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ICS 65.020.01 ICS 65020.30 B43 GB 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T XXX-XXX I GB/XX XX—XXXX 芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法 Determination of mangiferin in mango (Mangifera indica L.) leaves – high-performance liquid chromatorgraphy XXX-XX-XX發(fā)布 XXX-XX-XX實(shí)施 中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì) 發(fā) 布 前??言 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。 本標(biāo)準(zhǔn)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陽辛鳳，蘭韜，席興軍，韓丙軍，趙方方，張?jiān)?，郭曉杰，王? 1　 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定芒果葉中芒果苷含量的原理、材料、儀器與設(shè)備、測(cè)定步驟、結(jié)果計(jì)算與表示、精密度和回收率、檢驗(yàn)報(bào)告。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 GB/T 8855 水果和蔬菜 取樣方法 3　 原理 樣品經(jīng)提取后，將提取液過濾，經(jīng)反向高效液相色譜分離測(cè)定，在258nm下檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積定量。 4　 試劑與材料 4.1 試劑 4.1.1 甲醇（CH3OH）：色譜純。 4.1.2 乙腈（CH3CN）：色譜純。 4.1.3 甲酸（HCOOH）：色譜純。 4.1.4 甲醇溶液（70%）：甲醇與超純水按照7:3體積比混合。 4.1.5 甲酸溶液（0.1%）：1 L超純水中加入1 mL甲酸。 4.1.6 芒果苷（mangiferin，C19H18O11，CAS : 4773-96-0）對(duì)照品：純度≥98%。 4.1.8 流動(dòng)相：乙腈（4.2）：甲酸溶液（4.5）=15:85（體積比）。 4.1.9 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（200 μg/mL）：稱取10 mg（精確至0.10mg）芒果苷對(duì)照品，置于50 mL容量瓶中，加甲醇（4.1）超聲溶解并定容至刻度線，混勻，配制成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，–18℃冰箱避光保存，有效期3個(gè)月。 4.1.10 芒果苷中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取0.5mL芒果苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10mL容量瓶中，用甲醇溶液（4.1）稀釋至定容刻度線，搖勻，得到芒果苷中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度10 μg/mL）。–18℃冰箱避光保存，有效期1個(gè)月。 4.1.11 芒果苷系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確移取0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL芒果苷中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液于不同的10mL容量瓶中，用70%甲醇溶液（4.4）稀釋、定容刻度線，搖勻，得到芒果苷系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量濃度分別為0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL）。2～8C保存，有效期2周。 4.1.12 除另外有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水應(yīng)復(fù)合GB/T6682中一級(jí)水的要求。 4.2.材料 4.2.1 離心管：100 mL（螺旋蓋）。 4.2.2 三角瓶：250 mL（磨口塞）。 4.2.3 容量瓶：10 mL，50 mL，100 mL，250 mL。 4.2.4 刻度玻璃移液管：1m mL 4.2.5針式微孔濾器：孔徑0.22 μm，直徑13 mm的聚四氟乙烯（PTFE）濾膜或者相當(dāng)者。 5 儀器和設(shè)備 5.1 液相色譜儀：配紫外（UV）檢測(cè)器或PDA、DAD檢測(cè)器。 5.2分析天平：感量0.1 mg。 5.3電子天平：感量0.01 g。 5.4超聲波振蕩器：功率不低于250 W，或相當(dāng)?shù)脑O(shè)備。 5.5組織搗碎機(jī) 5.6高速組織勻漿機(jī) 5.7渦旋振蕩器 6 測(cè)定步驟 6.1 試樣制備、保存 按照GB/T 8855 水果和蔬菜取樣方法。新鮮芒果葉片充分打碎（5.5）、混勻，置于潔凈容器中，密封并做好標(biāo)記，于–18℃冰箱避光保存。 6.2 提取 芒果葉試樣（6.1）解凍，稱取芒果葉試樣1.00g (精確至0.01g) ，置于100 mL離心管（4.2.1）中，加入提取溶劑70%甲醇溶液（4.1.4）50mL，18 000 rpm高速勻漿1 min（5.6），將樣品轉(zhuǎn)移到250 mL具塞磨口三角瓶（4.2.2）中。分別用40mL、30mL提取溶劑洗滌離心管和刀頭共2次，溶液均合并至三角瓶中。將三角瓶瓶塞蓋上，放入超聲清洗儀（5.4）中，室溫下超聲提取30 min。取出，靜置20min，使分層。將上清轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中（4.2.3），樣品碎渣保留在三角瓶中。三角瓶中加入70%甲醇溶液（4.1.4）100mL，超聲30 min，進(jìn)行二次提取。容量瓶上放置漏斗，放入脫脂棉，將提取液過濾，濾液合并至250mL容量瓶，用少量70%甲醇溶液（4.1.4）洗滌三角瓶內(nèi)壁與漏斗內(nèi)壁共3次，洗滌液均合并至250mL容量瓶，靜置，樣品溫度冷卻至室溫后，用70%甲醇溶液（4.1.4）定容至250mL，搖勻，得到芒果葉樣品提取液。 以1.0 mL刻度玻璃移液管（4.2.4）吸取樣品提取液1.0mL，放入100mL容量瓶中，用70%甲醇溶液（4.1.4）定容，搖勻。用一次性注射器吸取適量體積樣品溶液，0.22 μm 濾膜過濾（4.2.5），濾液待上機(jī)分析。 6.3 樣品測(cè)定 6.3.1高效液相色譜參考條件 -液相色譜柱：C18色譜柱,柱長250mm,內(nèi)徑4.6mm,粒徑5μm，或具有同等性能的色譜柱。 -流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（4.5）+乙腈=85+15（體積比）。 -流速：1 mL/min。 -檢測(cè)波長：258 nm。 -進(jìn)樣體積：10 μL。 -柱溫：25℃。 6.3.2 液相色譜測(cè)定 分別取適量的芒果苷系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（4.1.11）及待上機(jī)試樣溶液，按照6.3.1列出的條件進(jìn)行液相色譜分析測(cè)定。由保留時(shí)間進(jìn)行定性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及芒果苷響應(yīng)信號(hào)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。工作曲線線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.999。 待測(cè)樣液中芒果苷的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)行分析。分析過程中，每20次樣品測(cè)定后應(yīng)加入一個(gè)與樣品峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液，如果測(cè)得的值與原值相對(duì)平均偏差超過5%，則應(yīng)重新進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。標(biāo)注曲線及典型樣品色譜圖參見附錄A。 7空白試驗(yàn) 除不加試樣外,均按上述步驟進(jìn)行。 8 結(jié)果計(jì)算與表示 8.1 結(jié)果計(jì)算 試樣中目標(biāo)物的含量按式(1)計(jì)算,計(jì)算結(jié)果需扣除空白值: (ρ﹣ρ0 )V n m 1 0001 000 X = 100 …………………………………………（1） 式中: X ——試樣中芒果苷的含量,單位為克每百克(mg/100mg); ρ ——樣液中芒果苷的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL); ρ0 ——空白中芒果苷的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL); V——樣液定容體積,單位為毫升(mL); n——稀釋倍數(shù); m——試樣的質(zhì)量,單位為克(g); 1000———換算系數(shù); 100 ———換算系數(shù)。 8.2 結(jié)果表示 測(cè)定結(jié)果以平均測(cè)定的算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。兩次平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)平均偏差不應(yīng)超過5%。 9精密度和回收率 本方法的精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見附錄B。 10檢出限 當(dāng)稱樣量為1g時(shí)，芒果苷檢出限為 0.08 mg/g，定量限為 0.25 mg/g。 11檢驗(yàn)報(bào)告 檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容： —識(shí)別被測(cè)試樣需要的所有信息； —依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)方法（本標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)）； —芒果苷的測(cè)定結(jié)果； —實(shí)驗(yàn)日期； —測(cè)定人員。 此外，還需說明使用的方法，還應(yīng)包括本標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定的或選擇頂?shù)臈l件，以及可能影響結(jié)果的其他條件。測(cè)試報(bào)告應(yīng)包括試樣的唯一性資料。 附 錄 A 色 譜 圖 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紫外檢測(cè)色譜圖見圖 A.1。 a 圖 A.1 芒果苷對(duì)照品紫外檢測(cè)色譜圖（1μg/mL） 附錄B 方法的精密度和回收率 表1 方法的精密度和回收率 樣品 添加水平（mg/g） 重復(fù) 測(cè)定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率 (%) 平均回收率(%) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質(zhì) （本底） 1 20.48 20.80 - - - 2 20.63 - 3 20.60 - 4 20.98 - 5 21.13 - 6 20.63 - 7 20.75 - 8 20.63 - 9 21.18 - 10 21.05 - 芒果葉 2.50 1 22.88 23.25 83.00 98.10 9.74 2 23.23 97.00 3 23.35 102.00 4 23.23 97.00 5 23.00 88.00 6 23.40 104.00 7 23.45 106.00 8 23.18 95.00 9 23.45 106.00 10 23.38 103.00 芒果葉 5.00 1 25.08 25.06 85.50 85.10 7.31 2 25.25 89.00 3 25.15 87.00 4 25.38 91.50 5 24.48 73.50 6 24.78 79.50 7 25.43 92.50 8 24.93 82.50 9 24.78 79.50 10 25.33 90.50 芒果葉 7.50 1 27.30 27.35 86.67 96.35 7.37 2 26.83 80.33 3 27.85 94.00 4 27.88 94.33 5 27.60 90.67 6 26.83 80.33 7 27.40 88.00 8 28.20 98.67 9 27.00 82.67 10 26.60 77.33