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1、 一、基因工程的基本操作工具 1.與DNA分子相關(guān)的酶 (1)幾種酶的比較續(xù)表 (2)限制酶與DNA連接酶的關(guān)系 限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。 DNA連接酶起作用時不需要模板。2載體(1)作用作為運載工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)。利用它在宿主細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制。(2)具備的條件能在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制。有多個限制酶切割位點，以便與外源基因連接。具有特殊的標記基因，以便進行篩選。 (3)種類 質(zhì)粒：一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，能夠自我復(fù)制的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 噬菌體的衍生物。 動植物病毒。

2、【友情提醒】一般來說，天然載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對某些天然的載體進行人工改造。 限制酶切割位點所處的位置必須是在所需的標記基因之外，這樣才能保證標記基因的完整性，有利于對目的基因的檢測。 【例1】下列有關(guān)基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述，錯誤的是() A一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列 B限制性核酸內(nèi)切酶的活性受溫度影響 C限制性核酸內(nèi)切酶能識別和切割RNA D限制性核酸內(nèi)切酶可從原核生物中提取C 【解析】本題考查基因工程中工具酶的有關(guān)知識。大部分酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，少數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是RNA。酶的活性受到溫度和pH的影響；限制性核酸

3、內(nèi)切酶的特點是能識別雙鏈DNA中特定的核苷酸序列，可在特定的位點進行切割；限制性核酸內(nèi)切酶主要是從原核生物體內(nèi)分離出來的。 【例2】質(zhì)粒作為“分子運輸車”的條件是() 能夠自我復(fù)制雙鏈環(huán)狀DNA分子有多個限制酶切點有標記基因真核細胞中沒有A BC D 【解析】載體具備的條件是：有標記基因；具有多個限制酶切點；能在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制。C 二、基因工程操作程序 1基因工程技術(shù)生產(chǎn)凝乳酶的過程 2基因工程的操作程序分析 (1)目的基因的獲取途徑 從自然界中已有的物種中分離出來，如從基因組文庫或cDNA文庫中獲取。 人工合成目的基因 常用的方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。 利用PCR技術(shù)擴增目的

4、基因 通過PCR技術(shù)可對已獲取的目的基因進行擴增，以獲取大量的目的基因。 (2)基因表達載體的構(gòu)建 【友情提醒】插入的目的基因的表達需要調(diào)控序列，因而用作載體的質(zhì)粒的插入基因部位之前需有啟動子，之后需有終止子。 兩次使用的限制酶為同一種酶，這樣形成的黏性末端堿基之間互補，便于連接。 (3)目的基因?qū)胧荏w細胞導(dǎo)入生物植物動物微生物受體細胞體細胞或受精卵只能是受精卵主要是大腸桿菌導(dǎo)入方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(或花粉管通道法和基因槍法)顯微注射法感受態(tài)細胞法導(dǎo)入過程目的基因插入Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌感染植物細胞表達基因表達載體提純顯微儀注射入受精卵受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因個體Ca2處理大腸桿菌基因表達載體與感受態(tài)細

5、胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子 (4)目的基因的檢測與鑒定 【例3】下列關(guān)于基因表達載體構(gòu)建的相關(guān)敘述，不正確的是() A需要限制酶和DNA連接酶 B必須在細胞內(nèi)進行 C抗生素抗性基因可作為標記基因 D啟動子位于目的基因的首端B 【解析】基因表達載體是目的基因與載體的結(jié)合，在此過程中需用同一種限制酶切割目的基因與載體，用DNA連接酶將相同的末端連接起來；基因表達載體的構(gòu)建是在細胞外進行的；基因表達載體包括啟動子(位于基因首端使轉(zhuǎn)錄開始)、終止子、目的基因和標記基因。1T4 DNA連接酶既能“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，也能“縫合”雙鏈DNA的平末端，EcoliDNA連接酶只能將雙鏈DN

6、A片段互補的黏性末端連接。2目的基因?qū)胧荏w細胞的方法3.獲取目的基因和切割載體時使用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端；獲取一個目的基因需限制酶剪切兩次，共產(chǎn)生4個黏性末端或平末端；限制酶切割位點的選擇必須保證標記基因的完整性，以便于檢測。4啟動子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶(能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì))識別和結(jié)合的部位；終止子也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，能使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來。標記基因的作用是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，如抗生素抗性基因。 1.(2010全國)下列敘述

7、符合基因工程概念的是( ) AB淋巴細胞與腫瘤細胞融合，雜交瘤細胞中含有B淋巴細胞中的抗體基因 B將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株 C用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生改變，通過篩選獲得青霉素高產(chǎn)菌株 D自然界中天然存在的噬菌體自行感染細菌后其DNA整合到細菌DNA上B 【解析】單克隆抗體的制備屬于細胞工程技術(shù)；用紫外線照射青霉菌獲得青霉素高產(chǎn)菌株屬于誘變育種，而基因工程技術(shù)是按照人們的意愿，把一種生物的某一種基因提取出來，加以修飾和改造，然后放到另一種生物細胞里，定向地改造生物的遺傳性狀，因此，選B。 2.(2011浙江)將ada(腺苷酸脫氨酶基因)通過質(zhì)粒

8、pET28b導(dǎo)入大腸桿菌并成功表達腺苷酸脫氨酶。下列敘述錯誤的是( )A每個大腸桿菌細胞至少含一個重組質(zhì)粒B每個重組質(zhì)粒至少含一個限制性核酸內(nèi)切酶識別位點C每個限制性核酸內(nèi)切酶識別位點至少插入一個adaD每個插入的ada至少表達一個腺苷酸脫氨酶分子C 【解析】每個限制性核酸內(nèi)切酶識別位點只能插入一個外源基因，選項C錯誤。重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細胞時，一個細胞可以接受多個質(zhì)粒，選項A正確。作為一個合格的表達載體，重組質(zhì)?？梢杂幸粋€或多個限制性核酸內(nèi)切酶識別位點，選項B正確。外源基因可以多次表達，合成多個產(chǎn)物，選項D正確。 3.(2010江蘇)下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭

9、表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答下列問題：限制酶BamHHindEcoRSma識別序列及切割位點ATCCCCTAGCTTTTCGATTCCTTACCGGGGCC (1)一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma切割前后，分別含有_個游離的磷酸基團。 (2)若對圖中質(zhì)粒進行改造，插入的Sma酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越_。 (3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Sma切割，原因是_。Sma會破壞質(zhì)粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因高0、2 (4)與只使用EcoR相比較，使用BamH和Hind兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止_。 (5)為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目

10、的基因片段混合，并加入_酶。DNA連接質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化 (6)重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了_。 (7)為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在_的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達的初步檢測。鑒別和篩選含有目的基因的細胞以蔗糖為惟一含碳營養(yǎng)物質(zhì) 【解析】(1)質(zhì)粒切割前是雙鏈環(huán)狀DNA分子，故不含游離的磷酸基團。從圖1可知，質(zhì)粒上只含有一個Sma酶的切點，被該酶切割后含有兩個游離的磷酸基團。 (2)G和C含量越多，熱穩(wěn)定性就越高。 (3)構(gòu)建重組質(zhì)粒時標記基因和目的基因應(yīng)保持完整。 (4)只使用EcoR，

11、則質(zhì)粒和目的基因兩端的黏性末端相同，用連接酶連接時，除會產(chǎn)生重組質(zhì)粒外，還會產(chǎn)生質(zhì)粒與質(zhì)粒、目的基因與目的基因自身連接物。 (7)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體后，含有重組質(zhì)粒的個體才能吸收蔗糖。4.甲、乙兩圖表示從細菌細胞中獲取目的基因的兩種方法，以下說法中錯誤的是( )A甲方法可建立該細菌的基因組文庫B乙方法可建立該細菌的cDNA文庫C甲方法要以脫氧核苷酸為原料D乙方法需要逆轉(zhuǎn)錄酶參與C【解析】首先要知道甲圖描述的為該細菌的基因組文庫，只要利用DNA限制性核酸內(nèi)切酶將其原有的DNA切斷即可，不需要以脫氧核苷酸為原料。乙圖描述的為細菌的部分基因組文庫。乙方法需要逆轉(zhuǎn)錄酶參與，

12、并需要以脫氧核苷酸為原料。5.下列屬于PCR技術(shù)的條件的是( )引物 目的基因所在的DNA片段 脫氧核苷酸 核糖核苷酸 DNA連接酶 DNA聚合酶 DNA限制性核酸內(nèi)切酶 A B C DB【解析】 PCR技術(shù)需要一小段與要擴增的DNA兩端的一些序列互補的RNA作為引物、要擴增的DNA作為模板、四種脫氧核苷酸作為原料、需要耐熱的DNA聚合酶催化。6.下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是( )CA BC D【解析】圖是將一個DNA切成互補的兩個黏性末端，必需限制性核酸內(nèi)切酶的作用；圖是將兩個DNA片段連接在一

13、起，需DNA連接酶的作用；圖是DNA分子雙鏈解旋成兩條互補單鏈的過程，需解旋酶的作用；圖是DNA復(fù)制的過程，需DNA聚合酶的作用。7.下圖是將人的生長激素基因?qū)爰毦鶥細胞內(nèi)制“工程菌”的示意圖。已知細菌B細胞內(nèi)不含質(zhì)粒A，也不含質(zhì)粒A上的基因。判斷下列說法正確的是( ) CA將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細菌B常用的方法是顯微注射法B將完成導(dǎo)入過程后的細菌涂布在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能生長的只是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的細菌C將完成導(dǎo)入過程后的細菌涂布在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，能生長的就是導(dǎo)入了質(zhì)粒A的細菌D目的基因成功導(dǎo)入并表達的標志是受體細胞中能檢測出人的生長激素基因【解析】將目的基因?qū)氲郊毦毎谐Ｓ玫姆椒ㄊ荂a2處理法；基因必須保持結(jié)構(gòu)的完整性才能得以表達，而抗氨芐青霉素基因結(jié)構(gòu)完整，能夠表達而使細菌具有對氨芐青霉素的抗性，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能存活的是導(dǎo)入了質(zhì)粒A或?qū)肓酥亟M質(zhì)粒的細菌；由于將人的生長激素基因?qū)氲劫|(zhì)粒的抗四環(huán)素基因上，破壞了抗四環(huán)素基因的完整性，導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的細菌也沒有對四環(huán)素的抗性，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能存活，能存活的是導(dǎo)入質(zhì)粒A的細菌。