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1、考點(diǎn)80 PCR技術(shù) 高考頻度：難易程度：★★★☆☆ 暮:考點(diǎn)解讀 1. PCR原理 (1)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復(fù)制的模板 原料 四種脫氧核苜酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 DNA聚合酶 打開DNA雙螺旋 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3,端起點(diǎn) (2)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程 ①DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為3端而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端 DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3,端延伸DNA鏈，因

2、此，DNA復(fù)制需要引物口 DNA的合成方向總是從子鏈的5,端向3,端延伸口 ②在DNA的復(fù)制過程中，復(fù)制的前提是雙鏈解開口在體外可通過控制溫度來實(shí)現(xiàn)。在80?100 “C 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性。PCR利用「 DNA 的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合口由于PCR過程的溫度高，導(dǎo)致DNA 聚合酶失活，后來耐高溫的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，大大增加了 PCR的效率° ③PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，需提供：DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種 引物，四種脫氧核甘酸，耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)

3、進(jìn)行中 2. PCR的反應(yīng)過程 PCR 一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次 循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物I延伸而成的DNA單鏈會與引物H結(jié)合，進(jìn)行DNA的延 伸，這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列成指數(shù) 擴(kuò)增。 3.實(shí)驗(yàn)操作 (1)PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核甘酸原料、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、兩種RNA引 物、水。 (2)實(shí)驗(yàn)操作步驟 ①按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液： ②將PCR反應(yīng)體系50HL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管(0.5 mL)中； ③將

4、微量離心管放到PCR儀中； ④設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)； ⑤DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。 點(diǎn)考向, 考向PCR的反應(yīng)過程 1. PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，下列有關(guān)PCR過程的敘述，不正確的是 A.變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵 B.復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對原則完成 C.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核甘酸 D. PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需耍酶的最適溫度較高 【參考答案】C 【試題解析】PCR技術(shù)變性過程中是通過高溫破壞DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，進(jìn)而使DNA分子 解鏈，該過程在細(xì)胞內(nèi)是通過

5、解旋酶實(shí)現(xiàn)的，A項(xiàng)正確：復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠 堿基互補(bǔ)配對原則完成的，B項(xiàng)正確：PCR反應(yīng)的產(chǎn)物是DNA,所需原料應(yīng)為四種脫氧核苔酸，所以， 延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種脫氧核甘酸，C項(xiàng)錯(cuò)誤；PCR過程所需的酶是耐高溫的DNA 聚合酶，比細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程所需的DNA聚合酶的最適溫度高，D項(xiàng)正確。 2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似（如下圖所示）。圖中引物為單鏈DNA 片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯(cuò)誤的是 A.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列 B.設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對而造

6、成引物自連 C.退火溫度過高可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物 D.第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16 【答案】D 【解析】用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)，要有一段已知目的基因的核甘酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引 物（兩種），但不必知道基因的全部序列，A正確；設(shè)計(jì)引物時(shí)，需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對 而造成引物自連，B正確：退火的目的是使兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條DNA單鏈結(jié)合，因此退 火溫度過高可能引起兩種引物不能與兩條DNA單鏈結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，C 正確；DNA復(fù)制為半保留復(fù)制，第四輪循環(huán)即DNA復(fù)制4次，共形成

7、24= 16個(gè)DNA分子，其中含有 最初模板鏈的2個(gè)DNA分子含有引物A或引物B,其余14個(gè)DNA分子均含有引物A和引物B,所以 第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為14/16=7/8, D錯(cuò)誤。 點(diǎn)過關(guān)，* 1 .有關(guān)PCR技術(shù)的說法，不正確的是 A. PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù) B. PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈轉(zhuǎn)錄 C.利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核甘酸序列 D. PCR擴(kuò)增中不需要解旋嗨解開雙鏈DNA 2.下列有關(guān)PCR技術(shù)的說法，不正確的是 A. PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定

8、的DNA片段的核酸合成技術(shù) B. PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制 C.利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核昔酸序列 D. PCR擴(kuò)增中需要解旋酶解開雙鏈DNA 3 .標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程股分為變性、復(fù)性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是 A. 94 "C、55 3 72 ℃ B. 72 c. 50 3 92 V C. 50 ℃、92。72 D. 80 °C、50 ℃% 72 ℃ 4 .用PCR技術(shù)將DNA分子中的兒片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物I、H,其連接部位如圖所示，x為某限制 醒識別序列。擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的 Ai片段

9、 3, nu A H | Ai R mni D . Ai ( 5 .下列有關(guān)PCR技術(shù)中引物的敘述，正確的是 A.引物是一小段DNA分子或雙鏈RNA分子 B.擴(kuò)增一個(gè)DNA分子至少需要的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目 C兩種引物之間能夠發(fā)生堿基互補(bǔ)配對 D. DNA聚合酶只能從引物的5,端連接脫氧核昔酸 6 .用PCR技術(shù)將DNA分子中的兒片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物I、II,其連接部位如圖所示，x為某限制 酶識別序列口擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的 5* B. I A. 1 C. 7 .用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)

10、，得到以下電泳圖譜.其中：1號為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣 液（Marker） , 10號為蒸播水，PCR過程中加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析不合理的是 馮：野生型植株DNA 3號：? 4^:將U因植株DNA A. PCR產(chǎn)物的分子大小在250~500 bp之間 B. 3號樣品為不含目的基因的載體DNA C. 9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株 D. 10號可確定反應(yīng)體系等對結(jié)果沒有干擾 8 .根據(jù)某基因上游和下游的堿基序列，設(shè)計(jì)合成了用于該基因PCR的兩段引物（單鏈DNA）。引物與該基 因變性DNA（單鏈DNA）結(jié)合為雙鏈DNA的過程稱為復(fù)性.下圖是兩引物的Tm （引物熔解溫

11、度，即50% 的引物與其互補(bǔ)序列形成雙鏈DNA分子時(shí)的溫度）測定結(jié)果，下列敘述錯(cuò)誤的是 A.通常引物I和引物2不能有堿基互補(bǔ)配對關(guān)系 B.兩引物分別是子鏈延伸的起點(diǎn)，并可以反復(fù)利用 C若兩引物的脫氧核昔酸數(shù)相同，推測引物2的GC含量較高 D.復(fù)性所需溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度等因素 9 .以下為形成cDNA過程和PCR擴(kuò)增過程示意圖口據(jù)圖分析，下列說法正確的是 “ 70?75工 RNA鏈 DNA鏈 八/ |①.| |核酸酶斗|② | | RNA單鏈 雜交雙鏈 雙鏈DNA 9/90?95七 —二④ ： ■ 55?60七' A.④過程發(fā)生的變化是引物與單

12、鏈DNA結(jié)合 B.催化①過程的酶是DNA聚合酶 C.催化①②⑤過程的酶都必須能耐高溫 D.過程③需要解旋酶 10.在遺傳病及刑偵破案中常需要對樣品DNA進(jìn)行分析，PCR技術(shù)能快速擴(kuò)增DNA片段，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi) 復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝，有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的 問題.據(jù)圖回答相關(guān)問題. a 璉 ……T—C—3，5（引物 1> b 捱 3，一C~C……A=G-5，（引物II）一 95。* S—G—G^T—C—r 3，一……A—G—5s 55。* 5f—G—G—OH^ 5^G—G……l-O-3r 3‘一O~C ……A—G—51 72

13、J （1 ）在相應(yīng)的橫線上寫出引物II ,并在復(fù)性這一步驟中將引物］1置于合適的位置。 （2）在相應(yīng)的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的DNA分子。0 （3）若將作為原料的四種脫氧核甘酸用32P標(biāo)記，請分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點(diǎn): 循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為 o （4） PCR反應(yīng)過程的前提條件是， PCR技術(shù)利用了 DNA的 原理解決了這個(gè)問題. （5）在對樣品DNA分析過程中發(fā)現(xiàn)，DNA摻雜著一些組蛋白，要去除這些組蛋白可加入的物質(zhì)是 真題過關(guān) 11. （2019 全國卷 I -38） 基因工程中可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?；卮鹣铝?/p>

14、問題口 （1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得?；蛭膸彀?和 （2）生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí)，解開DNA雙鏈的醐是 口在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的 基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是、上述兩個(gè)解鏈過程的共同點(diǎn)是 破壞了 DNA雙鏈分子中的 門 （3）日前在PCR反應(yīng)中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是“ 12. （2018.江蘇卷）為生產(chǎn)具有特定性能的舊淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了 m淀粉酶基因（1656 個(gè)堿基對），利用基因工程大量制備琢如淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程見下圖。請回答下列問題： 7^7 I構(gòu)

15、建幣即衰達(dá)麗口 轉(zhuǎn)化人置桿蠲 ——達(dá)?儼a人宿主細(xì)胞 I匚—?選與aI I 1 。--給―產(chǎn)品分析 （1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（X-淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的：. （2）為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的 端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常 在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是 0 （3）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中 的設(shè)定與 引物有關(guān)，的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長度有關(guān)。（填序號） ①變性溫度②退火溫度③延伸溫度④變性時(shí)間⑤退火時(shí)間⑥延伸時(shí)間 （4）下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼o?-淀粉酶的mRNA的部分堿基序列：

16、 §UAUCCCAUCAACAAAiiACUAACACltU S 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含 個(gè)密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測虛線框后的第一個(gè) 密碼子最多有一種, (5)獲得工程菌表達(dá)的⑥淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測 定酶活性，結(jié)果如下： 緩沖液 50 mmol/LNazHPCU-KH2Poa 50 mmol/LTris-HCl 50 mmol/LGly^NaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 90 9.5 10.0 10.5 酶相對活性％ 254 402 49.

17、8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 205 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該(X-淀粉酶活性最高的條件為 0 13. (2016?天津卷)人血清白蛋白(HSA)具有重要的醫(yī)用價(jià)值，只能從人血漿中制備,下圖是以基因工程技 術(shù)獲取重組HSA (rHSA)的兩條途徑. (1)獲取HSA基因，首先需采集人的血液，提取 合成總cDNA,然后以cDNA為模板, 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增HSA基因。下圖中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴(kuò)增方向，請用箭頭 在方框內(nèi)標(biāo)出另一條引物的位置及擴(kuò)增方向. (2)啟動子通常具有物種及組織特異

18、性，構(gòu)建在水稻胚乳細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)rHSA的載體，需要選擇的 啟動子是 (填寫字母，單選). A,人血細(xì)胞啟動子B.水稻胚乳細(xì)胞啟動子C.大腸桿菌啟動子D.農(nóng)桿菌啟動子 (3)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細(xì)胞的過程中，需添加酚類物質(zhì)，其目的是 (4)人體合成的初始HSA多肽，需要經(jīng)過膜系統(tǒng)加工形成正確空間結(jié)構(gòu)才能有活性。與途徑n相比, 選擇途徑［獲取rHSA的優(yōu)勢是。 (5)為證明rHSA具有醫(yī)用價(jià)值，須確認(rèn)rHSA與 的生物學(xué)功能一致“ 縣急參考答秦, I.【答案】B 【解析】AB項(xiàng)、PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，其原理是DNA雙鏈復(fù) 制，故A項(xiàng)正確，B項(xiàng)錯(cuò)

19、誤：C、利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核甘酸 序列，以便根據(jù)這一序列合成引物，C項(xiàng)正確；D、PCR擴(kuò)增中首先要使目的基因DNA受熱變性后解 鏈為單鏈，不需要解旋酶解開雙鏈DNA,故D項(xiàng)正確。 2 .【答案】D 【解析】PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，A正 確；PCR技術(shù)以解開的雙鏈作為模版，利用的原理是DNA雙鏈復(fù)制，B正確；前提是要有一段已知目 的基因的核甘酸序列以便合成引物，C正確；雙鏈DNA模板在高溫作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA, 可見該過程不需要解旋酶解開雙鏈DNA, D錯(cuò)誤。 3 .【答案】A 【解

20、析】標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為變性、復(fù)性、延伸三大步，其中變性需要高溫使DNA解螺旋，溫度 為90?96℃;復(fù)性是在較低溫度下，兩種引物和DNA單鏈想結(jié)合，溫度為50℃左右；延伸為在DNA 聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈，溫度為70?75℃。綜上所述，A正確，B, C、D錯(cuò)誤。 4 .【答案】D 【解析】利用PCR技術(shù)將DNA分子中的Ai片段進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)引物與母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后， 子鏈延伸的方向總是從5'端到3'端，據(jù)此依題意和圖示分析可知，A、B、C均錯(cuò)誤，D正確。 5 .【答案】B 【解析】引物是一小段單鏈DNA或RNA,可與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對進(jìn)行結(jié)合，A錯(cuò)誤；擴(kuò)增

21、 一個(gè)DNA分子至少需要的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目，B正確；引物與DNA母鏈通過堿基 互補(bǔ)配對進(jìn)行結(jié)合，兩種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，C錯(cuò)誤；DNA聚合酶只能從引物的3 '端連 接脫氧核甘酸，D錯(cuò)誤。 6 .【答案】D 【解析】利用PCR技術(shù)將DNA分子中的Ai片段進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)引物與母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后， 子鏈延伸的方向總是從5,端到3,端，據(jù)此依題意和圖示分析可知，A、B、C均錯(cuò)誤，D正確。 7 .【答案】B 【解析】PCR過程中，可以通過設(shè)計(jì)特定的引物來擴(kuò)增特定的DNA片段，4?9號是轉(zhuǎn)基因植株，理論 上應(yīng)包含目的基因，結(jié)合2號野生型和10號蒸鐐水組的結(jié)果，推測

22、包含目的基因的片段大小應(yīng)為250? 500 bp, A正確；3號PCR結(jié)果包含250?500 bp片段，應(yīng)包含目的基因，B錯(cuò)誤；9號PCR結(jié)果不包 含250?500bp片段，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株，C正確；10號放入蒸餡水，可排除反應(yīng)體系等對結(jié)果 的干擾，D正確。 8 .【答案】B 【解析】通常引物1和引物2不能有堿基互補(bǔ)配對關(guān)系，以免二者結(jié)合，A項(xiàng)正確；兩引物參與構(gòu)成子 鏈，不能反復(fù)利用，B項(xiàng)錯(cuò)誤；若兩引物的脫氧核昔酸數(shù)相同，引物2的熔解溫度較高，推測其GC含 量較高，C項(xiàng)正確；結(jié)合以上分析可知，復(fù)性所需溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度 等因素，D項(xiàng)正確。 9 .【答案

23、】A 【解析】分析題圖：圖示為形成cDNA過程和PCR擴(kuò)增過程示意圖，其中①是由RNA形成單鏈DNA 的過程，為逆轉(zhuǎn)錄過程；②是由單鏈DNA合成雙鏈DNA的過程，是DNA分子復(fù)制過程；③④⑤是多 聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段，其中③是變性、④是復(fù)性、⑤是延伸階段。④為復(fù)性過程，發(fā)生的變化 是引物與互補(bǔ)DNA鏈結(jié)合，A正確；①為逆轉(zhuǎn)錄過程，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，B錯(cuò)誤；圖中② ⑤過程為DNA復(fù)制，這兩個(gè)過程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤過程進(jìn)行的溫度是70?75℃,因 此催化該過程的DNA聚合酶能耐高溫，但催化②過程的酶不耐高溫，C錯(cuò)誤：過程③為高溫解鏈，該 過程不需要解旋酶，D錯(cuò)誤。

24、55℃p 10 .【答案】(I) 5,―G—A—OH(或 HO—A -G- 5r) HO—A—G—5'5'—G—G―OH. 3」C—C……A—G—5r 5r—G—G……T—C — 3L (2) 5'—G—G T—C—3' 3'—C—C A—G—5^ (3)每個(gè)DNA分子各有一條鏈含32P l/2n (4) DNA解旋熱變性 (5)蛋白醐 【解析】(1)由圖可知，引物II為S'-G-A-OH. (2)循環(huán)一次后生成的DNA分子如下： 一._5rzz二::二二二gq 172 V ⑵3，-C-C??…A-G-5* 5f—G-O??…T-C-3d 5-G-G，，，**，T-C—3

25、，3'— C-G…“A-G-5 L (3)若將作為原料的四種脫氧核甘酸用32P標(biāo)記， 根據(jù)DNA半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，循環(huán)一次后，每個(gè)DNA分子各有一條鏈含32p,循環(huán)n次后生成的 DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為2/2n+i=l/2n。 (4) PCR反應(yīng)過程的前提條件是DNA 解旋，PCR技術(shù)利用DNA的熱變性原理解決了這個(gè)問題。(5)在對樣品DNA進(jìn)行分析的過程中發(fā) 現(xiàn)，DNA摻雜著一些組蛋白，根據(jù)酶的專一性原理，要去除這些組蛋白可加入蛋白酶。 11 .【答案】（1）基因組文庫 cDNA文庫 （2）解旋酶 加熱至90?95 C 氫鍵 （3） 7hq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸

26、桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活 【解析】 【分析】基因工程的操作步驟：目的基因的獲取（基因文庫獲取、PCR、人工合成）；構(gòu)建基因表達(dá)載 體（含目的基因、標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)）；把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（顯微注射法、 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、鈣離子處理法）：目的基因的檢測和鑒定（分子水平一DNA分子雜交法、分子雜交法、 抗原抗體雜交法和個(gè)體水平一抗蟲、抗病接種實(shí)臉等）。 【詳解】（1）基因文庫包括基因組文庫和部分基因文庫（cDNA文庫），前者包括一種生物的全部基因， 后者只包括一種生物的部分基因。 （2）體內(nèi)進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋障可以打開雙鏈之間的氫鍵，DN

27、A聚 合酶可以催化磷酸二酯鍵的形成。在體外進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，利用高溫變性即加熱至90-95C,破壞雙鏈 之間的氫鍵，使DNA成為單鏈。解旋酶和高溫處理都破壞了 DNA雙鏈中堿基對之間的氫鍵。 （3）由于在PCR過程中，需要不斷的改變溫度，該過程中涉及較高溫度處理變性，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的 DNA聚合酶在高溫處理下會變性失活，因此PCR過程中需要用耐高溫的T叫DNA聚合酶催化。 12 .【答案】（1）基因組DNA （2）5， 使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連 （3）② ⑥ （4） 8 13 （5） pH 為 8.5,緩沖液為 50mmol/LTris-HCl 【解析】（1） a

28、-淀粉酶基因來自于海洋細(xì)菌，因此為了利用PCR技術(shù)擴(kuò)增a-淀粉酶基因，必須先獲得 細(xì)菌的基因組DNA。（2）目的基因與運(yùn)載體結(jié)合前需要用限制酶對兩者進(jìn)行切割，延伸是在引物的3' 端延伸，為了保證目的基因的完整性，因此需在引物的5'端加上限制性酶切位點(diǎn)，且為了使DNA片段 能定向插入表達(dá)載體，減少自連，常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性悔切位點(diǎn)。（3）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)， 退火溫度的設(shè)定與引物有關(guān)，延伸時(shí)間的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長度有關(guān)。（4）根據(jù)題意分析，虛線框內(nèi) mRNA片段內(nèi)含有24個(gè)堿基，每3個(gè)堿基構(gòu)成一個(gè)密碼子，因此包含24+3=8個(gè)密碼子：構(gòu)成mRNA 的堿基有4種，若虛線框后的序列未知，預(yù)測虛

29、線框后的第一個(gè)密碼子最多有4x4-3=13種。（5）根 據(jù)表格數(shù)據(jù)分析可知，在pH為8.5,緩沖液為50mmol/LTris-HCl的條件下，a-淀粉酶相對活性為99.5%, 活性最高。 13 .【答案】（1）總RNA （或mRNA） USA展內(nèi) (2) B (3)吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細(xì)胞，有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化 (4.)水稻是真核生物，具有膜系統(tǒng)，能對初始rHSA多肽進(jìn)行高效加工 (5) HSA 【解析】(1)合成總cDNA需提取細(xì)胞中所有的mRNA,然后通過反轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行合成口采用PCR 技術(shù)擴(kuò)增HSA基因時(shí)，兩條引物分別與模板鏈的5,端結(jié)合，獷增方向相反口 (2)根據(jù)啟動子通常具 有物種及組織特異性可知，構(gòu)建在水稻胚乳細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)rHSA的載體，需要選擇的啟動子是水稻胚 乳細(xì)胞啟動子口 (3)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細(xì)胞的過程中，酷類筋質(zhì)可以吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體 細(xì)胞，有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化。(4)水稻是真核生物，具有膜系統(tǒng)，能對初始rHSA多肽進(jìn)行高效 加工，而大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞中不具有生物膜系統(tǒng)。(5)為證明rHSA具有醫(yī)用價(jià)值，須確認(rèn) rHSA與天然的HSA生物學(xué)功能一致中