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致病菌細(xì)胞的近紅外光譜鑒別方法研究 食品與生物工程學(xué)院 榮宗有 指導(dǎo)教師 劉建學(xué) 摘　要 致病菌,即能夠?qū)е氯祟惣膊』蛭：θ祟惤】档募?xì)菌。致病菌污染食品可導(dǎo)致食物中毒與食源性感染，是食品安全的重大隱患。近紅外光譜技術(shù)(NIRS)是一種高效快速的現(xiàn)代分析技術(shù),是近年來發(fā)展最快的檢測(cè)技術(shù)之一，具有無損、快速、高效、方便和環(huán)保的特點(diǎn)。 本文以沙門氏菌和單增李斯特菌為代表，采用平板劃線法對(duì)沙門氏菌和單增李斯特菌的分離培養(yǎng)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，用亞硫酸鉍瓊脂（BS）培養(yǎng)基、改良的MC Bride瓊脂（MMA）培養(yǎng)基可將沙門氏菌、單增李斯特菌從雜菌中很好的分離開來；用光電比濁法，對(duì)沙門氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行研究。通過比較沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線圖，研究其生長(zhǎng)趨勢(shì)，確定了沙門氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最后選定16h為沙門氏菌的培養(yǎng)時(shí)間；以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的沙門氏菌、單增李斯特菌等致病菌為研究對(duì)象，考察近紅外光對(duì)致病菌細(xì)胞的作用，根據(jù)不同濃度梯度的沙門氏菌、單增李斯特菌的全細(xì)胞、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜圖譜，利用基于主成分分析技術(shù)（PCA）的投影判別分析，研究?jī)煞N菌的近紅外光譜鑒別方法。結(jié)果表明，不論是利用全細(xì)胞、細(xì)胞壁還是細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜分析，都可以將大腸桿菌和單增李斯特菌區(qū)分開來。 關(guān) 鍵 詞：近紅外光譜，沙門氏菌，單增李斯特菌，主成分投影分析，鑒別方法  RESEARCH ON THE NEAR-INFRARED SPECTROSCOPY DISTINCTION METHOD OF PATHOGENIC BACTERIA CELLS Food and Bioengineering College Rong Zongyou Tutor Liu Jianxue ABSTRACT The pathogenic bacteria，which can cause the human illness to get sick or harm to human health of bacteria. Pathogenic bacteria contaminated food can cause food poisoning and food-borne infection，which is the significant hidden danger of food security. The near-infrared spectroscopy (NIRS)is one of the fastest growing testing technology，which take on the characteristic of nondestructive, fast, efficient, convenient and environmentally friendly. In this paper, we take the Salmonella and Listeria monocytogenes as the representative, using the methods of Plate crossed separation research the isolation and culture of Salmonella and L.monocytogenes. The results showed that，Salmonella and L.monocytogenes can be easily identified from Mixed bacteria With bismuth sulfite agar (BS) medium, modified MC Bride agar (MMA) medium. Taking the use of photoelectric turbidimetry, the logarithmic growth phase of Salmonella was researched. In this study, the growth curves of Salmonella were compared to their growth chart, from which we can see the growth trend of Salmonella. The logarithmic growth phase of Salmonella can be determinated. At last, 16h was selected to the Salmonella culture time. We take the logarithmic growth of Salmonella, Listeria monocytogenes pathogenic microorganisms for object of study, Inspects the near-infrared light function to the pathogenesis bacterial cell. A study about the near-infrared on the distinction method and the examination limit of both pathogenic bacteria cells had been carried out, using the projection discriminant analysis which is based on the principal component analysis (PCA). According to the different concentration gradient of near infrared spectra of the Salmonella and L.monocytogenes Whole-cell、cell wall and cytoplasmic, the Salmonella and L.monocytogenes can be distinguished. KEY WORDS：Near-Infrared spectroscopy，Salmonella， L.monocytogenes，PCA，Identification method 目 錄 前 言 1 第1章 文獻(xiàn)綜述 2 1.1 沙門氏菌的概論 2 1.1.1 沙門氏菌的病原學(xué)特性 2 1.1.2 沙門氏菌的發(fā)病機(jī)理 2 1.1.3 沙門氏菌的臨床癥狀 3 1.2 單增李斯特菌的簡(jiǎn)介 3 1.3 有害致病菌檢測(cè)技術(shù)的概述 3 1.3.1 色譜技術(shù) 4 1.3.2 化學(xué)比色法 4 1.3.3 近紅外光譜檢測(cè)技術(shù) 4 1.4 近紅外光譜概論 5 1.4.1 近紅外光譜分析技術(shù)的原理 5 1.4.2 近紅外光譜分析技術(shù)的特點(diǎn) 6 1.4.3 近紅外光譜分析技術(shù)的應(yīng)用 7 第2章 材料與方法 8 2.1 試驗(yàn)材料 8 2.1.1 菌種 8 2.1.2 試劑 8 2.1.3 培養(yǎng)基 8 2.1.4 試驗(yàn)儀器 9 2.2 試驗(yàn)方法 10 2.2.1 沙門氏菌的分離培養(yǎng) 10 2.2.2 單增李斯特菌的分離培養(yǎng) 11 2.2.3 沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 11 2.2.4 沙門氏菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的制備 12 2.2.5 單增李斯特菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的制備 13 2.2.6 沙門氏菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜采集 13 2.2.7 單增李斯特菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜采集 14 第3章 結(jié)果與分析 15 3.1 沙門氏菌的分離培養(yǎng)結(jié)果 15 3.2 單增李斯特菌的分離培養(yǎng)結(jié)果 15 3.3 沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線 15 3.3.1 比濁法測(cè)定的吸光度 15 3.3.2 生長(zhǎng)曲線的繪制 16 3.4 沙門氏菌、單增李斯特菌的鑒別方法研究 17 3.4.1 沙門氏菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜圖 17 3.4.2 單增李斯特菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜圖 18 3.4.3 沙門氏菌、單增李斯特菌全細(xì)胞的鑒別分析 19 3.4.4 沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞壁的鑒別分析 20 3.4.5 沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞質(zhì)的鑒別分析 21 第4章 結(jié) 論 23 4.1 總結(jié) 23 4.2 展望 23 參考文獻(xiàn) 25 致　謝 27 前 言 沙門氏菌(Salmonella)是一種人畜共患和食源性疾病的致病菌。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。自19世紀(jì)后期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來，檢測(cè)方法都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7天才能完成。 單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)也是一種人畜共患病的病原菌。感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。單增李斯特菌在各年齡段人群中均可發(fā)病，尤其免疫機(jī)能低下者和新生兒、孕婦、老年人等，病死率高達(dá)20%～30%。應(yīng)用常規(guī)方法檢驗(yàn)耗時(shí)費(fèi)力，程序復(fù)雜。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)，也需要24小時(shí)才能完成檢測(cè)過程，仍然滿足不了實(shí)時(shí)檢測(cè)的需要。 進(jìn)入90年代，近紅外分析技術(shù)逐步受到分析化學(xué)家的重視，應(yīng)用逐步擴(kuò)展到石油化工、醫(yī)藥、生物化學(xué)、煙草、紡織品等領(lǐng)域,現(xiàn)已發(fā)展成為一種獨(dú)立的分析技術(shù)活躍在光譜分析領(lǐng)域。傅立葉變換近紅外光譜(FTNIR)分辨率高，不僅能提供分子基團(tuán)特征的振動(dòng)吸收譜帶，而且能敏銳地探測(cè)分子基團(tuán)及周圍環(huán)境的變化。細(xì)胞的近紅外光譜能夠反映核酸、蛋白質(zhì)、糖蛋白和生物膜等分子在細(xì)胞內(nèi)的含量、構(gòu)型、構(gòu)象及其所發(fā)生的變化。通過建立其近紅外光吸收模型，找到食品中對(duì)數(shù)期的沙門氏菌、單增李斯特菌的近紅外特征吸收光譜，使得不同致病菌能夠區(qū)分開來。 因此，通過不同濃度梯度的沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞的紅外光譜來獲得沙門氏菌、單增李斯特菌的近紅外光譜信息，繼而研究沙門氏菌、單增李斯特菌的近紅外光譜的鑒別方法，將有可能對(duì)有害微生物的鑒別測(cè)定提供一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，具有較好的應(yīng)用前景。此外，近紅外光譜分析技術(shù)在微生物學(xué)方面的應(yīng)用，又可能為人類疾病的早期診斷提供科學(xué)依據(jù)。研究近紅外光譜分析技術(shù)來檢測(cè)食品中常見的致病菌，具有極大的經(jīng)濟(jì)和和社會(huì)效益。 第1章 文獻(xiàn)綜述 1.1 沙門氏菌的概論 沙門氏菌屬（Sallmonall）是一群形態(tài)和培養(yǎng)特性都類似的腸桿菌科中的一個(gè)大屬，它包括2000多個(gè)血清型。病原學(xué)認(rèn)為，沙門氏菌是一種人畜共患和食源性疾病的致病菌[1]。世界各地的食物中毒中，英國、中國沙門氏菌食物中毒居首位，美國居第二位。食源性致病菌作為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題是影響食品安全的主要原因之一，它嚴(yán)重危害著人們的生命健康從而造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。因此，對(duì)致病性細(xì)菌的快速檢測(cè)一直是相關(guān)研究的熱點(diǎn)。 1.1.1 沙門氏菌的病原學(xué)特性 1、形態(tài)與染色 沙門氏菌為革蘭氏陰性，較為細(xì)長(zhǎng)的桿菌，大小為（1～3μm）（0.4～0.9μm），不產(chǎn)生芽孢，一般無莢膜，但在黏液樣變異時(shí)，可見菌體黏液層增厚。 2、培養(yǎng)特性 沙門氏菌為需氧或兼性厭氧菌。生長(zhǎng)溫度為10～42℃，最適溫度為37℃。適宜pH為6.8～7.8。對(duì)營養(yǎng)要求不高，一般在普通培養(yǎng)基上均能良好生長(zhǎng)。在培養(yǎng)集中若加入硫代硫酸鈉、胱氨酸、血清、葡萄糖、淀粉、腦心浸液、膠體硫或甘油等，均有助于本菌的生長(zhǎng)。 普通瓊脂培養(yǎng)基：培養(yǎng)24小時(shí)后，形成中等大小、圓形或近似圓形、表面光滑、無色半透明、邊緣整齊的菌落。 普通肉湯培養(yǎng)基：生長(zhǎng)良好，均等渾濁。 3、抗原構(gòu)造 沙門氏菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，一般可分為4種，即菌體抗原，又稱為O抗原；鞭毛抗原，又稱為H抗原；表面抗原，又稱為K抗原；以及菌毛抗原。 4、抵抗力 沙門氏菌對(duì)熱及外界環(huán)境的抵抗力屬于中等，60℃作用20～30min即被殺死[3]。 1.1.2 沙門氏菌的發(fā)病機(jī)理 沙門氏菌引起食物中毒時(shí)，需要感染大量病菌才能致病。沙門氏菌隨食物進(jìn)入消化道以后，在小腸和結(jié)腸里繁殖，附著于腸黏膜上皮并侵入粘膜下組織，使腸黏膜發(fā)炎，從而抑制了腸黏膜對(duì)水和電解質(zhì)的吸收，并引起水腫、出血等。隨后在通過腸黏膜上皮細(xì)胞之間侵入粘膜固有層，在固有層內(nèi)引起炎癥。未被吞噬細(xì)胞殺滅的沙門氏菌，經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液，而出現(xiàn)一時(shí)性菌血癥，引起全身感染。同時(shí)活菌在腸道或血液內(nèi)崩解出毒力較強(qiáng)的大量的菌體內(nèi)毒素，而引起全身中毒癥狀。 1.1.3 沙門氏菌的臨床癥狀 沙門氏菌食物中毒的臨床癥狀是由活菌和內(nèi)毒素的協(xié)同作用引起的，以急性胃腸炎型為最多，潛伏期一般12～24h，有時(shí)可短至6～8h或長(zhǎng)至2d，開始時(shí)癥狀為頭痛、全身乏力、發(fā)冷和惡心等，以后出現(xiàn)嘔吐、腹痛和全身酸痛。病人發(fā)熱大都在39～40℃，重病人出現(xiàn)寒戰(zhàn)、抽搐和昏迷等。病程3～7d，一般愈后良好。但老人、兒童和體弱者，如不及時(shí)進(jìn)行急救處理，也可導(dǎo)致死亡，死亡率約為1%左右[4]。 1.2 單增李斯特菌的簡(jiǎn)介 單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種人畜共患病的病原菌。本菌為兼性厭氧革蘭氏陽性小桿菌，營養(yǎng)要求不高，無芽孢，耐堿不耐酸，對(duì)環(huán)境抵抗力較強(qiáng)。它廣泛存在于自然界中，在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。 單增李斯特菌屬細(xì)胞內(nèi)寄生菌，不產(chǎn)內(nèi)毒素，可產(chǎn)生一種溶血性的外毒素。T細(xì)胞在清除本菌中起重要作用，細(xì)胞免疫功能低下和使用免疫抑制劑者較易感染，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。單增李斯特菌在各年齡段人群中均可發(fā)病，尤其免疫機(jī)能低下者和新生兒、孕婦、老年人等，病死率高達(dá)20%～30%。 1.3 有害致病菌檢測(cè)技術(shù)的概述 “民以食為天”，隨著人們生活水平的提高，食品安全問題日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年腹瀉病例15億，造成300多萬兒童死亡，其中70%是由于各種致病性微生物污染的食品和飲水所致。為此，食品檢驗(yàn)日益顯的重要，而微生物檢驗(yàn)又是食品檢驗(yàn)的一個(gè)重要內(nèi)容。如何快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)被稱為“頭號(hào)殺手”的食品中致病菌，是確保食品安全的首要任務(wù)。但是傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)方法，包括反復(fù)增菌、菌落分離及多種生化和血清學(xué)鑒別實(shí)驗(yàn)，不僅步驟復(fù)雜，而且耗時(shí)費(fèi)力，難以適應(yīng)飛速發(fā)展的現(xiàn)代食品生產(chǎn)和流通領(lǐng)域。因此為了確保食品的安全性，開發(fā)快速檢測(cè)食品有害微生物的方法非常重要。目前，人們?cè)谖⑸锟焖凫`敏檢測(cè)技術(shù)上投入了大量的精力，主要有色譜技術(shù)、化學(xué)比色法、阻抗技術(shù)、免疫分析技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)和生物學(xué)發(fā)光檢測(cè)法。此外，一種新型的檢測(cè)方法即近紅外光譜檢測(cè)技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生。 1.3.1 色譜技術(shù) 色譜技術(shù)的原理是將微生物細(xì)胞經(jīng)過水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后，使之分離盡可能多的化學(xué)組分供氣相色譜儀進(jìn)行分析。不同的微生物所得到的色譜圖中，通常大多數(shù)的峰是共性的，只有少數(shù)的峰具有特征性，可被用來進(jìn)行微生物鑒定，分析檢測(cè)各種常見細(xì)菌、酵母菌、霉菌等。湯丹劍用全細(xì)胞水介皂化及甲醋法的方法，通過氣相色譜儀檢測(cè)了幾株食品微生物細(xì)胞長(zhǎng)鏈脂肪酸構(gòu)成。結(jié)果表明在食品微生物領(lǐng)域中，利用細(xì)胞脂肪酸差異性進(jìn)行菌種的快速鑒別是可行的，其鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)鑒別的結(jié)果相符。Newark微生物鑒定系統(tǒng)[5]就是用氣相色譜法檢測(cè)一種飽和脂肪酸(微生物代謝物)的含量，達(dá)到鑒定微生物的目的。 1.3.2 化學(xué)比色法 常用的化學(xué)比色法包括各種檢測(cè)試劑和試紙，兩者都是利用迅速產(chǎn)生明顯顏色的化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)，可通過與標(biāo)準(zhǔn)比色卡比較進(jìn)行目視定性或半定量分析，隨著檢測(cè)儀器的不斷發(fā)展，與其相配套的微型檢測(cè)儀器也相應(yīng)出現(xiàn)。在微生物檢測(cè)方面，美國3M公司的petrifilm TM Plate系列微生物測(cè)試片，可分別檢測(cè)菌落總數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)[6]。 1.3.3 近紅外光譜檢測(cè)技術(shù) 近紅外光譜技術(shù)（NIRS）以未損傷細(xì)胞的近紅外光譜的特殊指紋區(qū)為基礎(chǔ)，光譜反映的是整個(gè)細(xì)胞組成分子的振動(dòng)特征，也就是蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的特征，因此可以區(qū)分生化信息上的差別[7]。紅外光譜法（FTIRS）早在20世紀(jì)50年代起就開始運(yùn)用于區(qū)分不同的微生物[8]。1991年，Naumann等在Nature雜志中驗(yàn)證了FTIR具有判別、分類和鑒別微生物的能力[9]，這篇論文及其后續(xù)的相關(guān)文章成為紅外光譜法在微生物研究領(lǐng)域的經(jīng)典參考文獻(xiàn)。Curk等用中紅外進(jìn)行了酵母菌的分類鑒別研究；Helm等對(duì)某些細(xì)菌的細(xì)胞組成用紅外光譜方法進(jìn)行了鑒別等[10]。研究表明，這些微生物大分子不僅在中紅外譜區(qū)有吸收，在近紅外譜區(qū)也有吸收。Janie Dubois等人利用細(xì)菌細(xì)胞在不同波長(zhǎng)范圍(1000 -2350nm)的近紅外吸收[11],通過近紅外光譜技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了分類鑒定,從而揭開了近紅外光譜技術(shù)在微觀世界應(yīng)用的序幕。 此外，還有PCR技術(shù)、生物技術(shù)、基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、生物學(xué)發(fā)光檢測(cè)法等。 1.4 近紅外光譜概論 近紅外譜技術(shù)（NIR）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種高效快速的現(xiàn)代分析技術(shù)，在分析化學(xué)領(lǐng)域里被譽(yù)為分析“巨人”，它綜合運(yùn)用了計(jì)算機(jī)技術(shù)、光譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)等多個(gè)學(xué)科的最新研究成果，以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在多個(gè)領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。并已逐漸得到大眾的普遍接受和官方的認(rèn)可。 近紅外區(qū)域按美國材料檢測(cè)學(xué)會(huì)（ASTM）定義是指波長(zhǎng)在780~2526nm、波數(shù)為12820~3959cm-1范圍內(nèi)的電磁波[12]。習(xí)慣上人們將近紅外區(qū)劃分為近紅外短波（780~1100nm）和近紅外長(zhǎng)波（1100~2526nm）兩個(gè)區(qū)域。近紅外光譜主要是含氫基團(tuán)C-H、O-H、N-H、S-H、P-H等振動(dòng)的倍頻和合頻吸收的綜合表現(xiàn)[13]。不同的物質(zhì)含有不同的基團(tuán)，而不同基團(tuán)或同一集團(tuán)在不同化學(xué)環(huán)境中的近紅外吸收波長(zhǎng)與強(qiáng)度都有明顯差別，所以近紅外光譜具有豐富的結(jié)構(gòu)和組成信息，可以作為獲取信息的一種有效載體，非常適合用于碳?xì)溆袡C(jī)物質(zhì)的組成性質(zhì)測(cè)量。有機(jī)物分子對(duì)近紅外光譜的各個(gè)波長(zhǎng)的不同吸收率在光譜上表現(xiàn)出波峰和波谷，因此，近紅外光譜主要用于有機(jī)物定性鑒定和定量分析[14]。 1.4.1 近紅外光譜分析技術(shù)的原理 1、化學(xué)計(jì)量學(xué) 盡管近紅外光譜理論上非常適合用于碳?xì)溆袡C(jī)物質(zhì)的組成性質(zhì)測(cè)量，但是在該區(qū)域內(nèi)，含氫基團(tuán)化學(xué)鍵振動(dòng)的倍頻與合頻吸收強(qiáng)度很弱，靈敏度相對(duì)較低，吸收帶較寬且重疊嚴(yán)重，因此，傳統(tǒng)的定量分析比較復(fù)雜且困難?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展為這一復(fù)雜問題的解決奠定了數(shù)學(xué)基礎(chǔ)?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)（Chemometrics）綜合使用數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)學(xué)等方法，是一門從化學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)中提取信息的新興的交叉學(xué)科。大量化學(xué)計(jì)量學(xué)方法被寫成軟件，并成為近紅外光譜儀的重要組成部分[15]。 2、工作原理 近紅外光譜分析技術(shù)是利用被測(cè)物質(zhì)在其近紅外光譜區(qū)內(nèi)的光學(xué)特性快色估測(cè)一項(xiàng)或多項(xiàng)化學(xué)成分含量[16,17]。被測(cè)樣品的光譜特征是多種組分的反射光譜的綜合表現(xiàn)，各組分含量的測(cè)定基于各組分最佳波長(zhǎng)的選擇，按照回歸方程自動(dòng)測(cè)定結(jié)果： 組分含量=C0+C1(Dp)1+C2(Dp)2+…+Ck(Dp)k （公式1-1） 式中：C0~k為多元線性回歸系數(shù)；(Dp)1~k為各組分最佳波長(zhǎng)的反射光密度值(D=﹣lgp，p為反射比)。該方程準(zhǔn)確的反映了定標(biāo)范圍內(nèi)一系列樣品的測(cè)定結(jié)果，與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)測(cè)定法之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差SE為： SE=[∑(y-x)2/(n-1)]1/2 （公式1-2） 式中：x表示實(shí)驗(yàn)室饞鬼法測(cè)定值，y表示近紅外光譜法測(cè)值，n為樣品數(shù)。 1.4.2 近紅外光譜分析技術(shù)的特點(diǎn) 1、分析速度快 NIR技術(shù)檢測(cè)過程比較快速，可在很短時(shí)間內(nèi)獲得一個(gè)樣品的全光譜圖，光譜的測(cè)量過程一般可在1min內(nèi)完成。 2、多組分同時(shí)測(cè)定 通過一次全光譜掃描，就可以得到樣品中各種化學(xué)成分的光譜信息，再通過相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型來計(jì)算，即可獲得樣品多種化學(xué)成分的含量。 3、簡(jiǎn)化分析過程 運(yùn)用近紅外光譜分析技術(shù)不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，是因?yàn)榻t外區(qū)內(nèi)光散色效應(yīng)大，且穿透深度大，使得近紅外光譜技術(shù)可以用漫反射技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行直接測(cè)定。因此使得分析過程變得尤其簡(jiǎn)單，大大減少勞動(dòng)強(qiáng)度。 4、儀器自動(dòng)化程度高 對(duì)操作人員的要求低，儀器可以根據(jù)操作人員的要求任意設(shè)置工作流程。 5、遠(yuǎn)距離測(cè)定和實(shí)時(shí)分析 近紅外光在光纖中有良好的傳輸性能，因此近紅外光譜分析技術(shù)具有遠(yuǎn)距離采集樣品光譜和實(shí)時(shí)分析的能力，特別適用于在線分析。利用光導(dǎo)纖維技術(shù)遠(yuǎn)離主機(jī)取樣，將光譜信號(hào)實(shí)時(shí)傳送回主機(jī)，可直接計(jì)算出樣品成分的即時(shí)含量或確定樣品的性質(zhì)。 6、測(cè)試重現(xiàn)性好 光譜的測(cè)定具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，其測(cè)試受人為干擾因素較小。與常規(guī)的化學(xué)方法或參考標(biāo)準(zhǔn)相比，近紅外光譜分析一般可顯示出更好的重現(xiàn)性和精確性。 7、典型的無損分析技術(shù) 近紅外光譜分析技術(shù)只是采集樣品的光譜信息，不消耗樣品，操作過程中不添加任何其它化學(xué)試劑，從外觀到內(nèi)在都不會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生影響。 8、分析成本低 采用近紅外光譜分析技術(shù)時(shí)，無需添加其他化學(xué)試劑，分析過程中不消耗樣品，自身消耗一點(diǎn)電外幾乎無其他消耗，與常用的標(biāo)準(zhǔn)或參考方法相比，測(cè)試費(fèi)用可大幅度降低[18,22]。 9、近紅外光譜分析也有其固有的弱點(diǎn) 測(cè)試的靈敏度相對(duì)中紅外較低，主要是因?yàn)榻t外光譜作為分子振動(dòng)的非諧振吸收躍遷幾率較低，一般近紅外倍頻和合頻的譜帶強(qiáng)度時(shí)其基頻吸收的10到10000分之一，就對(duì)組分的分析而言，其含量一般應(yīng)大于0.1%。 1.4.3 近紅外光譜分析技術(shù)的應(yīng)用 近紅外光譜分析技術(shù)諸多優(yōu)點(diǎn)決定了它應(yīng)用領(lǐng)域的廣闊。在食品行業(yè)方面，近紅外光譜技術(shù)可用于食品的品質(zhì)分析，如研究農(nóng)產(chǎn)品的新鮮度、檢測(cè)水果堅(jiān)實(shí)度和品質(zhì)、檢測(cè)水果糖度和酸度、控制烤制品的質(zhì)量、檢測(cè)酒類發(fā)酵過程中酒精及糖分含量變化、預(yù)測(cè)不同肉類特性、測(cè)定乳制品中營養(yǎng)成分、辨別食用油的真?zhèn)蔚鹊萚23-26]。在林業(yè)方面，其應(yīng)用更有著常規(guī)方法無法比擬的優(yōu)越性，如無損檢測(cè)木材密度和性質(zhì)、木材品質(zhì)育種和種質(zhì)資源鑒定、林業(yè)種子質(zhì)量的檢測(cè)、森林掉落物分解檢測(cè)[27,28]。在農(nóng)業(yè)方面，可應(yīng)用于作物的品質(zhì)分析和評(píng)價(jià)、用于作物品種資源鑒定和品質(zhì)育種、用于作物抗性指標(biāo)分析[29,30]。在藥學(xué)研究領(lǐng)域，可對(duì)藥物原料的晶粒大小、晶型、潔凈度、表觀密度和旋光性等進(jìn)行全面的分析，可對(duì)藥物制劑進(jìn)行分析，也可進(jìn)行藥物的在線監(jiān)測(cè)控制[31]。在煙草行業(yè)，主要是應(yīng)用于對(duì)煙草化學(xué)成分的檢測(cè)、煙氣分析、煙葉類型或產(chǎn)地判別、卷煙配方識(shí)別、卷煙真?zhèn)舞b別、卷煙材料分析、煙葉物理指標(biāo)測(cè)定等方面。在其它領(lǐng)域如石油化工、高分子化工和基本有機(jī)化工、紡織工業(yè)等也都有近紅外光譜技術(shù)的廣泛應(yīng)用。近紅外光譜技術(shù)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用也有了新的發(fā)展，目前大部分的研究對(duì)象為細(xì)菌和酵母菌，少數(shù)為真菌和藻類。 第2章 材料與方法 2.1 試驗(yàn)材料 2.1.1 菌種 沙門氏菌、單增李斯特菌 （洛陽市疾病防治與控制中心） 2.1.2 試劑 表2-1 主要試劑及生產(chǎn)商 Table2-1 The main reagent and manufactures 試劑名稱 生產(chǎn)商 牛肉膏 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 蛋白胨 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠 瓊脂 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 氯化鈉 天津市津沽工商實(shí)業(yè)公司 氫氧化鈉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 胰胨 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 多價(jià)胨 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 酵母膏 天津市津沽工商實(shí)業(yè)公司 葡萄糖 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠 磷酸氫二鉀 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 硫酸亞鐵 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 煌綠 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 檸檬酸鉍銨 天津天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠 亞硫酸鈉 上海化學(xué)試劑總廠 苯乙醇 上海華亭化工廠有限公司 無水甘氨酸 武漢銀河化工有限公司 氯化鋰 成都科龍化工試劑廠 乳糖 成都科龍化工試劑廠 蔗糖 北京西美杰科技有限公司 硫酸亞鐵銨 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心 硫代硫酸鈉 北京西美杰科技有限公司 酚紅 武漢銀河化工有限公司 2.1.3 培養(yǎng)基 1、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g，加入1000mL水溶解，并調(diào)pH7.2～7.4，121℃高壓滅菌15min。 2、養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂18g，加入1000mL水溶解，并調(diào)pH7.2～7.4，121℃高壓滅菌15min。 3、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB～YE） 胰胨17g、多價(jià)胨3g、酵母膏6g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g、蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌15min。 4、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA～YE） 胰胨17g、多價(jià)胨3g、酵母膏6g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌15min。 5、亞硫酸鉍瓊脂（BS）培養(yǎng)基 蛋白胨10g、牛肉膏5g、葡萄糖5g、硫酸亞鐵0.3g、磷酸氫二鈉4g、煌綠0.025g、檸檬酸鉍銨2g、亞硫酸鈉6g、瓊脂20g、蒸餾水1000 mL，并調(diào)pH7.2～7.4，121℃高壓滅菌15min。 6、改良的MC Bride瓊脂（MMA）培養(yǎng)基 胰胨5g、多價(jià)胨5g、牛肉膏3g、葡萄糖1g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀1g、苯乙醇2.5 mL、無水甘氨酸10g、氯化鋰0.5g、瓊脂15g、蒸餾水1000 mL，并調(diào)pH7.2～7.4，121℃高壓滅菌15min。 7、SIM動(dòng)力培養(yǎng)基 胰胨20g、多價(jià)胨6g、硫酸鐵銨0.2g、硫代硫酸鈉0.2g、瓊脂3.5g、蒸餾水1000mL，并調(diào)pH7.2～7.4，121℃高壓滅菌15min。 8、三糖鐵瓊脂（TSI）培養(yǎng)基 蛋白胨20g、牛肉膏5g、乳糖10g、蔗糖10g、葡萄糖1g、氯化鈉5g、硫酸亞鐵銨0.2g、硫代硫酸鈉0.2g、瓊脂12g、酚紅0.025g、蒸餾水1000 mL，并調(diào)pH7.2～7.4，121℃高壓滅菌15min。 2.1.4 試驗(yàn)儀器 表2-2 主要儀器及生產(chǎn)商 Table2-2 The main instruments type and manufactures 儀器名稱 生產(chǎn)商 高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠 超凈工作臺(tái) 蘇州凈化試驗(yàn)設(shè)備有限公司 電子天平 常熟市意歐儀器儀表有限公司 電熱恒溫培養(yǎng)箱 海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海福瑪試驗(yàn)設(shè)備有限公司 低溫冰箱 青島海爾股份有限公司 可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司 全自動(dòng)控溫?fù)u床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠 臺(tái)式高速控溫離心機(jī) 長(zhǎng)沙離心機(jī)儀器有限公司 臺(tái)式低速控溫離心機(jī) 長(zhǎng)沙離心機(jī)儀器有限公司 超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司 VECTOR-33型傅立葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司 2.2 試驗(yàn)方法 2.2.1 沙門氏菌的分離培養(yǎng) 1、沙門氏菌的活化 從冰箱中取出含有雜菌的沙門氏菌試管斜面，在超凈工作臺(tái)，用接種環(huán)取一環(huán)接入營養(yǎng)瓊脂平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。 2、沙門氏菌的分離培養(yǎng) 取出活化后的平板，在超凈工作臺(tái)，挑取幾個(gè)可疑的發(fā)育良好的孤立菌落，劃線接種于亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。 3、沙門氏菌的觀察 培養(yǎng)24h后，從恒溫培養(yǎng)箱中取出平板，觀察沙門氏菌的生長(zhǎng)情況。必要的時(shí)候用放大鏡觀察。 ※注意事項(xiàng)：①實(shí)驗(yàn)中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在60～80℃烘箱中除去滅菌時(shí)的水分。②物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi)冷空氣，其目的是有利于鍋內(nèi)溫度升高，隨后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，加熱結(jié)束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務(wù)必降至零時(shí)打開鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸。③在用任何器皿轉(zhuǎn)接時(shí)，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺(tái)面上，接種時(shí)要在酒精燈火焰旁操作。④培養(yǎng)基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養(yǎng)皿壁上，否則容易污染。⑤接種時(shí)要膽大心細(xì)，動(dòng)作快捷，這是減少污染的關(guān)鍵。⑥接種后，培養(yǎng)皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養(yǎng)箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養(yǎng)基表面，水流擴(kuò)散會(huì)使菌落擴(kuò)散，就很難形成單菌落了。 2.2.2 單增李斯特菌的分離培養(yǎng) 1、單增李斯特菌的活化 從冰箱中取出含有雜菌的單增李斯特菌試管斜面，在超凈工作臺(tái)，用接種環(huán)取一環(huán)接入（TSA～YE）平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。 2、單增李斯特菌的分離培養(yǎng) 取出活化后的平板，在超凈工作臺(tái)，挑取幾個(gè)可疑的發(fā)育良好的孤立菌落，劃線接種于改良的MC Bride瓊脂（MMA）培養(yǎng)基平板，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。 3、單增李斯特菌的觀察 培養(yǎng)24h后，從恒溫培養(yǎng)箱中取出平板，觀察單增李斯特菌的生長(zhǎng)情況。必要的時(shí)候用放大鏡觀察。 2.2.3 沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 1、試驗(yàn)原理 將少量細(xì)菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中的菌量，以含菌量作縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)，繪制的曲線叫生長(zhǎng)曲線。它反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)出的群體生長(zhǎng)規(guī)律。依據(jù)其生長(zhǎng)速率的不同，一般可把生長(zhǎng)曲線分為延緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個(gè)時(shí)期的長(zhǎng)短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線，可了解細(xì)菌的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)意義。 測(cè)定微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和實(shí)驗(yàn)室條件選用。本實(shí)驗(yàn)采用比濁法測(cè)定，由于細(xì)菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測(cè)的OD值與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長(zhǎng)曲線。 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)代謝旺盛，繁殖力、抗不良環(huán)境和噬菌體的能力強(qiáng)，活力最佳，最適合進(jìn)行試驗(yàn)研究。故本試驗(yàn)采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的沙門氏菌進(jìn)行研究。 2、試驗(yàn)步驟 ①、沙門氏菌的活化及分離純化 將沙門氏菌接入營養(yǎng)瓊脂平板中，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出活化后的平板，挑取單個(gè)菌落，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。 ②、沙門氏菌種子液的制備 挑取純化培養(yǎng)后的沙門氏菌單個(gè)菌落，將其接種于裝有50mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃ 210r/min振蕩培養(yǎng)24h。 ③、比濁法測(cè)定沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線 取25支大試管，用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 h。在超凈工作臺(tái)中，用移液槍準(zhǔn)確吸取25mL培養(yǎng)24h后的沙門氏菌種子液，移于裝有500mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的大三角瓶中，快速搖勻。立即分裝于已編號(hào)的25支大試管中，每支試管裝15mL，將分裝后的試管置于搖床上，37℃ 210r/min振蕩培養(yǎng)。 分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 h將編號(hào)為對(duì)應(yīng)時(shí)間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同測(cè)定光密度值。以未接種的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定。按編號(hào)從小到大的順序依次進(jìn)行測(cè)定。 2.2.4 沙門氏菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的制備 按照方法2.2.1進(jìn)行沙門氏菌細(xì)胞的活化和分離純化，由結(jié)果與分析3.3.2中所得結(jié)論選擇16h進(jìn)行沙門氏菌種子液的制備，之后3000r/min離心分離濕菌體，以一定體積無菌水分三次洗滌沉淀部分，充分震蕩搖勻使菌體分散開來，平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為80億/mL。另用移液槍移取1mL菌液于大試管中，加入9mL無菌水，充分振蕩搖勻形成10倍稀釋菌懸液，然后逐級(jí)進(jìn)行19次10倍稀釋，制成一組20個(gè)濃度梯度的沙門氏菌全細(xì)胞懸液，濃度梯度值呈比差為10的等差序列，備用。 用超聲波細(xì)胞粉碎儀破碎沙門氏菌的全細(xì)胞，破碎參數(shù)選為400W、破碎5s、間隔5s、實(shí)際破碎總時(shí)間50min進(jìn)行沙門氏菌細(xì)胞破碎，之后15000r/min離心分離，沉淀部分為細(xì)胞質(zhì)、上清液為細(xì)胞質(zhì)。將細(xì)胞質(zhì)懸液充分震蕩搖勻，用移液槍移取1mL菌液于大試管中，加入9mL無菌水，充分振勻形成10倍稀釋菌懸液，然后逐級(jí)進(jìn)行19次10倍稀釋過程，制成一組濃度梯度的沙門氏菌細(xì)胞質(zhì)懸液，20個(gè)濃度梯度值呈比差為10的等差序列，備用。一組20個(gè)濃度梯度的沙門氏菌細(xì)胞壁懸液的制備同細(xì)胞質(zhì)懸液制備過程。 2.2.5 單增李斯特菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的制備 單增李斯特氏菌樣品的制備：對(duì)單增李斯特氏菌進(jìn)行細(xì)胞的活化和分離純化，選18h進(jìn)行單增李斯特氏菌種子液的制備，之后3000r/min離心分離濕菌體，以一定體積無菌水分三次洗滌沉淀部分，充分震蕩搖勻使菌體分散開來，平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為175億/mL。選擇超聲波破碎參數(shù)為500W、破碎4s、間隔5s、實(shí)際破碎總時(shí)間80min進(jìn)行單增李斯特氏菌細(xì)胞破碎，之后15000r/min離心分離，沉淀部分為細(xì)胞壁、上清液為細(xì)胞質(zhì)。三組10倍稀釋濃度梯度的單增李斯特氏菌細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)懸液的制備同沙門氏菌。 2.2.6 沙門氏菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜采集 1、主成分分析方法介紹 主成分分析（principal component analysis，PCA）是多元統(tǒng)計(jì)中的一種數(shù)據(jù)壓縮技術(shù)，該方法廣泛用于化學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，是化學(xué)計(jì)量學(xué)中的基礎(chǔ)方法[32]。PCA是對(duì)多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理的一種數(shù)據(jù)線性投影方法，它在盡可能保留原有信息的基礎(chǔ)上將高維空間中的樣本映射到較低維的主成分空間中。通過分析原始數(shù)據(jù)的相互關(guān)系，采用坐標(biāo)變換的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交變換，消除數(shù)據(jù)間的相關(guān)關(guān)系，具有分析多變量主次關(guān)系的功能。近紅外光譜帶嚴(yán)重重疊，可造成分析的困難，而PCA在不丟失主要光譜信息的前提下選擇為數(shù)較少的新變量來代替原來較多的變量 ，可有效解決光譜重疊的問題，從而提取所需的化學(xué)信息。 2、試驗(yàn)參數(shù)選擇 ①、分辨率 儀器的分辨率影響近紅外光譜的分析，而且對(duì)不同組分的影響是不同的，對(duì)于光譜重疊嚴(yán)重的部分，提高分辨率有利于光譜的分析，但過高會(huì)大大增加試驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理工作量。有研究表明，當(dāng)分辨率大于4cm-1時(shí)，部分樣品信息損失，較低的分辨率可以保證信噪比，綜上本試驗(yàn)設(shè)分辨率為4cm-1。 ②、掃描次數(shù) 掃描次數(shù)是在一次測(cè)量過程中對(duì)光譜的累加，累加后的光譜除以掃描次數(shù)即為每個(gè)樣本的平均光譜。由于噪音在測(cè)量過程中是隨機(jī)變化的，隨著累加次數(shù)的增加，噪音相互抵消，影響變小，本實(shí)驗(yàn)設(shè)掃描次數(shù)為64 次。 ③、重復(fù)測(cè)定次數(shù) 在測(cè)量過程中，同一樣品的多次測(cè)定，光譜會(huì)出現(xiàn)細(xì)微變化（偶然誤差影響），為了盡可能準(zhǔn)確地取得樣品的光譜信息，一般一個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均光譜值[33]。 3、光譜信息的采集 在相同的試驗(yàn)條件下，采用德國Bruker公司的VECTOR-33型近紅外光譜儀，對(duì)沙門氏菌的各組份進(jìn)行近紅外光譜進(jìn)行透射掃描。為了獲得較好的光譜圖，整個(gè)試驗(yàn)的儀器分辨率、掃描次數(shù)等參數(shù)保持嚴(yán)格一致。設(shè)定儀器分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64次，掃描范圍4000~12000 cm-1，環(huán)境溫度控制在20℃左右，空氣濕度70%左右，數(shù)據(jù)格式為L(zhǎng)og(1/R)，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次，其平均值作為該樣品的光譜數(shù)據(jù)，每張光譜包含2075個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光度值[34]。 2.2.7 單增李斯特菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜采集 單增李斯特菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)光譜信息的采集，條件和方法同沙門氏菌。 第3章 結(jié)果與分析 3.1 沙門氏菌的分離培養(yǎng)結(jié)果 典型的沙門氏菌菌落在亞硫酸鉍（BS）瓊脂上呈褐色，灰色或黑色，有時(shí)帶有金屬光澤。菌落周圍的培養(yǎng)基通常開始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變?yōu)楹谏?，并有所謂的暈環(huán)效應(yīng)。 取出平板看到呈褐色，灰色或黑色，帶有金屬光澤的菌落。并且菌落周圍的培養(yǎng)基開始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變?yōu)榱撕谏?，可以認(rèn)為即是沙門氏菌。接種到營養(yǎng)瓊脂試管斜面上放在冰箱中保存，以備下一步試驗(yàn)用。 3.2 單增李斯特菌的分離培養(yǎng)結(jié)果 取出平板，挑取可疑菌落，用白熾燈45角斜光照射平板，可以看出菌落為灰藍(lán)或藍(lán)色、小的圓形菌落。挑取幾個(gè)發(fā)育良好的孤立菌落接種于三糖鐵（TSI）瓊脂和SIM動(dòng)力培養(yǎng)基，培養(yǎng)于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，觀察到有動(dòng)力，且呈傘狀或月牙狀生長(zhǎng)的菌落。即可以認(rèn)為是單增李斯特菌。接種到（TSA～YE）試管斜面上放在冰箱中保存，以備下一步試驗(yàn)用。 3.3 沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線 3.3.1 比濁法測(cè)定的吸光度 比濁法是用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液中微生物的數(shù)量。由于細(xì)菌懸液的濃度與吸光度（OD）值成正比，因此可利用OD值來推知菌液的濃度，并將測(cè)得的OD值與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出沙門氏菌在一定生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)情況曲線圖。 以未接種的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定，按編號(hào)從小到大的順序依次進(jìn)行測(cè)定。沙門氏菌比濁測(cè)定結(jié)果吸光度（OD）值見表3-1。 表3-1 沙門氏菌菌液OD值 Table3-1 The value of optical density of Salmonella 培養(yǎng)時(shí)間（h） 吸光度（OD）值 空白對(duì)照 0.041 1 0.041 2 0.042 3 0.042 4 0.043 5 0.044 6 0.049 7 0.054 8 0.058 9 0.062 10 0.066 11 0.069 12 0.071 13 0.074 14 0.075 15 0.077 16 0.079 17 0.083 18 0.084 19 0.083 20 0.084 21 0.084 22 0.084 23 0.083 24 0.082 3.3.2 生長(zhǎng)曲線的繪制 由表3-1沙門氏菌菌液OD值，以沙門氏菌培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、以菌液光密度值為縱坐標(biāo)，繪制沙門氏菌生長(zhǎng)曲線圖3-1。 圖3-1 沙門氏菌生長(zhǎng)曲線圖 Fig.3-1 The growth curve of Salmonella 由圖3-1可知，沙門氏菌在0-5h特征表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩，5-16h生長(zhǎng)迅速、呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì)，16h以后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。此沙門氏菌生長(zhǎng)曲線與典型生長(zhǎng)曲線有所不同，對(duì)數(shù)期很長(zhǎng),長(zhǎng)達(dá)11個(gè)小時(shí)，但基本符合典型生長(zhǎng)曲線延緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)時(shí)期的劃分。5-16h為沙門氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 比濁法測(cè)定的是活菌數(shù)和死菌數(shù)之和，所繪制的生長(zhǎng)曲線可能會(huì)有一定的誤差，但這并不影響生長(zhǎng)曲線所反映的沙門氏菌的生長(zhǎng)情況。從圖3-1沙門氏菌生長(zhǎng)曲線可以看出，光電比濁法所測(cè)生長(zhǎng)曲線基本符合典型的沙門氏菌生長(zhǎng)曲線圖。圖3-1分析可知5-16h為沙門氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，本實(shí)驗(yàn)選擇可選16h為沙門氏菌的培養(yǎng)時(shí)間，從而進(jìn)行下步的試驗(yàn)。 3.4 沙門氏菌、單增李斯特菌的鑒別方法研究 3.4.1 沙門氏菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜圖 由2.2.6得到不同濃度的沙門氏菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜疊加圖如圖3-2、圖3-3、圖3-4所示。 圖3-2 沙門氏菌全細(xì)胞的原始光譜 Fig.3-2 NIRS spectrum of Escherichia Salmonella whole-cell 圖3-3 沙門氏菌細(xì)胞壁的原始光譜 Fig.3-3 NIRS spectrum of Escherichia Salmonella wall 圖3-4 沙門氏菌細(xì)胞質(zhì)的原始光譜 Fig.3-4 NIRS spectrum of Escherichia Salmonella cytoplasm 3.4.2 單增李斯特菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜圖 由2.2.7得到不同濃度的單增李斯特菌全細(xì)胞、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜疊加圖如圖3-5、圖3-6、圖3-7所示。 圖3-5 李斯特菌病全細(xì)胞的原始光譜 Fig.3-5 NIRS spectrum of Escherichia LM whole-cell 圖3-6李斯特菌病細(xì)胞壁的原始光譜 Fig.3-6 NIRS spectrum of Escherichia LM wall 圖3-7李斯特菌病細(xì)胞質(zhì)的原始光譜 Fig.3-7 NIRS spectrum of Escherichia LM cytoplasm 3.4.3 沙門氏菌、單增李斯特菌全細(xì)胞的鑒別分析 圖3-2是以沙門氏菌、單增李斯特菌全細(xì)胞不同波數(shù)點(diǎn)下的吸光度值為特征值，進(jìn)行多元散射預(yù)處理后進(jìn)行PCA分析，選取前兩個(gè)主成分?jǐn)M合原數(shù)據(jù)的效果圖，圖中橫縱坐標(biāo)的標(biāo)注分別是第一主分和第二主分的得分值。 圖3-2 沙門氏菌、單增李斯特菌全細(xì)胞主成分得分圖 Fig.3-2 The PCA score of Salmonella and LM whole-cell 從圖中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙門氏菌、單增李斯特菌全細(xì)胞的差異性信息。沙門氏菌第一組分得分范圍在-0.05～0.03之間，第二組分得分范圍在-0.13～-0.02之間；單增李斯特菌第一組分得分范圍在-0.09～0.04之間，第二組分得分范圍在0.01～0.25之間。可見兩種菌的第一主分得分范圍幾乎完全相同，而第二主分得分范圍明顯不同。不同的細(xì)菌，其細(xì)胞的物質(zhì)組成是不一樣的。不同的物質(zhì)在經(jīng)過近紅外光照射后會(huì)在不同的波段產(chǎn)生紅外特異性吸收，且有著不同的吸收譜段，因此可以通過近紅外光譜法區(qū)分開來。 3.4.4 沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞壁的鑒別分析 圖3-3是以沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞壁不同波數(shù)點(diǎn)下的吸光度值為特征值，進(jìn)行多元散射預(yù)處理后進(jìn)行PCA分析，選取前兩個(gè)主成分?jǐn)M合原數(shù)據(jù)的效果圖，圖中橫縱坐標(biāo)的標(biāo)注分別是第一主分和第二主分的得分值。 圖3-3 沙門氏菌、單增李斯特氏菌細(xì)胞壁主成分得分圖 Fig.3-3 The PCA score of Salmonella and LM wall 從圖中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞壁的差異性信息。沙門氏菌第一組分得分范圍在-0.10～0.05之間，第二組分得分范圍在-0.02～0.15之間；單增李斯特菌第一組分得分范圍在0.05～0.28之間，第二組分得分范圍在-0.30～-0.02之間。可見兩種菌的第一主分和第二主分得分范圍完全不同。細(xì)菌的細(xì)胞壁都含有一定量的肽聚糖，此外，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁還含有外膜這一特殊組分，包括脂多糖、脂質(zhì)雙層、脂蛋白三部分；革蘭氏陽性菌還含有大量特殊組分磷壁酸。沙門氏菌為革蘭氏陰性菌，單增李斯特氏菌為革蘭氏陽性菌，其細(xì)胞壁組分不盡相同，不同的物質(zhì)在經(jīng)過近紅外光照射后會(huì)在不同的波段產(chǎn)生紅外特異性吸收，且有著不同的吸收譜段，因此可以通過近紅外光譜法區(qū)分開來。 3.4.5 沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞質(zhì)的鑒別分析 圖3-4是以沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞質(zhì)不同波數(shù)點(diǎn)下的吸光度值為特征值，進(jìn)行多元散射預(yù)處理后進(jìn)行PCA分析，選取前兩個(gè)主成分?jǐn)M合原數(shù)據(jù)的效果圖，圖中橫縱坐標(biāo)的標(biāo)注分別是第一主分和第二主分的得分值。 圖3-4 沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞質(zhì)主成分得分圖 Fig.3-4 The PCA score of Salmonella and LM cytoplasm 從圖中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙門氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞質(zhì)的差異性信息。沙門氏菌第一組分得分范圍在0.04～0.12之間，第二組分得分范圍在-0.22～-0.10之間；單增李斯特菌第一組分得分范圍在0.02～0.06之間，第二組分得分范圍在-0.03～0.12之間。可見兩種菌的第一主分得分范圍有相似的地方，而第二主分得分范圍明顯不同。細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)是指被細(xì)胞膜包圍的除核區(qū)以外的一切半透明、膠體狀、顆粒狀物質(zhì)的總稱，主要成分為核糖體、貯藏物、各種酶類、中間代謝物、質(zhì)粒、各種營養(yǎng)物質(zhì)和大分子的單體等。兩種不同的細(xì)菌其細(xì)胞質(zhì)組分部分也不同，所以可以通過近紅外光譜法區(qū)分開來。 第4章 結(jié) 論 4.1 總結(jié) 1、采用平板劃線分離培養(yǎng)法和選擇性培養(yǎng)基對(duì)沙門氏菌、單增李斯特菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明，用亞硫酸鉍瓊脂（BS）培養(yǎng)基、改良的MC Bride瓊脂（MMA）培養(yǎng)基，根據(jù)沙門氏菌、單增李斯特菌在選擇性培養(yǎng)基的典型菌落特征，可將其從雜菌中很好的分離開來。 2、采用比濁法對(duì)沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行研究，并繪制生長(zhǎng)曲線圖。了解它們?cè)诓煌瑫r(shí)間段的生長(zhǎng)趨勢(shì)。研究表明：沙門氏菌在5-16h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。所以可選取液體培養(yǎng)16h沙門氏菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 3、根據(jù)不同濃度梯度的沙門氏菌、單增李斯特菌的全細(xì)胞、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜，通過矢量歸一法處理方法，利用基于主成分分析技術(shù)的投影判別分析，研究?jī)煞N菌的近紅外光譜鑒別方法。結(jié)果表明，不論是利用全細(xì)胞、細(xì)胞壁還是細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜分析，都可以將沙門氏菌和單增李斯特菌區(qū)分開來。 4、近紅外光譜分析技術(shù)可以用于進(jìn)行沙門氏菌、單增李斯特菌的分類鑒別。 本文結(jié)果表明不同致病菌的細(xì)胞組成是不相同，由于不同的組分可對(duì)近紅外光產(chǎn)生特異性吸收，因此近紅外光譜法可以通過致病菌的不同近紅外光譜圖譜區(qū)分不同細(xì)菌種類，為建立一種快速的致病菌檢測(cè)方法提供依據(jù)。但是，到底是什么物質(zhì)引起近紅外光產(chǎn)生特異性吸收還不知道，尚需進(jìn)一步研究，還有利用近紅外光譜分析技術(shù)對(duì)更多種類致病菌的檢測(cè)技術(shù)也需要進(jìn)一步研究。 4.2 展望 我國已進(jìn)入WTO，減員增效成為國內(nèi)企業(yè)改革的重要措施之一，近紅外分析技術(shù)的應(yīng)用，可提高生產(chǎn)的自動(dòng)化程度，節(jié)省大量人力。隨著我國工業(yè)生產(chǎn)水平和生活水準(zhǔn)的不斷提高，最終近紅外技術(shù)的應(yīng)用也像發(fā)達(dá)國家的一樣。正因?yàn)槿绱?，目前國外各大近紅外光譜分析儀器廠家都看好中國市場(chǎng)，紛紛投入了大量人力和物力，爭(zhēng)奪中國的巨大市場(chǎng)。就煉廠而言，常、減壓蒸餾、催化裂化、各種產(chǎn)品調(diào)和工藝，還有加氫和重整等工藝都非常需要在線NIR，每套裝置至少需要一套在線近紅外過程分析儀，按此預(yù)計(jì)我國石化需要幾千套。同樣，化工工業(yè)也有類似情況。而引進(jìn)一臺(tái)在線近紅外過程分析儀，一般在200至600萬人民幣。對(duì)于農(nóng)業(yè)糧食、食品和醫(yī)藥部門的需求從數(shù)量上更是巨大，因此，我國對(duì)這一技術(shù)具有巨大的潛在市場(chǎng)，在數(shù)量上和規(guī)模上，其他國家無法與我國相比，屬于關(guān)系到國計(jì)民生的關(guān)鍵技術(shù)。 由于近紅外光譜包含了C-H，O-H，N-H以及其他化學(xué)鍵的振動(dòng)信息，近紅外光譜測(cè)量方式包括透射、漫反射，可以測(cè)量液態(tài)和固態(tài)樣品。所以，近紅外應(yīng)用的領(lǐng)域范圍極其廣泛。根據(jù)我國“十一五”期間的科學(xué)發(fā)展觀，由資源消耗和粗放生產(chǎn)管理向節(jié)約型和生產(chǎn)優(yōu)化與精確控制型轉(zhuǎn)化，建立人與自然協(xié)調(diào)發(fā)展的社會(huì)。質(zhì)量管理提到了很高的地位。近紅外分析技術(shù)作為質(zhì)量管理所依靠的重要技術(shù)手段之一，在未來具有光明的應(yīng)用前景。目前近紅外分析作為新技術(shù)在我國的市場(chǎng)已經(jīng)初步形成，目前每年近紅外