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1、1.某學生在用EcoRI切割外源DNA片段時，出現(xiàn)了星號活性，請分析可能的原因并提出解決的方案? （6分） 答：(1)導致星號活性因素：a較高的甘油濃度 b酶與底物DNA比例過高（不同酶情況不同，通常為＞100v/micHo.g） c 低鹽濃度（<25mM） d 高PH值（>PH8.0） e 存在有機溶劑（如DMSO .乙醇（9）.乙烯乙二醇.二甲基乙酰胺.二甲基甲酰胺.sulphalane(12)等） f用其他二價離子代替Mg2+(Mn2+.Cu2+.Co2+.Zn2+等) 　　 （2）抑制星號活性的方法：a盡量用較少酶進行完全消化反應(yīng)，這樣可避免過度消化及過度的甘油濃度. B盡量避免

2、有機溶劑（如制備DNA時二乙醇）污染 c 將離子濃度提高到100—150mM（若酶活性不受離子濃度影響） d將反應(yīng)緩沖液PH值降到7.0 e 二價離子用Mg2+ 3、目的基因與啟動子拼接后，重組分子若不表達，應(yīng)如何分析？（10分） 答：a.目的基因的表達方式，細胞內(nèi)表達或者分泌細胞外，如果蛋白為分泌性，那么細胞內(nèi)檢測不到表達，或者表達很少 B.分子量大小，分子量大小決定了蛋白半衰期，因而檢測需要延長 C.目的基因的抗體特異性不好則很難以檢測表達 D.許多表達宿主自身有自己的蛋白酶，會將你的產(chǎn)物降解，也可能因為修飾系統(tǒng)不同，使得產(chǎn)物的活性不高或者沒有。 E.如果宿主菌與蛋白來源菌不同

3、也有可能由于密碼子使用偏好性不同導致不表達. 4藍白斑篩選法為什么也會有假陽性? 答：藍白斑篩選法出現(xiàn)假陽性的原因：β-半乳糖苷酶的N末端是非必須的，可以進行修飾，并不影響酶的活性或α肽的互補性。如果插入的外源DNA引起α肽的可讀框的改變或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就形成白色噬菌斑。如果插入DNA的堿基數(shù)正好是3的倍數(shù)，或者插入的DNA中不含有終止子的話，仍會形成藍白菌落。這種插入物的長度可達幾百個堿基對 （1）藍白斑篩選法原理：某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖甘酶基因片段，在半乳糖甘酶基因區(qū)外又另外引入了一段含有多種單一限制性酶切位點的dna序列，這些位點上如果沒有克隆外

4、源性dna片段，在質(zhì)粒導入Lac的大腸桿菌后質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，加入底物X—gal和誘導劑IPTG后出來藍色菌落；如果在多克隆位點上插入外源基因，則使LacZ’基因滅火，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色，由于這種顏色標志，重組與非重組體的區(qū)分一目了然。(2)假陽性的原因：不一定就是目的基因 5、當兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時，若要進行雙酶切，應(yīng)采取什么措施? 為什么? （8分） 答：1.同步雙酶切：選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步，因為在非最佳緩沖條件下時的切割速率會減緩 2 .分步酶切

5、：應(yīng)從反應(yīng)要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切 3.使用配有特殊緩沖液的酶進行雙酶切：在大多數(shù)情況下，采用標準緩沖液的酶也能在這些特殊緩沖液中進行酶切，這保證了對緩沖液有特殊要求的酶也能良好工作。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液中進行酶切反應(yīng)時，反應(yīng)速度會減慢，因此需要增加酶量或延長反應(yīng)時間 6、用哪些方法可以檢測轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因，如何檢測？（8分） 答：1、外源基因整合到植物基因組的檢測 SOUTHERN雜交、多聚酶鏈式反應(yīng)、報告基因檢測等 2、外源基因在植物基因組中轉(zhuǎn)錄檢測 　　NORTHERN雜交是DNA-RNA雜交，它

6、是檢測特定組織或器官中外源基因是否轉(zhuǎn)錄出MRNA一種有用的方法 　　3、外源基因在植物基因組中翻譯的檢測 　　WESTERRN雜交則是蛋白質(zhì)間的雜交，它是檢測特定組織或器官中外源基因是否有翻譯出特定蛋白質(zhì)的方法 　　4、篩選標記基因，如抗菌素抗性基因，抗除草劑基因等來進行，當受體細胞本身不含此類基因時，導入含有或構(gòu)建有此類基因的供體后，只要起在受體中轉(zhuǎn)化成功，便可用抗菌素或除草劑等進行篩選。 　　5利用導入外源基因所表達的特殊性狀直接鑒定； 7、請你自己設(shè)計一個抗除草劑X的轉(zhuǎn)基因植物，并寫出主要操作步驟。（10分） 答：1.目的基因的獲得：找到抗除草劑x基因用限制性內(nèi)切酶進行酶切，

7、在進行pcr 2.轉(zhuǎn)化：可以采用介導轉(zhuǎn)化法，基因槍介導轉(zhuǎn)化法，花粉管通道法 3.篩選并檢測：利用含有重組基因的植株的抗性進行篩選。 已知某蛋白基因CDNA長度為1.8kb,兩端的核酸序列如下： ‘ATGAGTGCCAATAGCCCGACAGGAAACGATCCCCATGTATTTGGTATTCAA-------------GAGCGCAAGTAGCACGCCCTCTTCTACTACAATGTCATAA3‘ 經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因內(nèi)部有如下限制性內(nèi)切酶位點：AflII CTTAAG， EcoRV GATATC，XmaI CCCGGG，EcoRI GAATTC，SmaI CCCGGG， Sac

8、I GAGCTC， SalI GTCGAC， HindII AAGCTT， NotI GCGGCCGC。 MCS： BamHI： G|GATCC； SmaI： CCC|GGG； SacI： G|AGCTC； SalI：G|TCGAC； SphI： G|CATGC； XbaI ：T|CTAGA ； PstI：C|TGCAG； HindIII： A|AGCTT； KpnI：G|GTACC。 現(xiàn)要把該基因克隆至表達載體pQE-30中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達并規(guī)?；a(chǎn)。 1） 寫出可用的酶切位點； 2） 設(shè)計出PCR引物； 3） 設(shè)計PCR擴增的程序；

9、4） 詳述克隆、篩選、表達純化及其規(guī)?；倪^程。 （1）答：BamHI PstI XbaI KpnI SphI HindIII （2） 答： PCR引物： 設(shè)計PCR 引物 上游引物：5’—3’ GGG / GGATCC(BamHI)/ATGAGTGCCAATAGCCGACAG Tm =4（G+C）+2(A+T) =68° 下游引物: 5’—3’ GGG/CTGCAG(PstI)/TTATGACATTGTAGTAGAAGAG Tm=4(G+C)

10、+2(A+T) =58° （3）答：PCR擴增程序： 1 預(yù)變性：雙鏈DNA在94度 左右預(yù)變性5min 2變性：94度下雙鏈DNA變性30s 3退火：55度退火30s 4延伸：72度延伸 90s 5最后72度 延伸10min 循環(huán)三十次 （4）答：克?。簩⑤d體用BamHI酶和Xbal酶進行雙酶切，然后將目的基因在體外用DNA連接酶與載體連接，導入事先做好的感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上 篩選：以為載體上帶有抗氨芐青霉素標記基因，所以能在培養(yǎng)基

11、上存活的即為轉(zhuǎn)化子 表達純化：將篩選出來的菌株進行培養(yǎng)，得到的產(chǎn)物進行分離純化，因為載體上含有6個組氨酸基因，所以可以用親合層析的方法進行提純 規(guī)?；簩⒌玫降膯我痪甏笠?guī)模培養(yǎng)，可以采用連續(xù)培養(yǎng)的方法進行，可以得到大量產(chǎn)物 1、 限制性內(nèi)切酶分為幾類？基因工程中常用的為哪一類？有何特點？（6分） 答：1．分三類：為限制性內(nèi)切酶I型.II型.III型.2．基因工程中常用的為II型。 特點：識別雙鏈DNA分子中4~8對堿基德特定序列，大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)，識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)。 2、什么是cDNA文庫(complementDN

12、Alibrary)?同基因組文庫有何差別? 答：（1）cDNA文庫是通過對一系列mRNA反轉(zhuǎn)錄并對特殊的克隆予以篩選得到的，cdna文庫是以某一生物的總mRNA為模板，在無細胞系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下首先合成一條互補的DNA即第一鏈，破壞RNA模板后，在以第一鏈為模板合成第二鏈，得到雙鏈的DNA即cDNA，選用適合的載體，將合成的cDNA重組導入寄主細胞，經(jīng)篩選得到的cDNA克隆群為cDNA文庫 （2）差別：基因組文庫含有全部基因，cDNA文庫含有全部蛋白編碼的結(jié)構(gòu)基因，cDNA文庫小于基因組文庫 3、PCR的基本原理是什么?用PCR擴增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息?

13、 答：（1）原理：DNA半保留復制的原理，在體外進行DNA的變性，復性和延伸。首先是在dsDNA在高溫下變性為ssDNA，然后DNA聚合酶以ssDNA為模板，利用聚合酶和dNTPs合成新生的DNA互補鏈，新合成的dsDNA經(jīng)過變性，復性，延伸，如此反復循環(huán)，使目標DNA以指數(shù)形式擴增 （2）要已知待擴增目的基因或者DNA片段兩側(cè)的序列，據(jù)該序列化學合成聚合反應(yīng)必須的雙引物?；蛘咧辽兕A(yù)先知道，足夠合成一對引物的靶DNA序列。 4、目的基因與啟動子拼接后，重組分子若不表達，應(yīng)如何分析？（10分） 答：a.目的基因的表達方式，細胞內(nèi)表達或者分泌細胞外，如果蛋白為分泌性，那么細胞內(nèi)檢測不到

14、表達，或者表達很少 B.分子量大小，分子量大小決定了蛋白半衰期，因而檢測需要延長 C.目的基因的抗體特異性不好則很難以檢測表達 D.許多表達宿主自身有自己的蛋白酶，會將你的產(chǎn)物降解，也可能因為修飾系統(tǒng)不同，使得產(chǎn)物的活性不高或者沒有。 E.如果宿主菌與蛋白來源菌不同也有可能由于密碼子使用偏好性不同導致不表達. 5、為什么pUC系列的載體與外源基因形成的重組體可以用藍白斑實驗進行篩選？ 答：pUC系列載體帶有大腸桿菌的LacZ’基因片段，在該基因內(nèi)部含有多種限制性內(nèi)切酶位點，在這些位點上如果沒有克隆外源DNA片段，在質(zhì)粒導入Lac的大腸桿菌后質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_，與大腸

15、桿菌的半乳糖苷酶基因互補，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，加入底物X—gal和誘導劑IPTG后出來藍色菌落；如果在多克隆位點上插入外源基因，則使LacZ’基因滅火，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色，由于這種顏色標志，重組與非重組體的區(qū)分一目了然。 6、如果知道某一基因的功能及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成，可以通過何種方法克隆該基因? 答：先從表達該蛋白質(zhì)的細胞中提取總的mRNA，根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測其dna序列，該序列制成探針，然后與提取出的mRNA雜交，能夠雜交的即可選出，利用反轉(zhuǎn)錄的方法合成cDNA，再用pcr技術(shù)克隆該基因。 7、欲將一真核生物的結(jié)構(gòu)基因克隆后轉(zhuǎn)移到原核生物(

16、如E．coli)中進行表達，克隆時應(yīng)注意哪些問題? （10分） 答：真核生物的結(jié)構(gòu)基因含有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)移的的目的基因要去除內(nèi)含子，原核生物與真核生物有密碼子偏愛性。 1、某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一Bgl I的切點?，F(xiàn)用 Bgl I切割該載體進行基因克隆，問：(1)轉(zhuǎn)化后涂皿時應(yīng)加什么樣的抗生素?(2)培養(yǎng)后長出的菌落具有什么樣的抗性基因型?(3)如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體?（6分） 答：1．含Tet抗性的抗生素 2.Tet(r)+Kan(r)+Tet(r) Tet(r)Kan(s)和Tet(r)Kan(r) 3先將轉(zhuǎn)化液涂皿在T

17、et平板，再將Tet平板上轉(zhuǎn)化子影印在含Tet,Kan的平板上 在Tet平板上生長，但在Tet,Kan平板上不生長的轉(zhuǎn)化子即為含有插入片段的重組體 2、簡述差異雜交的原理及基本思路？ 答：原理：差異雜交是將基因組文庫的重組噬菌體dna轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素摸上，用兩種混合的不同cdna探針分別于濾膜上的dna雜交，分析兩張濾膜上對應(yīng)位置雜交信息以分離差異表達的基因。適用于基因組不太復雜的真核生物表達基因的比較，假陽性綠較低，但對基因組非常復雜的鹽酸核生物，則因工作量太大，表達的序列所占百分比較低，價值不大 基本思路：將一種細胞的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成cRNA第一鏈，然后將該cRNA與另一種細胞過

18、量的mRNA進行雜交，第一種細胞中如果存在不同于第二種細胞的特殊基因表達，則會產(chǎn)生該特殊基因的mRNA和反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，該cDNA不能與第二種細胞的mRNA形成雜交體，該雜交體反應(yīng)產(chǎn)物再經(jīng)羥基磷灰石柱層析，便于分離純化出未形成雜交體的cDNA，它代表前一種細胞中特殊基因，以該鏈作為探針后，第一種細胞的cDNA文庫的兩套重復拷貝雜交，跟探針能夠雜交克隆是在組織細胞中特異表達的mRNA，再對這樣的克隆進行測序比較，鑒定，就分離到這種組織，特異表達的基因，所有包含重組體的菌落，陽性反應(yīng)在X射線上呈現(xiàn)黑色的點。 4、PCR 引物設(shè)計引入酶切位點時，為什么需在酶切位點后加上一些堿基？（6 答：

19、pcr引物設(shè)計引入酶切位點時需在酶切位點后加上2-3個GC堿基作為保護堿基，其可以保護pcr引物被酶降解，還為限制性內(nèi)切酶的切割充當一個支點，作用點使得切割更容易。 5、當兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時，若要進行雙酶切，應(yīng)采取什么措施? 為什么? （10分） 答：1.同步雙酶切：選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步，因為在非最佳緩沖條件下時的切割速率會減緩 2 .分步酶切：應(yīng)從反應(yīng)要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切 3.使用配有特殊緩沖液的酶進行雙酶切：在大多數(shù)情況下，采用標準緩沖液的酶也能在這些特殊緩沖液

20、中進行酶切，這保證了對緩沖液有特殊要求的酶也能良好工作。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液中進行酶切反應(yīng)時，反應(yīng)速度會減慢，因此需要增加酶量或延長反應(yīng)時間 6、目前常用的轉(zhuǎn)基因方法有哪些，各有何特點？ 答：（1）.Ca離子誘導的轉(zhuǎn)化，Ca離子與細胞外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)過熱脈沖發(fā)生收縮作用，使得細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫感受態(tài)。 （2）電穿孔轉(zhuǎn)化：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或dna重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)換儀的樣品池中，兩級施加高壓電場，在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或dna重組分子進入，特點是 （3）細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：革蘭氏陰性菌如枯草桿菌接納外源dna的主要

21、屏障是細胞壁，因而這類細菌通常用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟Mdna分子，酵母菌，霉菌，植物細胞也可用此法。 7、請你自己設(shè)計一轉(zhuǎn)抗菌肽魚，并寫出主要操作步驟。（12分） 答：1.抗菌肽基因的獲得：尋得含有抗菌肽基因的生物體并提取出抗菌肽基因，再將這段基因連接到載體上，獲得含有目的基因的載體 2.選擇基因轉(zhuǎn)移的受體細胞，這種受體細胞需要是全能細胞，如生殖細胞受精卵，胚胎干細胞， 3.將獲得的含有目的基因的載體用轉(zhuǎn)基因的方法導入受體細胞，如魚受精卵中 4.培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的受精卵，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚， 5.檢驗試驗魚是否產(chǎn)生抗菌肽表型 1、載體的功能與應(yīng)具備的條件 答。①運送

22、外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞 ②為外源基因提供復制能力或整合能力 ③為外源基因的擴增或表達提供必要的條件 具備的條件：具有針對受體細胞的親緣性或親和性 具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復制位點或整合位點 具有較高的外源DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點 具有合適的篩選標記 1． 質(zhì)粒的基本特征 ① 自主復制性②不相容性③可轉(zhuǎn)移性④攜帶特殊的遺傳標記 質(zhì)粒的分離純化 ① Cscl密度梯度離心法 質(zhì)粒DNA純度高、周期長，設(shè)備要求高，溴乙啶污染 ② 沸唱浴法 質(zhì)粒DNA純度低，快速，操作簡便 ③ 堿溶法 藍-白篩選的原理 答。某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶

23、基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含有單一限制酶位點的DNA序列。這些位點上如果沒有克隆外源性DNA片段，在質(zhì)粒被導入lac-的大腸桿菌后，質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，假如人工底物X-gal和誘導劑IPTG后，出現(xiàn)藍色的菌落。如果在多克隆位點上插入外源DNA片段，將使lacZ基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色。由于這種顏色標志，重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然。 4。受體細胞應(yīng)具備的條件 ①限制性缺陷型 外切酶合內(nèi)切酶活性缺陷②重組整合缺陷型 用于基因擴增或高效表達的受體細胞③具有較高的轉(zhuǎn)

24、化效率 具有與載體選擇標記互補的表型 ④ 感染寄生缺陷型 防止重組細菌擴散污染，，生物武器除外 5。影響雜交的因素 答。①核酸分子的濃度和長度：核酸濃度越大，復制性速度越快。探針長度應(yīng)控制在50-300個堿基對為好 ②溫度：溫度過高不利于復性，而溫度過低，少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較TM值低25度 ③離子強度：在低離子強度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強度的增加，，雜交反應(yīng)率增加。高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，所以進行序列不完全同源的核酸分子雜交時必須維持雜交反應(yīng)液中的鹽濃度合洗膜液中的鹽濃度。 ④雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的TM值。它有

25、以下優(yōu)點：在低溫下探針更穩(wěn)定，能更好的保留非公價結(jié)合的核酸。 ⑤ 核酸分子的復雜性：是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長度。兩個不同基因組DNA變性后的相對雜交速率取決于樣品濃度絕對一致時的相對復雜性。 6。克隆DNA序列檢測 ①限制性酶切圖譜法②菌落噬菌斑雜交法③DNA序列分析法 7。外源基因產(chǎn)物檢測 ①蛋白質(zhì)生物功能測定法：a。淀粉酶目的基因的鑒定b?？咕钥剐曰虻蔫b定c。DNA結(jié)合蛋白編碼基因的鑒定 d。雜交釋放轉(zhuǎn)譯鑒定 ②蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法：a。放射免疫原位雜交鑒定b。免疫沉淀法 ③聚丙烯酰胺凝膠電泳法：如果待篩選鑒定的目標蛋白既不能測定生物活性，有無現(xiàn)成的抗體使用，

26、則可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行粗略的篩選 8。菌落噬菌斑原位雜交法 答。工作原理：根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計并合成探針以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子 基本操作：①用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板 ②用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜 ③用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 ④80°C烘干固定影印薄膜 ⑤薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫 ⑥用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜 ⑥ 用X光膠片覆蓋薄膜感光 基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則

27、涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。 基因工程的支撐技術(shù) 核酸凝膠電泳技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)、細菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)、DNA序列分析技術(shù) 寡核苷酸合成技術(shù)、基因定點突變技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù) 用于核酸操作的工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修飾酶 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能 識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈 主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵細菌的限制與修飾作用 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一

28、些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Star activity現(xiàn)象 載體的功能 運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞、為外源基因提供復制能力或整合能力、 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件 載體應(yīng)具備的條件 具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復制位點或整合位點 具有較高的外源DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點 具有合適的篩選標記 受體細胞應(yīng)具備的條件 限制性缺陷型 外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 重組整合缺陷型 用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-）

29、 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 具有與載體選擇標記互補的表型 感染寄生缺陷型 防止重組細菌擴散污染，生物武器除外 基因工程的操作過程 A DNA的體外重組（切、接） B 重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增） C 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 重組率的定義 重組率 = 含有外源DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù) Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化 Ca2+誘導的完整細胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài) 大腸桿菌感受

30、態(tài)細胞的制備： 100 ml 菌體培養(yǎng)至OD600 = 0.5，離心收集菌體 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心收集菌體 用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 冰浴放置12 - 24小時，備用 大腸桿菌感受態(tài)細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化： 取100 ml 感受態(tài)細胞，加入相當于50 ng 載體的重組DNA連接液，混勻冰浴放置半小時 在42℃保溫 2 分鐘（熱脈沖） 快速將轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 - 2分鐘 加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng) 1 小時（擴增） 涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選 電穿孔轉(zhuǎn)化

31、將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進入細胞內(nèi) 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y(jié)構(gòu)的受體細胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實驗 轉(zhuǎn)化率的定義 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進入受體細胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細胞接納DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未

32、接納載體或重組子的受體細胞不長） 擴增操作的目的 增殖轉(zhuǎn)化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細胞用于篩選程序 擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選 表達外源基因，便于篩選和鑒定 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 載體遺傳標記檢測 克隆DNA序列檢測 外源基因產(chǎn)物檢測 抗藥性篩選法 營養(yǎng)缺陷型篩選法 顯色篩選法 限制性酶切圖譜法 DNA序列分析法(測序) 菌落噬菌斑原位雜交法 菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù) 菌

33、落原位雜交法的基本操作： 用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板 用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫 用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜 用X光膠片覆蓋薄膜感光 聚丙烯酰胺凝膠電泳法 如果待篩選鑒定的目標蛋白既不能測定生物活性，又無現(xiàn)成的抗體使用，則可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行粗略的篩選 基因文庫（gene library or gene bank） 從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為： 基因組文庫（含有全部基因） cD

34、NA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因） 大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢 全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架 基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物 大腸桿菌表達外源基因的劣勢 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復性功能 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素 核糖體結(jié)合位點 外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不

35、同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘ 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS） 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3’端區(qū)域3’ AUUCCUCC 5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子； SD序列與翻譯起始密碼

36、子之間的距離及堿基組成； 基因編碼區(qū)5’ 端若干密碼子的堿基序列 密碼子偏愛性對外源基因表達的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達： 外源基因全合成 同步表達相關(guān)tRNA編碼基因 外源基因全合成 按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達均采用了這種方法 同步表達相關(guān)tRN

37、A編碼基因 對于那些含有不和諧密碼子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達的策略較為有利。 包涵體及其性質(zhì) 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下

38、也以包涵體的形式存在于細菌細胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子 包涵體表達形式的優(yōu)點： 能簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來 能在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅 包涵體表達形式的缺點： 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標蛋白，

39、因此包涵體變復性操作的效率對目標產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個技術(shù)難題，尤其當目標蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復性蛋白質(zhì)的成功率相當?shù)?，一般不超過30% 包涵體的復性與重折疊的主要任務(wù)是： 將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊 通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復性 分泌型異源蛋白的表達 在大腸桿菌中表達的異源蛋白按其在細胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中；或者通過運輸或分泌方式定位于細胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件 分泌表達形式的優(yōu)點： 1目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰

40、島素原若分泌到細胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細胞質(zhì)中的10倍2目的蛋白易于分離3目的蛋白末端完整 相當多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當這些真核基因在大腸桿菌中表達時，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去 分泌表達形式的缺點： 相對其它生物細胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達，少數(shù)外源基因既便能分泌表達，但其表達率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有

41、，但并不普遍 融合型異源蛋白的表達 除了直接表達異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框架進行表達。由這種雜合基因表達出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設(shè)計引入的蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白 以融合形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對分子量較小的多肽效果更佳 目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進行親和層析，可以快速獲得純度較高的

42、融合蛋白 目的蛋白表達率高 與受體蛋白共用一套完善的表達元件 目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲目的蛋白。在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段 工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制 受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解 外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝 能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導受體細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動降解程序 重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配

43、這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因 受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排 施加選擇壓力 根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素 根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份 培養(yǎng)基復雜，成本較高 控制目的基因的過量表達 使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度 使用可控型復制子控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù) 優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定 5