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附件7 液體乳中三聚氰胺的快速檢測 膠體金免疫層析法 (KJ201907) 1　 范圍 本方法規(guī)定了液體乳中三聚氰胺的膠體金免疫層析快速檢測方法。 本方法適用于巴氏殺菌乳、滅菌乳、調(diào)制乳和發(fā)酵乳中三聚氰胺的快速測定。 2　 原理 本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的三聚氰胺與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中三聚氰胺進行定性判定。 3　 試劑和材料 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。 3.1　 試劑 3.1.1 甲醇。 3.1.2 三羥甲基氨基甲烷（Tris）。 3.1.3 1mol/L鹽酸：移取83 mL濃鹽酸，加入900mL水中，定容至1 L。 3.1.4 甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50 mL甲醇和50 mL水，混勻后備用。 3.1.5 稀釋液：準(zhǔn)確稱取6.05 g Tris（3.1.2）和8.5 g 1mol/L鹽酸（3.1.3），加水定容至1 L，混勻后備用。 3.2　 參考物質(zhì) 參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量見表1，純度≥99%。 表1 三聚氰胺參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號 分子式 相對分子質(zhì)量 三聚氰胺 Melamine 108-78-1 C3H6N6 126.12 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3　 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000 μg/mL）：精密稱取適量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（3.2），置于10 mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.1.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1000 μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液；或可直接購三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液。4℃避光保存?zhèn)溆?，有效?個月。 3.4　 三聚氰胺膠體金免疫層析試劑盒 3.4.1　 金標(biāo)微孔（含膠體金標(biāo)記的特異性抗體）。 3.4.2　 試紙條或檢測卡。 4　 儀器和設(shè)備 4.1　 移液器：200 L、1000 L和5 mL。 4.2　 渦旋混合器。 4.3　 電子天平：感量為 0.01 g。 4.4　 環(huán)境條件：溫度15℃~35℃，濕度≤80%。 5　 分析步驟 5.1　 試樣制備 取適量有代表性樣品充分混勻。 5.2　 試樣提取 準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g于離心管中，加入5 mL稀釋液（3.1.5），渦旋混勻提取5 min，即得待測液。 注：試樣提取過程可按照試劑盒說明書，不做限定。 5.3　 測定步驟 5.3.1　 試紙條與金標(biāo)微孔測定步驟 吸取150~200 μL樣品待測液于金標(biāo)微孔（3.4.1）中，抽吸5~10次使混合均勻，不要有氣泡，40℃溫育3 min，將檢測試紙條（3.4.2）樣品端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，40℃溫育5 min，從微孔中取出試紙條，進行結(jié)果判定。 5.3.2　 檢測卡測定步驟 吸取150-200 μL樣品待測液于檢測卡加樣孔（3.4.2）中，室溫反應(yīng)3-5 min，進行結(jié)果判定。 5.4　 質(zhì)控試驗 每批樣品應(yīng)同時進行空白試驗和加標(biāo)質(zhì)控試驗。 5.4.1　 空白試驗 稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 5.4.2　 加標(biāo)質(zhì)控試驗 準(zhǔn)確稱取空白試樣100 g（精確至0.01 g）置于100 mL玻璃溶液瓶中，加入250 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 μg/mL）（3.3），使試樣中三聚氰胺濃度為2.5 mg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 注：可參考標(biāo)準(zhǔn)品的說明書配置操作。 6　 結(jié)果判定要求 通過對比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結(jié)果判定。目視結(jié)果判讀如圖1。 6.1　 無效 控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。 6.2　 陽性結(jié)果 6.2.1　 消線法 檢測線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測限，判定為陽性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖 ）。 6.2.2　 比色法 檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺或幾乎不顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測限，判定為陽性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖 ）。 6.3　 陰性結(jié)果 6.3.1　 消線法 檢測線（T線）、控制線（C線）均顯色，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測限，判定為陰性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖 ）。 6.3.2　 比色法 檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當(dāng)，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測限，判定為陰性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖 ）。 試紙條 手持端 C線 T線 樣品端 檢測卡 加樣孔 T線 C線 C線 T線 T線 T線 C線 C線 陰性 陽性 陽性 陰性 消線法 比色法 結(jié)果無效 檢測裝置示意圖 圖1 試紙條/檢測卡目視判定示意圖 6.4　 質(zhì)控試驗要求 空白試驗測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗測定結(jié)果應(yīng)為陽性。 6.5　 讀數(shù)儀測定法 按讀數(shù)儀說明書要求操作直接讀取并進行結(jié)果判定。 7　 結(jié)論 三聚氰胺與滅蠅胺有交叉反應(yīng)，當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)對三聚氰胺結(jié)果進行確證。 8　 性能指標(biāo) 8.1　 檢測限 2.5mg/kg。 8.2　 靈敏度 靈敏度應(yīng)≥99% 8.3　 特異性 特異性應(yīng)≥85%。 8.4　 假陰性率 假陰性率應(yīng)≤1%。 8.5　 假陽性率 假陽性率應(yīng)≤15%。 注：性能指標(biāo)計算方法參見附錄A。 9　 其他 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定，可根據(jù)試劑盒說明書進行操作。方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過驗證的滿足本方法規(guī)定的各項性能指標(biāo)的試劑、試劑盒。 本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T 22388-2008）。 本方法使用試劑盒可能與滅蠅胺存在交叉反應(yīng)，當(dāng)結(jié)果判定為陽性時，應(yīng)采用實驗室儀器方法《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T 22388-2008）對三聚氰胺結(jié)果進行確證。 附錄A 快速檢測方法性能指標(biāo)計算表 表A.1性能指標(biāo)計算方法 樣品情況a 檢測結(jié)果b 總數(shù) 陽性 陰性 陽性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N21 N.2=N12+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異（χ2） χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1 靈敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特異性（p-，%） p-=N22/N2. 假陰性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特異性 相對準(zhǔn)確度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由參比方法檢驗得到的結(jié)果或者樣品中實際的公議值結(jié)果； b由待確認(rèn)方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用確認(rèn)后的結(jié)果。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標(biāo)指行，第二個下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測結(jié)果相對準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。 本方法負(fù)責(zé)起草單位：北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心（北京市食品檢驗所） 驗證單位：山東省食品藥品檢驗研究院、四川省食品藥品檢驗檢測院、江南大學(xué) 主要起草人：史娜、吳燕濤、孫蕊、王麗、潘攀、張麗華 — END — —6——