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豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測定 BJS 201909 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星的測定和確證。 2 原理 采用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取樣品中的喹諾酮類化合物，經(jīng)離心和過濾后，上清液經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測和確證，內(nèi)標(biāo)法定量。 3 試劑和材料 以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 3.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。 3.2 甲醇（CH3OH）：色譜純。 3.3 甲酸（CHOOH）：色譜純。 3.4 甲醇（CH3OH）。 3.5 氨水（NH4OH）：濃度25%～28%。 3.6 乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O82H2O）。 3.7 檸檬酸（C6H8O7H2O）。 3.8 磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）。 3.9 氫氧化鈉（NaOH）。 3.10 鹽酸（HCl）：含HCI 38%。 3.11 乙酸銨（CH3COONH4）：色譜純。 3.12 磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取71.63 g磷酸氫二鈉（3.8），用水溶解并定容至1000 mL。 3.13 檸檬酸溶液（0.1 mol/L）：稱取21.01 g檸檬酸（3.7），用水溶解并定容至1000 mL。 3.14 Mcllvaine緩沖溶液：將1000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液（3.13）與625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液（3.12）混合，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.00.1。 3.15 EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（0.1 mol/L）：稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉（3.6）至1625mL Mcllvaine緩沖溶液（3.14）中，超聲使其溶解。 3.16 5%甲醇水溶液：取5 mL甲醇（3.4），用水稀釋至100 mL。 3.17 25%氨水甲醇溶液：取25 mL氨水（3.5），用甲醇（3.4）稀釋至100 mL。 3.18 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量見附錄A表A.1，純度≥99%。 3.19 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品（3.18）約10 mg，置10 mL容量瓶中，加入0.2 mL甲酸（3.3），超聲使溶解，用乙腈（3.1）定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，轉(zhuǎn)移至溶劑瓶中于-18℃以下避光保存，有效期6個(gè)月。 3.20 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.19）1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為0.01 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度約0.015mg/mL），于4℃以下避光保存，有效期3個(gè)月。 3.21 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.20）1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度約1.5 μg/mL），于4℃以下避光保存，臨用新配。 3.22 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別稱取氘代同位素標(biāo)準(zhǔn)品（3.18）約10 mg，至10 mL容量瓶中，加入0.2 mL甲酸（3.3），超聲溶解，用乙腈（3.1）稀釋至刻度，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃以下避光保存，有效期6個(gè)月。 3.23 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.22）0.01mL于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為1.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于4℃以下避光保存，臨用新配。 3.24 固相萃取小柱（500 mg，6 mL）：HLB柱或相當(dāng)者。使用前依次以6 mL甲醇、6mL水活化，保持柱體濕潤。 4 儀器和設(shè)備 4.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。 4.2 分析天平：感量0.001g和0.00001 g。 4.3 渦旋振蕩器 4.4超聲儀 4.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥8000 r/min 4.6 均質(zhì)器 4.7 氮?dú)鉂饪s儀 5 測定步驟 5.1 試樣制備與保存 豆制品、火鍋和麻辣燙的食材 從待檢樣品中取出樣品約500g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于-18℃冷凍存放。 火鍋底料、麻辣燙底料 固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于4℃冷藏存放。 半固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，放入研缽中，迅速研磨均勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記于4℃冷藏存放。 液體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，攪拌均勻后裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于4℃冷藏存放。 5.2 樣品溶液制備 提?。悍Q取5.0 g均勻樣品（精確至0.001g），置50 mL離心管中，精密加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.23）0.1mL，加入20 mL 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（3.15），渦旋混勻1min，超聲提取15 min，8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，殘?jiān)肊DTA-Mcllvaine 緩沖溶液（3.15）同法重復(fù)提取兩次，每次10 mL，合并上清液至同一容量瓶中，用EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（3.15）定容至刻度，混勻。用濾紙過濾（必要時(shí)10000 r/min離心5 min后過濾），續(xù)濾液待凈化。 凈化：精密吸取上述待凈化液25.0 mL，以約1 mL/min的流速全部通過固相小柱（3.24），用3 mL 5%甲醇水溶液（3.16）淋洗，抽干，先后以6 mL甲醇、3 mL氨水甲醇（3.17）洗脫，合并甲醇及氨水甲醇洗脫液，45 ℃氮吹至近干，準(zhǔn)確加入2.0 mL流動(dòng)相初始比例復(fù)溶液溶解殘?jiān)^0.22 μm濾膜，續(xù)濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。 5.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 稱取5.0 g空白試樣（精確至0.001g），置50 mL離心管中，除不加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液外，其余同5.2操作處理后得到空白基質(zhì)，共制備6份。 分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.21）0 mL、0.010 mL、0.020 mL、0.050 mL、0.100 mL、0.200 mL及混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.23）0.025 mL于試管中，氮吹至近干，精密加入1.0 mL空白基質(zhì)復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，制成濃度為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度為0 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、75 ng/mL、150 ng/mL、300 ng/mL，同位素內(nèi)標(biāo)濃度約25ng/mL）。 5.4 測定 5.4.1 液相色譜參考條件 1） 色譜柱：C18色譜柱，2.1 mm50 mm1.7 μm，或性能相當(dāng)者。 2） 柱溫：40℃。 3） 流速：0.25 mL/min。 4） 進(jìn)樣量：2 μL。 5） 流動(dòng)相：A-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），B-乙腈。梯度洗脫條件見表1。 表1 梯度洗脫條件 時(shí)間（min） A(%) B(%) 0 90 10 3 90 10 8 70 30 10 70 30 10.5 5 95 13 5 95 13.1 90 10 15 90 10 5.4.2 質(zhì)譜參考條件 1） 電離方式：電噴霧電離（ESI）； 2） 掃描方式：正離子掃描； 3） 檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM； 4） 離子源參數(shù)參考條件： 離子源接口電壓， 4000 V；離子源接口溫度，350 ℃；脫溶劑溫度，250 ℃；離子源加熱溫度， 400 ℃；霧化氣流速，2.9 L/min；干燥氣流速，10.0 L/min；加熱氣流速，10.0 L/min。 5）定性離子對、定量離子對參見表2。 表2 喹諾酮類藥物主要質(zhì)譜參數(shù) 序號 組分 母離子 子離子 Q1 預(yù)四極桿電壓 碰撞電壓 Q3 預(yù)四極桿電壓 （m/z） （m/z） （V） (V) （eV） 1 諾氟沙星 320.2 *302.0 -16 -21 -21 231.1 -15 -39 -25 2 氧氟沙星 362.2 *318.2 -30 -18 -24 261.1 -30 -28 -19 3 洛美沙星 352.0 *265.0 -25 -23 -29 308.0 -25 -17 -22 4 培氟沙星 334.0 290.1 -25 -18 -20 *316.2 -25 -21 -22 5 氟羅沙星 370.0 *326.0 -30 -20 -23 269.0 -29 -28 -26 6 沙拉沙星 386.2 342.0 -15 -19 -25 299.1 -29 -30 -20 *368.1 -14 -22 -26 7 雙氟沙星 400.0 *356.0 -17 -20 -25 299.0 -17 -28 -28 8 司帕沙星 393.0 *349.0 -30 -21 -28 292.0 -30 -21 -24 9 環(huán)丙沙星 332.1 *314.1 -25 -21 -22 287.8 -24 -17 -30 231.0 -25 -40 -40 10 達(dá)氟沙星 358.0 *340.1 -26 -23 -24 283.2 -14 -24 -30 82.1 -26 -44 -15 11 恩諾沙星 360.0 *342.1 -27 -20 -25 316.0 -13 -20 -22 245.2 -28 -27 -17 12 D8-環(huán)丙沙星 340.3 322.1 -10 -21 -22 13 D5-恩諾沙星 365.1 321.1 -11 -19 -22 14 D5-諾氟沙星 325.3 307.2 -10 -20 -21 注：1.“*”表示定量離子；2. 所列質(zhì)譜參考條件是在島津（LC/MS-8050）質(zhì)譜儀上完成的，此處所列試驗(yàn)用儀器型號僅供參考，不涉及商業(yè)目的，鼓勵(lì)方法使用者嘗試不同廠家或型號的儀器；3. 對不同質(zhì)譜儀，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳；4. 由于喹諾酮類化合物離子化受基質(zhì)干擾較為顯著，方法使用者可根據(jù)實(shí)際情況選擇表中所列離子對進(jìn)行定性定量測定。 5.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.3）按濃度由低到高依次進(jìn)樣檢測，內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.5 定性 在相同實(shí)驗(yàn)條件下，試樣中待測物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對應(yīng)的保留時(shí)間偏差應(yīng)在2.5%之內(nèi)；且試樣譜圖中各組分定性離子的相對豐度與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液定性離子的相對豐度，其允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍時(shí)，則可確定為樣品中存在此種待測物?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）典型圖譜見附錄B。 表3 定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差 相對離子豐度，% ＞50% ＞20%～50% ＞10%～20% ≤10% 允許的相對偏差，% 20% 25% 30% 50% 5.6 定量 待測樣液中喹諾酮藥物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標(biāo)，洛美沙星、雙氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星以氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)，司帕沙星、沙拉沙星、恩諾沙星以氘代恩諾沙星為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)法定量。本方法中所列內(nèi)標(biāo)能基本滿足方法要求，如條件允許，可采用各化合物的對應(yīng)同位素化合物作為內(nèi)標(biāo)。 6 結(jié)果計(jì)算 試樣測定結(jié)果按公式（1）計(jì)算目標(biāo)物的含量： …………. (1) 式中： X——試樣中被測組分的含量，單位為微克每千克（μg/kg）； m——試樣的稱樣量，單位為克（g）； C——由工作曲線計(jì)算得到的試樣中被測組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）； V——定容體積，單位為毫升（mL）。 F——稀釋倍數(shù) 計(jì)算結(jié)果需扣除空白值（空白基質(zhì)），并保留三位有效數(shù)字。 7 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 7.1 靈敏度 諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、雙氟沙星、司帕沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星檢出限均為5 μg/kg，環(huán)丙沙星檢出限為7.5 μg/kg，沙拉沙星檢出限為7.5 μg/kg。 諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、雙氟沙星、司帕沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星定量限均為15 μg/kg，環(huán)丙沙星定量限為22.5 μg/kg，沙拉沙星定量限為22.5 μg/kg。 7.2 準(zhǔn)確度 本方法在15.0～100.0 μg/kg的添加水平上的回收率范圍為65.0%～120.0%。 7.3 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。 附錄A 標(biāo)準(zhǔn)品信息 表A.1 標(biāo)準(zhǔn)品中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量 序號 化合物名稱 英文名 CAS登錄號 分子式 相對分子質(zhì)量 1 諾氟沙星 Norfloxacin 70458-96-7 C16H18FN3O3 319.33 2 氧氟沙星 Ofloxacin 82419-36-1 C18H20FN3O4 361.37 3 洛美沙星 Lomefloxacin 98079-51-7 C17H19F2N3O3 351.35 4 培氟沙星 Pefloxacin 70458-92-3 C17H20FN3O3 333.36 5 氟羅沙星 Fleroxacin 79660-72-3 C17H18F3N3O3 369.34 6 鹽酸沙拉沙星 Sarafloxacin Hydrochloride 91296-87-6 C20H18ClF2N3O3 421.81 7 鹽酸雙氟沙星 Difloxacin Hydrochloride 91296-86-5 C21H20ClF2N3O3 435.85 8 司帕沙星 Sparfloxacin 110871-86-8 C19H22F2N4O3 392.40 9 環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin 85721-33-1 C17H18FN3O3 331.34 10 甲磺酸達(dá)氟沙星 Danofloxacin mesylate 119478-55-6 C20H24 FN3O6S 453.48 11 恩諾沙星 Enrofloxacin 93106-60-6 C19H22FN3O3 359.39 12 D8-環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin-d8 / C17H10D8FN3O3 339.39 13 D5-恩諾沙星 Enrofloxacin-d5 / C19H17D5FN3O3 364.37 14 D5-諾氟沙星 Norfloxacin-d5 / C16H13D5FN3O3 324.37 注：市售標(biāo)準(zhǔn)品中部分為其鹽酸鹽或甲磺酸鹽。 附錄B 14種喹諾酮類化合物多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）譜圖 14種喹諾酮類化合物火鍋底料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 ng/mL，氘代內(nèi)標(biāo)為25 ng/mL)多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）譜圖 本方法負(fù)責(zé)起草單位：四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院 方法的參與驗(yàn)證單位：上海市食品藥品檢驗(yàn)所、遼寧省食品藥品檢驗(yàn)檢測院、深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院。 主要起草人：余曉琴，李道霞，黃麗娟，成長玉，李澍才，唐昌云 — END —