區(qū)）。 細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子，因此原核表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子必須是原核啟動(dòng)子。 原核表達(dá)系統(tǒng)中常見啟動(dòng)子及其特點(diǎn)：Lac(乳糖啟動(dòng)子)—來自E.coli，一段有方向的核苷酸序列，阻止RNA聚合酶的結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄；Trp(色氨酸啟動(dòng)子)----阻遏蛋白必須與色氨酸結(jié)合才有活性，阻止轉(zhuǎn)錄；Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)----由Lac和Trp人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子，受Lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)；PL (噬菌體的左向啟動(dòng)子)----左向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，受溫度誘導(dǎo)（45℃）、T7噬菌體啟動(dòng)子----來自T7噬菌體，具有高度特異性，只有

20、T7RNA聚合酶才能使其啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，從而得到表達(dá)。T7啟動(dòng)子完全專一受控于T7?RNA聚合酶。 特點(diǎn)：啟動(dòng)子的作用要強(qiáng)；需表現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)表達(dá)活性；具有簡便和廉價(jià)的可誘導(dǎo)性。 終止子：真核基因或操縱子的3’端往往有特定的具有終止轉(zhuǎn)錄功能的核苷酸序列。 誘導(dǎo)劑：當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使其構(gòu)象發(fā)生變化，從而阻遏蛋白從DNA分子上脫落下來，RNA聚合酶進(jìn)入啟動(dòng)子區(qū)，可誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。 T7表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒：pET-3—52、His-Tag(6 x His Tag), pET-41、42、49還含有GST-Tag， kam+ or Amp+ 抗性、His-Tag(6 x His T

21、ag）。 pET質(zhì)粒：不移碼，不改變基因的閱讀框架。多克隆位點(diǎn)BamHI。 pGEX系：GST（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶）基因融合表達(dá)質(zhì)粒。Amp+，N-端GST ，Thrombin(凝血酶) or Factor Xa蛋白酶切位點(diǎn)。 GST融合表達(dá)蛋白的純化原理：選擇能識(shí)別并特異性結(jié)合GST的特定配體，其中GST的底物－－谷胱甘肽是較佳的候選對象，兩者結(jié)合后用還原型谷光苷肽的洗脫緩沖液競爭洗脫表達(dá)蛋白。。 pBAD系列：His-Tag(6 xHis), Amp+。 pDH2：6×His tag,Amp+，ColE1復(fù)制起點(diǎn)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 稀有密碼子：有些在真核細(xì)胞中常使用的而在原核細(xì)

22、胞中很少使用的密碼子。 原核表達(dá)中可能遇到的問題及影響因素：基因特性。 基因含稀有密碼子（無蛋白表達(dá)）、基因GC含量（超過70%會(huì)降低蛋白表達(dá)水平）、基因或蛋白大?。ń橛?KD和100KD之間）、蛋白親疏水性（親—表達(dá)量高，疏—難表達(dá)）、基因二級(jí)結(jié)構(gòu)（抑制翻譯的起始）、信號(hào)肽（疏水性或毒性，應(yīng)清除）、表達(dá)蛋白比預(yù)計(jì)的小或用其他小的條帶（提前終止，可低溫誘導(dǎo)、基因改造）、基因毒性（細(xì)胞生長困難，應(yīng)低溫低濃度誘導(dǎo)）、質(zhì)粒不穩(wěn)定性（用低溫高濃度抗生素）、目的mRNA和蛋白不穩(wěn)定而表達(dá)量低（低溫長時(shí)表達(dá)）、包涵體（為變性的表達(dá)蛋白）、培養(yǎng)基pH。表達(dá)不出來時(shí)首先想到換菌株。 構(gòu)建

23、原核表達(dá)系統(tǒng)，考慮3大因素：表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件。 His tag融合蛋白純化的原理：利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子Ni2+ ，Zn2+， Cu2+ ，Co2+，F(xiàn)e3+發(fā)生特殊的相互作用，從而把富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)吸附，達(dá)到分離的目的。 洗脫目的蛋白有幾種方式：咪唑（條件最溫和）、pH 以及EDTA。 TCA（三氯乙酸）除去鹽酸胍：沉淀鹽酸胍、離心、乙醇溶解、離心，得到沉淀為洗脫蛋白，用尿素溶解、透析后保存。 基因的真核表達(dá)系統(tǒng)： 穿梭載體：既能在原核細(xì)胞中復(fù)制，也能在真核細(xì)胞中復(fù)制的載體。 Western blot（免疫印跡）：將

24、蛋白質(zhì)凝膠電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。 原理：蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳使蛋白質(zhì)按分子大小分離，將分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相載體膜（NC、PVDF膜）上用無關(guān)蛋白質(zhì)封閉液封閉膜的非特異性位點(diǎn)，加入特異性抗體后膜上的目的蛋白與一抗發(fā)生特異性的免疫結(jié)合反應(yīng)，洗滌后再加入能與一抗發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)的酶標(biāo)二抗，最后通過二抗上標(biāo)記酶的性質(zhì)進(jìn)行檢測，即根據(jù)底物顯色的顏色及深淺來探測膜上印跡蛋白抗原的存在與否及含量多少。 辣根過氧化合酶（HRP）：來源于植物，用于動(dòng)物性樣品的檢測（目的是消除樣品中內(nèi)源性酶的干擾，降低背景）。 堿性磷酸酶（

25、AP）：來源于動(dòng)物牛小腸，用于植物性樣品的檢測，（目的是消除樣品中內(nèi)源性酶的干擾，降低背景）。 硝酸纖維素（NC）膜：其結(jié)合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，很脆、易破，但是結(jié)合蛋白效率比PDVF高。 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：疏水性，不易破，結(jié)合蛋白較牢固，可結(jié)合小片段蛋白。 SDS-PAGE中SDS的作用：強(qiáng)陰離子去污劑使蛋白質(zhì)變性、亞基解離，破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)?！镜鞍踪|(zhì)在電泳分離時(shí)，其遷移率主要取決于蛋白質(zhì)本身所帶的電荷多少、分子量大小和形態(tài)】。 酶標(biāo)二抗：根據(jù)使用的第一抗體選擇，如第一抗體為兔抗體，則可使用羊抗兔IgG抗體，若為鼠源抗體，則可使用羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠I

26、gG抗體。 Western blot實(shí)驗(yàn)步驟：1.SDS-PAGE電泳2.電轉(zhuǎn)移—濕轉(zhuǎn)法：將膜、膠、濾紙整個(gè)組合完全浸入有鉑絲電極的轉(zhuǎn)移緩沖液中的蛋白原位電轉(zhuǎn)移體系。膠正膜負(fù)，（-）--> （+）。 Southern blot 地高辛法—轉(zhuǎn)膜----UV交聯(lián)（紫外交聯(lián)原理）：紫外照射使DNA和RNA的一小部分胸腺嘧啶（T）殘基與膜表面帶正電荷的氨基基團(tuán)之間形成共價(jià)交聯(lián)。 免疫球蛋白（Ig）：是指存在于人和動(dòng)物血液(血清)、組織液及其它外分泌液中的一類具有相似結(jié)構(gòu)的球蛋白。 抗體（Ab）：動(dòng)物機(jī)體受到抗原物質(zhì)的刺激后, 由B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成的漿細(xì)胞產(chǎn)生的, 能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性免疫結(jié)

27、合反應(yīng)的免疫球蛋白。 抗原（Ag）：能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞（免疫原性）并能與之發(fā)生特異性免疫反應(yīng)（反應(yīng)原性）的物質(zhì)。 抗原決定簇：存在于抗原分子表面的能夠決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，是與抗體結(jié)合的位點(diǎn)。決定著抗原與抗體發(fā)生特異結(jié)合的能力。 ELISA：把抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)地結(jié)合在一起一種免疫學(xué)技術(shù)。 包被：抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。 常用的標(biāo)記基因和選擇基因：生化標(biāo)記基因、抗性標(biāo)記基因、營養(yǎng)標(biāo)記基因。 生化標(biāo)記基因：其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，導(dǎo)入植物24-48小時(shí)內(nèi)就可以檢測結(jié)果，迅速對轉(zhuǎn)基因程序的有關(guān)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)和優(yōu)化

28、，獲得基因表達(dá)水平、載體等信息。 常用基因：β-半乳苷酶基因（lacZ）、葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）、熒光素酶基因（Luc）、花青素基因（Ant）、綠色熒光蛋白基因（GFP）。 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因：抑制蛋白質(zhì)生物合成。 應(yīng)用原理：真核生物沒有Cat，Cat轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞具有對氯霉素的抗性，通過Cat的活性檢測分析外源基因的表達(dá)。活性檢測：反應(yīng)底物乙酰CoA.方法：硅膠G薄層層析法、DTNB分光光度法。 葡萄糖苷酸酶基因（GUS）：染色原理--Gus 可以水解葡糖苷酸，形成葡糖醛酸（蘭色）。 熒光素酶（Luc）基因：在ATP存在下催化D-熒光

29、素的氧化反應(yīng)生成氧化熒光素和黃-綠色光。這是一種對植物組織沒有傷害的檢測方法。 花青素（Ant）基因：轉(zhuǎn)入這些基因后，可以在植物組織上生成紅色的花青素斑點(diǎn)。此基因不需任何底物就可以檢測，但使用局限性大。 綠色熒光蛋白（GFP）基因：是海洋生物水母體內(nèi)的一種發(fā)光蛋白，經(jīng)過改造后用于做植物的標(biāo)記基因，基因產(chǎn)物在蘭色光或紫色光下可見綠色熒光。 抗性標(biāo)記基因：抗生素抗性基因、重金屬抗性基因、代謝抗性基因。 抗生素抗性基因：氨芐青霉素抗性基因（Apr）、四環(huán)素抗性基因（Tet r）、氯霉素抗性基因（Cm r）、卡那霉素抗性基因（Kanr）、G418抗性基因（G418r）、潮霉素抗性基因（Hygr

30、）、 新霉素抗性基因（Neor）。 篩選基因：選擇的基本原理：使未轉(zhuǎn)化的組織或細(xì)胞，在含有選擇劑的培養(yǎng)基上新陳代謝受阻而停止生長，最后死亡。 重金屬抗性基因：銅、鋅、鎘抗性基因。 代謝抗性基因：抗除草劑基因。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。 原理：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中?！救藗儗⒛康幕虿迦氲浇?jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)

31、胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株】。 Ti質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞核外存在的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子。溫度低于30℃？ Ti質(zhì)粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應(yīng)基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農(nóng)桿菌中表達(dá)，它們只有進(jìn)入植物細(xì)胞后才能表達(dá)，Ti質(zhì)粒上的冠癭堿分解基因產(chǎn)物卻能分解冠癭堿，為宿主細(xì)胞提供能源、氮源和碳源。 6大功能區(qū)：致癌區(qū)、冠癭堿合成區(qū)、冠癭堿分解區(qū)、Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū)、毒性區(qū)、DNA復(fù)制區(qū)。 T-DNA：在致癌區(qū)和冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個(gè)24 bp直接重復(fù)序列，由這三部分所構(gòu)成的DNA區(qū)域叫做T-DNA。T-DNA 區(qū)域中的這些基因

32、只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達(dá)。 Vir區(qū)：毒性區(qū)，控制根癌農(nóng)桿菌附著于植物細(xì)胞和Ti質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)部位。VirE, VirD, VirC, VirG, VirB, VirA（最先激活）。 根癌農(nóng)桿菌對高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子，即一些酚類化合物具有趨化性，在植物細(xì)胞表面附著后，受這些創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子的刺激，Ti質(zhì)粒vir區(qū)毒性基因被激活和表達(dá)。 右邊界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能釋放，所以T-DNA不能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。而左邊界的缺失，僅會(huì)影響DNA合成過程的終止。 基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化：將核酸直接發(fā)送至細(xì)胞內(nèi)的物理學(xué)方法。原理：利用火藥爆炸或高壓氣體加速，將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細(xì)胞中，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株，選出其中轉(zhuǎn)基因陽性植株即為轉(zhuǎn)基因植株。 材料：目的基因、受體組織（愈傷組織）、基因槍轟擊金粉包埋試劑盒。 高壓氣體—可裂膜— 子彈載膜 — 子彈—擋網(wǎng)（阻擋可裂膜及載膜的碎片）—培養(yǎng)皿—受體組織