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1、9 疾病與人類健康 9.1 反轉(zhuǎn)錄病毒 9.2 人類免疫缺陷病毒 9.3 嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征 9.4 原癌基因與抑癌基因 9.5 基因診斷和基因治療 Chapter 9 Disease and human health腫瘤與癌癥癌（癌（cancer）：一群不受生長調(diào)控而繁殖的細胞，惡性腫瘤。）：一群不受生長調(diào)控而繁殖的細胞，惡性腫瘤。腫瘤（腫瘤（tumor）:局限在自己正常位置，不侵犯其他組織細胞。局限在自己正常位置，不侵犯其他組織細胞。癌基因癌基因病毒癌基因（V-oncogene）細胞轉(zhuǎn)化基因（C-oncogene），原癌基因突變產(chǎn)物DNA病毒RNA病毒病毒反轉(zhuǎn)錄病毒（Retroviru

2、s） retruvairs 一組含有一組含有反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶的的RNARNA病毒病毒9.1 反轉(zhuǎn)錄病毒 一、概述一、概述二、分類二、分類三、反轉(zhuǎn)錄病毒的共同特性三、反轉(zhuǎn)錄病毒的共同特性四、反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制四、反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制五、反轉(zhuǎn)錄病毒基因組五、反轉(zhuǎn)錄病毒基因組DNA的復(fù)制的復(fù)制六、反轉(zhuǎn)錄病毒基因組六、反轉(zhuǎn)錄病毒基因組DNA的整合的整合七、反轉(zhuǎn)錄病毒基因組基因的表達七、反轉(zhuǎn)錄病毒基因組基因的表達9.1 反轉(zhuǎn)錄病毒 一、概述一、概述 逆轉(zhuǎn)錄病毒（逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus） 、還原病毒、前病毒等。、還原病毒、前病毒等。 1908，丹麥科學(xué)家發(fā)現(xiàn)。，丹麥科學(xué)家發(fā)現(xiàn)。 1910-1911，R

3、ous進行體外實驗中證實了此病毒的存在。進行體外實驗中證實了此病毒的存在。 1964，Temin提出前病毒假說。提出前病毒假說。 1970， Temin, Baltimore等發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。等發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。 1975， Temin, Baltimore獲得諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎。獲得諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎。 二、分類二、分類 逆轉(zhuǎn)錄病毒科逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)，正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科(Orthoretrovirinae)，7個屬。個屬。 正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科(Orthoretrovirinae) 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Alpharetrovirus) 逆

4、轉(zhuǎn)錄病毒屬逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Betaretrovirus) 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Gammaretrovirus) 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Deltaretrovirus) 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Epsilonretrovirus) 慢病毒屬慢病毒屬(Lentivirus) 代表種代表種: HIV-1(Human immunodeficiency virus 1) 泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒屬泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Spumavirus) 代表種代表種:黑猩猩泡沫病毒黑猩猩泡沫病毒(Chimpanzee foamy virus; CFV) 根據(jù)致病性分為三類根據(jù)致病性分為三類 ： RNA腫瘤病毒亞科腫瘤病

5、毒亞科 爬蟲類：蛇病毒爬蟲類：蛇病毒 禽類：禽類：Rous肉瘤病毒，禽白血病病毒等肉瘤病毒，禽白血病病毒等 哺乳類：鼠肉瘤病毒，鼠白血病毒，鼠乳腺瘤病毒哺乳類：鼠肉瘤病毒，鼠白血病毒，鼠乳腺瘤病毒 豬肉瘤病毒，牛白血病病毒，豬白血病病毒等豬肉瘤病毒，牛白血病病毒，豬白血病病毒等 靈長類：靈長類肉瘤病毒，猴白血病病毒，狒靈長類：靈長類肉瘤病毒，猴白血病病毒，狒C型腫瘤病毒等型腫瘤病毒等 人：人類嗜人：人類嗜T細胞病毒細胞病毒型型,型型,型型 慢病毒亞科慢病毒亞科 人類免疫缺陷病毒人類免疫缺陷病毒，綿羊肺腺瘤病毒，馬傳染性貧血病毒等，綿羊肺腺瘤病毒，馬傳染性貧血病毒等 泡沫病毒亞科泡沫病毒亞科 靈

6、長類、貓、牛、人泡沫病毒等靈長類、貓、牛、人泡沫病毒等三、反轉(zhuǎn)錄病毒的共同特性三、反轉(zhuǎn)錄病毒的共同特性 有包膜，球形，直徑有包膜，球形，直徑70-200 nm，有刺突，有刺突 核酸為兩條相同的核酸為兩條相同的 +ssRNA, 6-9kb 核心含反轉(zhuǎn)錄酶核心含反轉(zhuǎn)錄酶 具有具有3個個結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因：gag、pol、env 多個多個調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因 復(fù)制要形成復(fù)制要形成DNA中間體中間體，與宿主細胞染色體整合，與宿主細胞染色體整合成成前病毒前病毒，且可隨細胞分裂而進入子代細胞內(nèi)，且可隨細胞分裂而進入子代細胞內(nèi) 逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)簡圖逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)簡圖 正常的非轉(zhuǎn)化病毒正常的非轉(zhuǎn)化病毒 L

7、TR gag (pro) pol env LTR LTR gag (pro) pol env LTR 長末端重復(fù)序列長末端重復(fù)序列 變異的轉(zhuǎn)化病毒變異的轉(zhuǎn)化病毒 LTR gag (pro) pol env LTR gag (pro) pol env 外膜糖蛋白外膜糖蛋白SUSU和跨膜蛋白和跨膜蛋白TMTM基質(zhì)蛋白，衣殼蛋白，核酸結(jié)合蛋白基質(zhì)蛋白，衣殼蛋白，核酸結(jié)合蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶蛋白酶蛋白酶 病毒癌基因病毒癌基因四、反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制四、反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制以以tRNA為引物合成負鏈為引物合成負鏈DNA降解降解R,U5五、基因組五、基因組DNA的復(fù)制的復(fù)制負鏈DNA的合成位點特異

8、性切刻酶第一次跳躍第一次跳躍RnaseH，DNA聚合酶第二次跳躍，正鏈DNA的合成整合到染色體DNA整合酶等完成轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒基因人？此時的病毒稱為原病毒或前病毒Figure. Retroviral life cycle. 總結(jié)：總結(jié)：經(jīng)歷經(jīng)歷9步反應(yīng)，兩次跳躍步反應(yīng)，兩次跳躍（1）tRNA引物結(jié)合在5 端PB（paired base)位點，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成與U5(unique to the 5 end) 和R（direct repeat）區(qū)互補DNA的U 5 和R ；（2）由逆轉(zhuǎn)錄酶將模板RNA的U5和R區(qū)水解；（3）新合成的-DNA鏈的R 與RNA3端的R配對，逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)換為以RNA3

9、端為模板，實現(xiàn)第一次跳躍；（4）負鏈DNA延伸；（5）模板RNA的U3 （unique to the 3end）、R區(qū)和polAn被水解，其5 端也被水解；（6）以RNA的3端為引物合成正鏈DNA的U3-R-U5；（7）引物tRNA被水解；（8） 正、負鏈DNA在PB位點處配對，逆轉(zhuǎn)錄酶以新合成的負鏈DNA為模板合成和延伸正鏈DNA，第二次跳躍；（9）負鏈DNA U3-R-U5 與正鏈DNA U3-R-U5 解開，負鏈DNA 重復(fù)合成U3-R-U5 ，形成兩端長末端重復(fù)序列（LTR）反轉(zhuǎn)錄酶的功能 以以RNA為模板合成為模板合成cDNA； 以以DNA為模板合成為模板合成DNA； RNaseH活

10、性；活性； 位點特異性切刻酶。位點特異性切刻酶。 引物從何而來？引物從何而來？ tRNA: 自帶自帶 病毒基因組病毒基因組RNA的的3末端（在特定位點切刻）末端（在特定位點切刻） 六、六、 整合（目前尚不清楚）整合（目前尚不清楚） 線形dsDNA進入細胞核，兩端的LTR相連成環(huán)形分子，連接處反向重復(fù)序列相鄰； 病毒DNA與細胞DNA均出現(xiàn)參差斷裂； 在整合酶作用下，病毒DNA與細胞DNA連接，缺口填充，整合完成。 特點： 整合到細胞DNA中的病毒DNA與線形DNA比，兩端總會少2 bp，其余完全相同； 病毒DNA與細胞基因組DNA相連的兩端序列都是5 TGCA 3 靶點的選擇是隨機的；七、原病

11、毒的基因表達 原病毒DNA在宿主細胞核內(nèi)，以宿主轉(zhuǎn)錄機器進行轉(zhuǎn)錄，RNA出細胞核，部分RNA作為基因組RNA，部分RNA作為模板進行翻譯； 病毒LTR序列不僅提供了整合必須的末端，而且提供了轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工的信號；如U 3 里有強啟動子，有TATA和CCAAT序列；遠端還有增強子 翻譯后的初始蛋白以多蛋白形式，經(jīng)過酶切產(chǎn)生相關(guān)蛋白和酶。 LTR gag (pro) pol env LTR LTR gag (pro) pol env LTR 外膜糖蛋白外膜糖蛋白SUSU和跨膜蛋白和跨膜蛋白TMTM基質(zhì)蛋白，衣殼蛋白，核酸結(jié)合蛋白基質(zhì)蛋白，衣殼蛋白，核酸結(jié)合蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶蛋白

12、酶蛋白酶 90% gag 多蛋白經(jīng)酶切成為病毒衣殼蛋白、基質(zhì)蛋白、核酸結(jié)合蛋白多蛋白經(jīng)酶切成為病毒衣殼蛋白、基質(zhì)蛋白、核酸結(jié)合蛋白10% gag-pro-pol 多蛋白經(jīng)酶切成為蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶Env前體多蛋白經(jīng)酶切成為病毒外膜蛋白蛋白小結(jié)小結(jié) 概念：概念：反轉(zhuǎn)錄病毒、前病毒反轉(zhuǎn)錄病毒、前病毒 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組特點反轉(zhuǎn)錄病毒基因組特點 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組反轉(zhuǎn)錄病毒基因組DNA的復(fù)制過程的復(fù)制過程 反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的特點反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的特點5 防治防治 （1）疫苗：）疫苗： （2）藥物：雞尾酒療法）藥物：雞尾酒療法 二脫氧氟硫代胞嘧啶二脫氧氟硫代胞嘧啶、拉夫米定拉夫米定和和阿地福韋阿地福韋的

13、藥物組的藥物組合物合物 。 拉米夫定最早研究時治療拉米夫定最早研究時治療HIV，但報道了，但報道了HIV合并合并HBV感染的患者出現(xiàn)感染的患者出現(xiàn)HBV亦被抑制的情況。亦被抑制的情況。 拉米夫定的這種選擇性可能是由于它主要通過與涉及拉米夫定的這種選擇性可能是由于它主要通過與涉及病毒編碼的依賴病毒編碼的依賴RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶）的相）的相互作用起效有關(guān)。而逆轉(zhuǎn)錄酶是互作用起效有關(guān)。而逆轉(zhuǎn)錄酶是HBV和和HIV復(fù)制所必復(fù)制所必需的。需的。 拉米夫定對艾滋病病毒是有確切療效的拉米夫定對艾滋病病毒是有確切療效的，也是聯(lián)合國，也是聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署、世界衛(wèi)生組織、中國衛(wèi)生部指

14、定的幾艾滋病規(guī)劃署、世界衛(wèi)生組織、中國衛(wèi)生部指定的幾個防治艾滋病藥物之一。個防治艾滋病藥物之一。3 病毒及其基因組病毒及其基因組特點：特點： +RNA無無mRNA活性活性 侵染宿主細胞時，逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、引物、基因組侵染宿主細胞時，逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、引物、基因組RNA都進入都進入 多數(shù)反轉(zhuǎn)錄病毒不裂解宿主細胞，但多數(shù)反轉(zhuǎn)錄病毒不裂解宿主細胞，但HIV例外例外 基因組整合到宿主基因組中基因組整合到宿主基因組中 2 HIV病毒基因組病毒基因組 屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒屬病毒。由兩條單股正鏈RNA病毒，每條RNA基因組約為9.2 kb。在RNA 5端有一帽子結(jié)構(gòu)，3有poly A尾巴。（1）結(jié)構(gòu)基

15、因： HIV基因組中有三個編碼結(jié)構(gòu)蛋白和酶的多蛋白基因，分別是gag、pol、env，其中g(shù)ag和pol使用不同的讀碼框。 gag 基因約1.5 kb, 編碼核心蛋白，其產(chǎn)物與病毒基因組RNA共同組裝成核心和衣殼。這些核心蛋白包括p17， p24，p7，p6。 pol基因約3.0 kb, 編碼病毒復(fù)制所需要的各種酶類，與gag 基因重疊，表達時是一蛋白前體p160，在蛋白酶催化下，除形成p17、 p24、p15 和Gag 蛋白外，還有蛋白酶p10， 反轉(zhuǎn)錄酶p66/p51，整合酶p32。 env 基因約2.6 kb，編碼病毒包膜糖蛋白，先翻譯成前體蛋白gp160，被宿主細胞蛋白酶裂解為 gp1

16、20和gp41。 （2）調(diào)節(jié)蛋白基因和輔助蛋白基因 兩個編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因Tat, Rev 四個輔助蛋白基因 Vpr, Vpu, Nef, Vif，均參與HIV復(fù)制。 （3）長末端重復(fù)序列 HIV基因組RNA兩側(cè)有長末端重復(fù)序列（LTR），是順式作用元件區(qū)域，如啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、調(diào)節(jié)蛋白Tat的效應(yīng)元件。正常結(jié)腸粘膜正常結(jié)腸粘膜高增殖結(jié)腸上皮高增殖結(jié)腸上皮腺瘤腺瘤轉(zhuǎn)移癌轉(zhuǎn)移癌APCAPC缺失缺失DNADNA去甲基化去甲基化k-rask-ras點突變點突變DCCDCC缺失或點突變?nèi)笔Щ螯c突變P53P53缺失或點突變?nèi)笔Щ螯c突變對結(jié)腸癌的研究對結(jié)腸癌的研究早早中中晚晚Colorec

17、tal cancer (adenomatous polyposis)Normal cellHyper-proliferative cellEarly adenomaInter-mediate adenomaLate adenomaAdeno-carcinomaGeneAlterationChromosome5qlossAPC12qActivationK-RAS17plossp5318qlossDCCDNA hypo-methylation1. Promoter insertion and enhancer insertion (insertion of a retrovirus in the

18、vicinity of the gene)控制元件插入控制元件插入Controling element insertion C B LTR Cellular proto-oncogene host DNA transcription LTR LTR transcription transcription Cellular proto-oncogene host DNA Enhancer effect Figure. Regulation of Rb and E2F activities in late G1. Interaction of E2Fs with nonphosphorylated

19、 Rb protein initially inhibits E2F activity. When signaling from mitogens is sustained, the resulting initiate the phosphorylation of Rb, converting some E2F to the active form, which activate target genes whose products are essential for S phase. Figure. Different domains are responsible for each of the activities of p53. Figure 24-17. Regulation of Src activity and its activation by an oncogenic mutation. (a) Domain structure of c-Src and v-Src. (b) Effect of phosphorylation on c-Src conformation.