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1、 《水產(chǎn)品中4-己基間苯二酚的測定 高效液相色譜法》 編 制 說 明 一、任務(wù)來源，起草單位、協(xié)作單位、主要起草人 《水產(chǎn)品中4-己基間苯二酚的測定 高效液相色譜法》標準由山東省衛(wèi)生廳立項，依據(jù)山東省衛(wèi)生廳《關(guān)于委托承擔山東省食品安全地方標準研制工作的函》（魯衛(wèi)食安函[2012]3號）文件要求，由山東省海洋水產(chǎn)研究所承擔該標準的制定任務(wù)。 本標準主要起草人：宮向紅、徐英江、鄒榮婕、李佳蔚、劉慧慧、田秀慧、 于召強、鄧旭修。 二、制定標準的必要性和意義 4-己基間苯二酚（4-HR），別名：1-(2,4-二羥基苯基)己烷；1,3-二羥基-4-己基苯；4-己基-1,3-二羥基

2、苯；己基樹脂酚；己雷瑣辛；4-己基-1,3-苯二酚。分子量：194.28。結(jié)構(gòu)式： 4-HR作為抗氧化劑，主要用于蝦、蟹類水產(chǎn)品的加工中，其目的是防止產(chǎn)品在貯存過程中由于多酚氧化酶的催化而發(fā)生的氧化褐變或色澤變黑的現(xiàn)象出現(xiàn)。其后又應(yīng)用在其它蔬菜水果的保鮮上，可抑制蘑菇、鮮切梨、馬鈴薯的褐變，延長鮮切蘋果的貯藏期，并能抑制微生物的生長，起到抗菌作用。 目前，4-HR 在食品上的應(yīng)用已引起國內(nèi)的關(guān)注。聯(lián)合國FAO/WHO 所屬JECFA 于1995 年第44 次會議上，第一次準許使用4-HR，在其ADI 值的說明中：“對甲殼類的處理濃度最高為50 mg/L，食用部位的最高殘留量約1mg/k

3、g，可無毒性問題，ADI 不做限制性規(guī)定”。根據(jù)我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》（GB2760―2011）中規(guī)定：可按生產(chǎn)需要用于防止蝦類褐變，其使用后殘留量應(yīng)≤1mg/kg。使用時可配成一定濃度的浸泡液，將需要處理的蝦類置于溶液浸泡。聯(lián)合國FAO/WHO 所屬JECFA規(guī)定對甲殼類的處理濃度最高為50 mg/L，食用部位的最高殘留量約1 mg/kg。2012年衛(wèi)生部將4-HR列入擬取消的38種食品添加劑之一。 根據(jù)現(xiàn)有的資料查詢，國內(nèi)尚無水產(chǎn)品中4-HR 檢測方法標準，可見在該種添加劑的監(jiān)管上，目前面臨的首要問題是標準的缺位。殘留監(jiān)測是確保食品安全和人類健康的最后一道防線，測定標準是殘留監(jiān)測

4、的依據(jù)，因此必須建立靈敏度高、準確性好的檢測方法，從源頭上規(guī)范4-己基間苯二酚的使用，以確保我國水產(chǎn)品安全、維護公眾身體健康。 三、主要起草過程 山東省海洋水產(chǎn)研究所在接到山東省衛(wèi)生廳下達的《水產(chǎn)品中4-己基間苯二酚的測定 高效液相色譜法》標準制定任務(wù)后，成立了標準制定小組，在儀器設(shè)備、試驗材料和資料檢索等方面做了充分準備，并對所檢索到的資料進行了綜合分析，確定了實驗方案；本標準在制定過程中主要參考了國內(nèi)外先進的檢測技術(shù)，通過試驗條件的篩選，確定了最佳方法，并對方法的適用性、回收率、精密度及檢出限進行了試驗。 2012年1月～2012年6月，對不同的水產(chǎn)品進行了提取、加標試驗，通過對提取

5、劑的篩選、凈化方法的優(yōu)化等研究實驗，完成了水產(chǎn)品中4-己基間苯二酚檢測方法的適用性、回收率、精密度及檢出限等試驗工作。2012年7月～2012年8月，依據(jù)GB/T 1.1-2009 《標準化工作導則 第一部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》、GB 2001.4-2001 《標準編寫規(guī)則 第四部分：化學分析方法》對標準進行了編寫，完成了本標準的送審稿。 四、制定標準的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標準的關(guān)系 （一）標準編制原則 本標準制定的主要原則，一是保證水產(chǎn)品的衛(wèi)生安全，遵循“保證基本安全和大眾消費”宗旨；二是標準具有科學性和可操作性，有利于實際生產(chǎn)的指導和產(chǎn)品認證工作；三是與先進國家

6、的標準相接軌，適應(yīng)加入WTO后國際市場對水產(chǎn)品安全性的要求，標準具有先進性。 （二）與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標準的關(guān)系 聯(lián)合國FAO/WHO 所屬JECFA規(guī)定4-HR對甲殼類的處理濃度最高為50 mg/L，食用部位的最高殘留量約1 mg/kg；我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》（GB 2760―2011）中規(guī)定：4-HR可按生產(chǎn)需要用于防止蝦類褐變，其使用后殘留量應(yīng)≤1mg/kg。本標準的靈敏度均能滿足以上要求。標準的制定符合我國的《食品衛(wèi)生法》、《產(chǎn)品質(zhì)量法》、《水產(chǎn)品衛(wèi)生管理辦法》、《標準化法》等法律、法規(guī)精神，與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性標準相協(xié)調(diào)，沒有矛盾。 五、主要條款的說明，主

7、要技術(shù)指標、參數(shù)、試驗驗證的論述 1．標準適用范圍的說明 本標準規(guī)定了水產(chǎn)品中4-己基間苯二酚（4-HR）殘留量的液相色譜測定方法，適用范圍是水產(chǎn)品可食組織中4-HR殘留量的檢測。 2．方法原理 樣品用乙腈提取，乙腈飽和正己烷去脂，用高效液相色譜儀進行測定，外標法定量。 3．方法主要參數(shù)及實驗條件的確定 3.1 提取方法的選擇 根據(jù)4-HR的物理性質(zhì)，微溶于水易溶于極性有機溶劑，選擇乙腈、甲醇、乙酸乙酯三種溶劑為提取劑。3種溶劑均能提取4-HR，但是甲醇和乙酸乙酯提取后均需要蒸干，用流動相復溶后，再用正己烷去除脂肪，方可上機測定，操作步驟較繁瑣。而用乙腈提取時可直接用乙腈飽和正己

8、烷去除脂肪，上機測定未見有干擾峰，方法方便快捷，故本標準采用乙腈進行提取。 在優(yōu)化提取條件時，采用向蝦中添加濃度為1.0 mg/kg 的4-HR，分別用乙腈分一次（25 mL）、兩次（15、8 mL）和三次（10、8、5 mL）提取，回收率依次為79%、91% 和93%，因此選擇用25 mL乙腈分兩次提?。?5、8 mL）。 3. 2 凈化條件的選擇 試驗證明，采用乙腈飽和正己烷去除樣品溶液中的脂肪等雜質(zhì)，4-HR沒有損失，且凈化效果滿意，所以采用乙腈飽和正己烷對樣品進行凈化。 3.3液相色譜分析條件的確定 3.3.1 推薦的色譜柱 C18（150 mm×4.6 mm，5μm）或性

9、能相當者。 3.3.2 檢測波長的確定 4-HR具有熒光性質(zhì)，選擇DAD 和FLD 兩種檢測器對其進行比較實驗，結(jié)果顯示，F(xiàn)LD 的靈敏度明顯高于DAD 的靈敏度，且抗干擾能力比較強。分別固定激發(fā)波長和發(fā)射波長進行掃描，確定4-HR 的最大激發(fā)波長為280nm，最大發(fā)射波長為320nm。 3.3.3流動相的選擇 采用甲醇-水體系為流動相，試驗比較了不同比例流動相等度洗脫對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，4-HR雖能與雜峰分離，但峰形不夠?qū)ΨQ，而采用甲醇-乙腈-水體系可有效地改善峰形，提高了靈敏度，經(jīng)試驗確定甲醇-乙腈-水（體積比為50∶15∶35）等度洗脫，不僅能將待測物很好地分離出來，不受

10、雜峰的干擾，且出峰時間較適中，峰寬、峰形等定量條件較好。 標準譜圖、空白樣品譜圖、加標樣品譜圖見圖1～10。 圖1 標準溶液色譜圖（100 μg/L） 圖2 空白對蝦樣品色譜圖 圖3對蝦加標樣品色譜圖（添加量0.1 mg/kg） 圖4對蝦加標樣品色譜圖（添加量1.0 mg/kg） 圖5 空白梭子蟹樣品色譜圖 圖6 梭子蟹加標樣品色譜圖（添加量0.1 mg/kg） 圖7 梭子蟹加標樣品色譜圖（添加量1.0 mg/kg） 圖8 空白鯉魚樣品色譜圖 圖9 鯉魚加標樣品色譜圖（添加量0.1 mg/kg） 圖10 鯉魚

11、加標樣品色譜圖（添加量1.0 mg/kg） 3.4 方法回收率和精密度 分別選用陰性的對蝦、梭子蟹、鯉魚進行加標回收和精密度實驗，考察方法的準確度和重現(xiàn)性。實驗采用在5.0 g樣品中分別添加0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg和2.0 mg/kg水平的標準溶液，每個水平加標6個樣品，測定3個批次。實驗結(jié)果：平均回收率都在70%以上，批內(nèi)、批間相對標準偏差均在10%以下（見表1）。 表1 回收率及精密度 樣品 添加量 （mg/kg） 測定批次 平均回收率（%，n=6） 批內(nèi)相對標準偏差（%） 批間相對標準偏差（%，n=18） 對蝦 0.1 1 7

12、0.2 7.6 7.4 2 74.4 7.0 3 76.1 6.8 0.5 1 80.6 4.6 5.1 2 77.5 5.4 3 78.8 4.8 1.0 1 81.3 4.4 4.6 2 84.2 5.1 3 82.7 4.2 2.0 1 84.8 4.2 4.5 2 89.6 4.6 3 86.7 5.1 梭子蟹 0.1 1 72.2 6.9 6.8 2 72.8 7.1 3 77.6 6.6 0.5 1 78.2 4.5 5.4 2 74.8 5.6 3 8

13、1.9 5.2 1.0 1 84.3 5.4 4.9 2 83.1 4.8 3 87.6 4.4 2.0 1 93.7 4.2 4.1 2 91.8 4.2 3 89.6 4.6 鯉魚 0.1 1 77.6 6.7 7.0 2 78.2 6.5 3 74.8 6.8 0.5 1 79.5 5.5 5.7 2 78.8 5.2 3 81.1 5.6 1.0 1 84.2 5.1 4.9 2 82.5 4.7 3 83.8 4.8 2.0 1 86.7 5.2 5.0 2

14、 84.2 5.4 3 83.6 4.8 3.6 方法的檢出限及線性范圍 分別在對蝦、梭子蟹、鯉魚中添加4-HR 0.05 mg/kg時信噪比大于3，確定方法檢出限為0.05 mg/kg，分別在對蝦、梭子蟹中添加4-HR 0.1 mg/kg時信噪比大于10（見圖3、圖6、圖9），回收率均大于70%，因此最終確定該方法的定量限為0.1 mg/kg?？瞻讟悠纷V圖見圖2、圖5、圖8。 取4-HR標準中間液，用乙腈稀釋成濃度范圍為0.01 μg/mL～0.5 μg/mL的標準工作液。取20 μL進樣，以色譜峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線（見圖11）。方法線性范圍、回歸方程見表2，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。 表2 方法線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù) 待測物 線性范圍 回歸方程 相關(guān)系數(shù) 4-HR 0.01 μg/mL～0.5 μg/mL Y=3.37e+006X+8.40e+003 r=0.9987 圖11 4-HR標準曲線 六．重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果 無重大分歧 七．其它需要說明的事項 無。