《王鏡巖生化 核酸PPT課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《王鏡巖生化 核酸PPT課件（75頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、P330 表5-1 兩類核酸的基本化學(xué)組成RNA： D-核糖， A、G、C、U堿基DNA： D-2-脫氧核糖， A、G、C、T堿基 第1頁(yè)/共75頁(yè)一、堿基1. 嘌呤堿： 腺嘌呤 A 鳥嘌呤 G2. 嘧啶堿： 胞嘧啶 C 尿嘧啶 U 胸腺嘧啶 T P331 結(jié)構(gòu)式 3. 修飾堿基： 100余種，多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶代替C。第2頁(yè)/共75頁(yè)二、核苷與脫氧核苷核酸中的核苷與脫氧核苷均為-型嘧啶堿： C1 N1，嘌呤堿： C1 N9。 P332 結(jié)構(gòu)式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脫氧核苷第3頁(yè)/共75頁(yè)三、核苷酸核苷中戊糖C3、C5羥基被磷酸酯

2、化 P332結(jié)構(gòu)式：5-AMP 3-dCMP 第4頁(yè)/共75頁(yè)第5頁(yè)/共75頁(yè)1、構(gòu)成DNA、RNA的核苷酸P481表13-4DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA： AMP、 GMP、 CMP、 UMP2、細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物第6頁(yè)/共75頁(yè)核苷5-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代謝和物質(zhì)代謝及調(diào)控中起重要作用。環(huán)核苷酸3,5-cAMP， 3,5-cGMP激素的第二信使，cAMP調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝、脂代謝。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpp pppGpp ppApp核苷酸衍生物HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等輔助因子。GDP-

3、半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供體。第7頁(yè)/共75頁(yè)第二節(jié)第二節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)一級(jí)：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。二級(jí)：DNA的兩條多聚核苷酸鏈間通過(guò)氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級(jí)：DNA雙鏈進(jìn)一步折疊卷曲形成的構(gòu)象。第8頁(yè)/共75頁(yè)一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通過(guò)3、5-磷酸二酯鍵連接起來(lái)的線形多聚體。 P483 圖 13-2 寫法：53：5-pApCpTpG-3，或5ACTG3 第9頁(yè)/共75頁(yè)第10頁(yè)/共75頁(yè)二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1953年，Watson和Crick根據(jù)Chargaff 規(guī)律和DNA Na鹽纖維的X光衍射分析提出了D

4、NA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。Chargaff 規(guī)律 1950年a. 所有DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。P486。b. DNA的堿基組成具有種的特異性。c. DNA堿基組成沒有組織和器官的特異性。d. 年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不影響DNA的堿基組成。 DNA的Na鹽纖維和DNA晶體的X光衍射分析。Franklin相 對(duì) 濕 度 9 2 % ： B DNA。相 對(duì) 濕 度 7 5 % ： A DNA。 ZDNA。第11頁(yè)/共75頁(yè)1、Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(B-DNA)P486圖135 兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條53，另一條35 嘌呤

5、與嘧啶堿位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與脫氧核糖在雙螺旋外側(cè)。 磷酸與脫氧核糖彼此通過(guò)3、5-磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成DNA分子的骨架。 兩條核苷酸鏈，依靠堿基間形成的氫鏈結(jié)合在一起。A=T、G=C 每圈螺旋含10個(gè)核苷酸，堿基堆積距離0.34nm，螺距：3.4nm，雙螺旋平均直徑2nm， 大溝：寬1.2nm ，深0.85nm，小溝 ：寬0.6nm，深0.75nmP487 圖13-6 13-7第12頁(yè)/共75頁(yè)第13頁(yè)/共75頁(yè)2、穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素堿基堆積力（主要因素） 形成疏水環(huán)境。堿基配對(duì)的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽(yáng)離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上

6、的負(fù)電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。第14頁(yè)/共75頁(yè)三、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多型性P489 表13-6 A-、B-、Z-DNA的比較1、BDNA：典型的Watson-Crick雙螺旋DNA右手雙股螺旋每圈螺旋10.4個(gè)堿基對(duì)螺旋扭角36螺距：3.32nm堿基傾角：1生物體內(nèi)DNA均為BDNA。第15頁(yè)/共75頁(yè)2、A-DNA在相對(duì)濕度75%以下所獲得的DNA纖維。右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。3、Z-DNA左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA。第16頁(yè)/共75頁(yè)4、D

7、NA三股螺旋（H-DNA）DNA的三鏈結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)或調(diào)節(jié)位點(diǎn)。第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達(dá)。第17頁(yè)/共75頁(yè)四、四、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的不均一性二級(jí)結(jié)構(gòu)的不均一性1、反向重復(fù)序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心區(qū)域?yàn)閷?duì)稱軸，其兩側(cè)的堿基對(duì)順序正讀和反讀都相同。較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄的終止作用與回文結(jié)構(gòu)有關(guān)。較短的回文序列，可作為一種特別信號(hào)，如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。2、富含AT的序列很多有重要調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)段都富含AT堿基對(duì)。特別是在復(fù)制起點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的Pribn

8、ow區(qū)，富含AT對(duì)。第18頁(yè)/共75頁(yè)五、環(huán)狀DNA某些病毒DNA某些噬菌體DNA某些細(xì)菌染色體DNA細(xì)菌質(zhì)粒DNA真核細(xì)胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA第19頁(yè)/共75頁(yè)1、環(huán)狀DNA的不同構(gòu)象P491圖13-12 松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負(fù)超螺旋第20頁(yè)/共75頁(yè)（1）、松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化（2）、解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化（3）、正超螺旋與負(fù)超螺旋DNA正超螺旋：在一端使繩子向纏緊的方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來(lái)，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)左旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超螺旋叫正超螺旋。負(fù)超螺旋：在繩子一端向松弛方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來(lái)，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)右旋的超螺旋，以解

9、除外加的旋轉(zhuǎn)所造成的脅變，這樣的超螺旋稱負(fù)超螺旋。第21頁(yè)/共75頁(yè)2、環(huán)形DNA的拓?fù)鋵W(xué)特性以 2 6 0 b p 組 成 的 線 形 B - D N A 為 例 ， 螺 旋 周 數(shù)260/10.4=25。連環(huán)數(shù)（L）DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以L表示。松馳環(huán)：L=25解鏈環(huán)：L=23超螺旋：L=23第22頁(yè)/共75頁(yè)纏繞數(shù)（T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋數(shù)目，以T表示松馳環(huán)T=25解鏈環(huán)T=23超螺旋T=25超螺旋周數(shù)（扭曲數(shù)W）松馳環(huán)W=0解鏈環(huán)W=0超螺旋W= -2L=T+W第23頁(yè)/共75頁(yè)比連環(huán)差（）表示DNA的超螺旋程度=（LL0）/L

10、0L0是指松馳環(huán)形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般為-0.03-0.09，平均每100bp上有3-9個(gè)負(fù)超螺旋。負(fù)超螺旋DNA是由于兩條鏈的纏繞不足引起（L），很易解鏈，易于參加DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄等第24頁(yè)/共75頁(yè)Superhelix density=/=每一圈初級(jí)螺旋（10bp，360）出現(xiàn)超螺旋數(shù)不同生物的DNA分子的大小不同形成幾乎相同的超螺旋密度SV40 5226bp T=522 W=-26(L=496) =-0.05E.coli 4.2X106bp T=4.2X105 W=4.2X105X-0.05=-2X104一般天然DNA分子中=-0.05=5%負(fù)向超螺旋第25頁(yè)/

11、共75頁(yè)3、拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)體的L值。拓?fù)洚悩?gòu)酶酶I（擰緊）能使雙鏈負(fù)超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每一次作用可使L值增加1，同時(shí)，使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成正超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶酶II（擰松）能使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺旋形DNA，每次催化使L減少2，同時(shí)能使正超螺旋轉(zhuǎn)變成松馳DNA。第26頁(yè)/共75頁(yè)六、DNA的生物學(xué)功能首次直接證明DNA的遺傳功能的是Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 P342 14 Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第27頁(yè)/共75頁(yè)第28頁(yè)/共75頁(yè)第三節(jié)第三節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)一、RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)AMP、GMP、CMP、UMP通過(guò)3、5磷酸二酯鍵形成的線形

12、多聚體。 P484 圖13-3 RNA基本結(jié)構(gòu)第29頁(yè)/共75頁(yè)組成RNA的戊糖是核糖RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有堿基。天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是A-型雙螺旋結(jié)構(gòu)。第30頁(yè)/共75頁(yè)二、RNA的類型核糖體RNA： rRNA 轉(zhuǎn)運(yùn) RNA： tRNA信使 RNA： mRNA 核內(nèi)小RNA： snRNA （small nuclear RNA ） P344 表5-7 大腸桿菌中的RNA第31頁(yè)/共75頁(yè)三、tRNA的結(jié)構(gòu) 70-90b，分子量在25kd左右，沉降系數(shù)4S左右有較多稀有堿基 圖3末端為CpCpA-OH，用來(lái)接受活化的氨基酸，此末端稱接受末端

13、。5末端大多為pG或pC二級(jí)結(jié)構(gòu)是三葉草形 P496 圖46-18 tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（三葉草模型） 第32頁(yè)/共75頁(yè)第33頁(yè)/共75頁(yè)四、mRNA的結(jié)構(gòu)1、真核mRNA的結(jié)構(gòu)（1）、3-端有一段約30-300核苷酸的polyA。PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。polyA與mRNA半壽期有關(guān)，新合成的mRNA，其polyA較長(zhǎng)；而衰老的mRNA，其polyA較短。（2）、5-帽子P346 帽子結(jié)構(gòu)：第34頁(yè)/共75頁(yè)帽子結(jié)構(gòu)： 3-mG-5ppp5-Nm-3-P5末端的鳥嘌呤N7被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷酸與相鄰的一個(gè)核苷酸相連，形

14、成5-5-磷酸二酯鍵。帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。 可為核糖體提供識(shí)別位點(diǎn)，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。第35頁(yè)/共75頁(yè)2、原核mRNA的結(jié)構(gòu)（多順反子）由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒有5帽子和3polyA。SD序列：5端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5-AGGAGGU-3，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱SD序列。SD序列和核糖體16S的rRNA的3末端富含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)。第36頁(yè)/共75頁(yè)六、rRNA的結(jié)構(gòu)rRNA與核糖體蛋白結(jié)合一起構(gòu)成核糖體。大腸桿菌中有三

15、類rRNA：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA真核細(xì)胞有四類rRNA：5S rRNA，5.8S rRNA，8SrRNA28S rRNA P346 圖5-14 大腸桿菌 5S rRNA 結(jié)構(gòu)第37頁(yè)/共75頁(yè)第38頁(yè)/共75頁(yè)第四節(jié)第四節(jié)核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì)第39頁(yè)/共75頁(yè)一、解離性質(zhì)磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。DNA等電點(diǎn) 44.5RNA 等電點(diǎn) 22.5第40頁(yè)/共75頁(yè)二、水解性質(zhì)1、堿水解室溫，0.1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。 圖 在相同條件下，DNA不被水解。這是因?yàn)镽NA中C2-OH的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。DNA、RN

16、A水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義：DNA穩(wěn)定 ，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。第41頁(yè)/共75頁(yè)2、酶水解RNA水解酶 RNaseDNA水解酶 DNase核酸外切酶核酸內(nèi)切酶 ：限制性核酸內(nèi)切酶第42頁(yè)/共75頁(yè)三、光吸收性堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有強(qiáng)烈的光吸收，max=260nm1、鑒定純度純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。第43頁(yè)/共75頁(yè)2、含量計(jì)算1 ABS值相當(dāng)于：5

17、0ug/mL雙螺旋DNA 或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA） 或：20ug/mL核苷酸3、增色效應(yīng)與減色效應(yīng)P347 圖5-15 DNA的紫外吸收光譜 增色效應(yīng)：在DNA的變性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應(yīng)：在DNA的復(fù)性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)減小。第44頁(yè)/共75頁(yè)第45頁(yè)/共75頁(yè)四、沉降特性（DNA）不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心就可以將它們區(qū)分開來(lái)，這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。 P348 圖516 Cs-Cl密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA 相對(duì)沉降常數(shù)線型雙螺旋分子 1.00松馳雙鏈閉環(huán) 1.14切刻雙鏈環(huán) 1.14單鏈環(huán) 1.

18、14線型單鏈 1.30正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀 1.41坍縮 3.0第46頁(yè)/共75頁(yè)五、變性、復(fù)性1、變性核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。P350 圖5-18變性過(guò)程 因素 ：熱變性 酸堿變性（pH小于4或大于11） 變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 變性后 ：260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。 第47頁(yè)/共75頁(yè)第48頁(yè)/共75頁(yè)（1）、熔解溫度（Tm）：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度。濃度50ug/mL時(shí)，雙鏈DNA A260=1.00，完全變性（單鏈）A260= 1

19、.37當(dāng)A260增加到最大增大值一半時(shí)，即1.185時(shí)，對(duì)應(yīng)的溫度即為Tm。DNA的Tm一般在7085之間。第49頁(yè)/共75頁(yè)（2）、影響DNA的Tm值的因素DNA均一性 。 均一性高，熔解過(guò)程發(fā)生在很小的溫度范圍內(nèi)。G-C含量與Tm值成正比。測(cè)定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44 P351圖5-19 圖5-20 Tm值與GC含量的關(guān)系介質(zhì)中離子強(qiáng)度其它條件不變，離子強(qiáng)度高，Tm高。P351 圖5-21第50頁(yè)/共75頁(yè)第51頁(yè)/共75頁(yè)2、復(fù)性變性DNA在適當(dāng)（一般低于Tm2025）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。變性DNA在緩慢冷卻時(shí)可以復(fù)性，快速冷卻不能復(fù)性

20、。DNA片段越大，復(fù)性越慢；DNA濃度越大，復(fù)性越快。復(fù)性速度可用Cot衡量。Co為變性DNA原始濃度molL-1，t為時(shí)間，以秒表示。第52頁(yè)/共75頁(yè) P352 圖5-22，不同DNA的復(fù)性時(shí)間。1個(gè)核苷酸對(duì)（A.U），若濃度為Co=1.0m mol/L，則50%復(fù)性時(shí)， Cot1/2=410-6mol.s/L，t=0.004秒全部復(fù)性， Cot=10-4， t=0.1秒E.coli 4.2106堿基對(duì)，若濃度Co=1.0 umol/L，則復(fù)性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，約115天。復(fù)性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5108秒，5758天。復(fù)

21、性機(jī)制：10-20bp成拉鏈第53頁(yè)/共75頁(yè)第54頁(yè)/共75頁(yè)第五節(jié)第五節(jié)核酸研究技術(shù)核酸研究技術(shù)一、核酸的分離純化盡可能保持其天然狀態(tài)。條件溫和，防止過(guò)酸、過(guò)堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。第55頁(yè)/共75頁(yè)1、DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或鹽（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性質(zhì)，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。DNA核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。第56頁(yè)/共75頁(yè)2、RNA的制備（重點(diǎn)介紹mRNA的分離、純化）用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（R

22、NP）。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等必須防止RNA酶對(duì)RNA的破壞。第57頁(yè)/共75頁(yè)二、核酸的凝膠電泳1、瓊脂糖電泳 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對(duì)數(shù)成反比 凝膠濃度 DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。 電流，不大于5V/cm2、PAGE電泳第58頁(yè)/共75頁(yè)三、限制性核酸內(nèi)切酶（1979年發(fā)現(xiàn)）1、限制修飾系統(tǒng) 圖 第59頁(yè)/共75頁(yè)2、II型核酸內(nèi)切酶限制和修飾活性分開，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子Mg2+，位點(diǎn)序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（反向重復(fù)）。II型酶的切割頻率識(shí)別位點(diǎn) 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536 限制酶的命名：E.coRI第一位： 屬名E（大寫）第

23、二、三位：種名的頭兩個(gè)字母小寫co第四位： 菌株R第五位： 從該細(xì)菌中分離出來(lái)的這一類酶的編號(hào)第60頁(yè)/共75頁(yè)第61頁(yè)/共75頁(yè)同裂酶：來(lái)源不同的限制酶（名稱自然不同），識(shí)別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。 BamHI：GGATCC BstI GGATCCMboI GATC Sau3A GATC同尾酶：來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。BclI TGATCA BglII AGATCA 星號(hào)活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性pH，或50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識(shí)別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會(huì)發(fā)生變化。例如 HindIII AAGCT

24、T 第62頁(yè)/共75頁(yè)四、DNA物理圖譜及構(gòu)建（限制酶切圖譜、DNA酶切位點(diǎn)圖譜）在研究某一種DNA時(shí)，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此DNA的基礎(chǔ)。末端標(biāo)記法構(gòu)建DNA物理圖譜：（1）單酶完全降解和部分降解（2）雙酶降解 圖第63頁(yè)/共75頁(yè)五、分子雜交1、SouthernBlottingP353 圖5-23DNA樣品 酶切 電泳 變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影變性（NaOH 0.5mol/L）轉(zhuǎn)膜（NC膜）固定（80，4-6h）雜交（高鹽濃度，68，幾小時(shí)）Southern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的

25、大小和定位。可用DNA或RNA探針。第64頁(yè)/共75頁(yè)第65頁(yè)/共75頁(yè)2、NorthernBlotting研究對(duì)象是mRNA，探針一般是DNA?？俁NA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、WesternBlotting是研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。 抗原與抗體的雜交第66頁(yè)/共75頁(yè)六、DNA序列分析（一）（一）化學(xué)裂解法（化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert法）法）原理： 利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一標(biāo)記末端，而另一端是長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的片段群，然后將此片段群在能夠分辨長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸DNA片段的PAGE上分離。 第67頁(yè)/共75頁(yè) 32P-GC

26、TACGTA特異性化學(xué)裂解在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處： 32p ，32p-GCTAC在C處：32P-G和 32P-GCTA在T處：32P-GC和32P-GCTACG第68頁(yè)/共75頁(yè)硫酸二甲酯特異切割：G 甲酸特異切割：G和A肼在Nacl條件下切割：C 肼在無(wú) Nacl條件下切割：T和C32P *ACTTCGACAA硫酸二甲酯： *ACTTC 甲酸： *P *ACTTC*ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA肼（有Nacl）： *A *ACTT *ACTTCGA 肼（無(wú)Nacl）： *A *AC *ACT *ACTT*ACTTCGA從下往上讀：CTAC

27、GTA，末端G不能讀出。第69頁(yè)/共75頁(yè)（二）（二）雙脫氧終止法雙脫氧終止法英國(guó) Sanger 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu)， 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 1980 設(shè)計(jì)出DNA測(cè)序法， 1980 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)合成一段與待測(cè)DNA序列互補(bǔ)的DNA片段群。 第70頁(yè)/共75頁(yè)（三）（三）序列分析儀序列分析儀四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的ddNTP第71頁(yè)/共75頁(yè)七、DNA合成（探針、引物、基因）1、化學(xué)合成：固相合成法（亞磷酸三酯法）P353 合成過(guò)程合成方向：3 5端5-OH用二對(duì)甲氧三苯甲基（DMT）保護(hù)。3-OH用氨基磷酸化合物活化堿基上氨基用苯甲酸保護(hù) 保護(hù)： 5-OH、活化3-OH、保護(hù)所有NH2第72頁(yè)/共75頁(yè)第73頁(yè)/共75頁(yè)2、DNA的酶合成PCR模板DNA（單鏈）引物DNA聚合酶dATP、 dGTP、dCTP、dTTP 一定濃度的Mg2+合成方向：5 3端化學(xué)合成：方向3 5，不需DNA模板，酶。生物合成：方向5 3，需模板，引物，DNA聚合酶。第74頁(yè)/共75頁(yè)感謝您的觀看！第75頁(yè)/共75頁(yè)