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硫酸慶大霉素生產(chǎn)工藝 一、硫酸慶大霉素產(chǎn)品說明 1、產(chǎn)品名稱及化學結構 1.1產(chǎn)品名稱：硫酸慶大霉素（Gentamycin sulfate） 1.2化學結構： 1.2.1結構式： 2H2SO4 C1: R1=R2=CH3 C2: R1=CH3 R2=H C1a: R1=R2=H 1.2.2分子式： C1: C21H43N5O7=477.61 C2: C20H41N5O7=463.58 C3: C19H39N5O7=449.55 1.2.3分子量： C1: 477.61 C2: 463.58 C3: 449.55 C1、C2、C1a為硫酸慶大霉素的三個組分，各組分與2個分子的硫酸相結合，其成分折干效價為590/ml以上。 2、理化性質 2.1性狀：白色或類白色粉末，吸水性強，穩(wěn)定性高，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿等有機溶劑。 2.2比旋度：+1070～ +1210 3、產(chǎn)品質量標準 (查藥典) 二、原材料、包裝材料質量標準及規(guī)格 1、發(fā)酵部分 名 稱 規(guī) 格 葡萄糖 工業(yè)用：淡黃色粉末，含量70％以上，氯含量0.6％以下。 藥用（口服）：白色結晶，含量88％以上，氯含量0.25％以下。 淀 粉 工業(yè)用：含量80％以上，水分14％以下，氯含量0.1％以下，灰份1％以下，無發(fā)霉結塊。 黃豆餅粉 工業(yè)用：熱榨，淺黃色粉末，無發(fā)霉結塊，蛋白質37％以上，水分12％以下，灰份7％以下，酸值0.1N,KOH 15mg/g以下。細度80目90％以上。 蛋白胨 工業(yè)用：淺黃色粉末，總氮14％以上，水分7％以下，總磷0.3％以下。 魚粉 工業(yè)用：淺黃色粉末，無發(fā)霉變質現(xiàn)象，蛋白質含量50％以上，水分12％以下，含油量9％以下，總灰份≤ 3以下，無魚骨等特大物，60目90％以上。 碳酸鈣 工業(yè)用：輕質，白色粉末，含量96％以上，堿度≤0.2％,AS<5ppm 硝酸鉀 工業(yè)用：白色結晶，含量98％以上。 氯化鈷 化學純：紅紫色結晶，含量95％以上。 硫酸銨 工業(yè)用：白色結晶，含量96％以上 消沫劑 GP級：淺黃色澄明液體，酸值0.5以下。 玉米粉 食用：無霉變蟲蛀，細度60目90％以上。 豆 油 金黃色澄明液體，新鮮，酸值≤KOH 5mg/g 2、提取部分 名 稱 規(guī) 格 鹽 酸 工業(yè)用：無色或微黃色液體，含量30％以上。 液體燒堿 工業(yè)用：無色或微紫色液體，含量40％以上，NaCl含量低于5％。 氨 水 工業(yè)用：無色透明液體，含量95％以上。 活性炭 黑色粉末，PH中性，灰份≤5％，針用（767型）。脫色率90％以上。 732（17） 離子交換樹脂 工業(yè)用：強酸性陽離子交換樹脂，淡黃色或金黃色球狀顆粒，粒度16—50目占90％以上，水分50—60％，交換當量大于4.5毫克當量/克干樹脂。 711（2014） 離子交換樹脂 工業(yè)用：強堿性陰離子交換樹脂，淡黃色或金黃色球狀顆粒，粒度16—50目占90％以上，水分40—50％，交換當量大于3.0毫克當量/克干樹脂。 717（2017） 離子交換樹脂 工業(yè)用：強酸性陽離子交換樹脂，淡黃色或金黃色球狀顆粒，粒度16—50目占90％以上，水分40—60％，交換當量大于3.0毫克當量/克干樹脂。 氯化銨 藥用：白色結晶，含量不低于99.5％ 硫酸 化學純：無色透明液體，含量95％以上。 三、生產(chǎn)方法及原理簡介 硫酸慶大霉素的生產(chǎn)是以絳紅色小單孢菌（）2號作為慶大霉素生產(chǎn)用菌種，在蒸汽消毒的培養(yǎng)基中不斷擴大培養(yǎng)、發(fā)酵，通過菌種的次級代謝分泌出具有抑菌活性的慶大霉素。用離子交換樹脂提取出菌分泌的活性物質，經(jīng)精制、轉鹽生產(chǎn)出硫酸慶大霉素原料藥。用以制成各種硫酸慶大霉素制劑，應用于臨床治療。 四、硫酸慶大霉素生產(chǎn)工藝流程圖及操作條件 硫酸慶大霉素的生產(chǎn)過程主要包括以下四個部分：發(fā)酵生產(chǎn)、提取、精制、無菌壓縮空氣、無菌噴霧干燥。 1、 硫酸慶大霉素生產(chǎn)工藝流程圖： 35℃ 23hr 35℃ 35℃ 35℃ 種子瓶 一級種子罐 二級種子罐 發(fā)酵罐 250rpm 38hr 22hr 96hr 酸化 6 hr 放罐 732樹脂靜態(tài)吸附 過篩 飽和樹脂 漂洗 中和 漂去 酸洗 4.5％氨水 無NH4+ 效價 裝柱 解吸 濃縮 濃縮液 濃縮液 雜質 無鹽水洗 串711柱 15萬μ/ml 收率95％ 收率93％ H2SO4 活性炭 轉鹽液 脫色液 過濾 精濾 無菌噴粉 PH=4.0-6.0 脫色 收率89％ 收率85％ 2、生產(chǎn)工藝過程： 2.1菌種部分 接種 接種 35℃ 23hr 砂土管 種子斜面 種子瓶 生產(chǎn)用菌種 50rpm 2.1.1種子瓶配方（％）： 淀粉 1.0 碳酸鈣 0.3 硝酸鉀 0.05 玉米粉 1.5 黃豆餅粉 1.5 氯化鈷 1r/ml 魚粉 葡萄糖 0.1 蛋白胨 0.2 自來水配制，消前PH調至7.5 2.1.2種子瓶的制備 按種子瓶配方配制好培養(yǎng)基，裝入500ml搖瓶中，裝量50ml，用1kg/cm2 飽和蒸汽 120℃滅菌30分鐘，冷卻備用。 2.1.3接種子瓶 在超凈工作臺上，火焰保護下，用蒸汽消過毒的無菌接種鏟挖取斜面孢子0.5cm2于種子瓶中，放于搖床上，35℃0.5℃培養(yǎng)40小時左右，涂片觀察菌絲形態(tài)，形態(tài)為大菊花團邊緣已經(jīng)散開，即可下瓶作為生產(chǎn)用種。 2.2發(fā)酵部分： 2.2.1種子罐及發(fā)酵罐配方： 罐 號 名 稱 一級種子罐 二級種子罐 發(fā)酵罐 補料 淀 粉 1.0 1.0 4.5 4.5 黃豆餅粉 1.5 2.0 3.0 3.0 蛋白胨 0.2 0.4 0.4 葡萄糖 0.1 1.0 0.5 0.5 魚 粉 0.2 0.2 玉米粉 1.5 1.5 1.0 1.0 硝酸鉀 0.05 0.02 0.05 0.05 碳酸鈣 0.3 0.5 0.6 0.6 氯化鈷 1r/ml 4r/ml 6r/ml 6r/ml 硫酸銨 0.05 0.05 豆 油 0.3 0.2 0.2 0.2 消前PH 7.5 7.5 7.5 7.5 【注】補料配方同發(fā)酵罐。 2.2.2一級種子罐（消后體積250L） 空罐消毒：壓力 1.5～2.0kg/cm2 溫度 125～130℃ 保溫保壓 40分鐘 實罐消毒：壓力 1.0 kg/cm20.1kg/cm2 預熱時間30分鐘為宜 溫度 119～122℃ 保溫保壓 30分鐘 分過濾器消毒：壓力 1.2～1.4kg/cm2 保溫、保壓30分鐘 按一級種子罐配方配好培養(yǎng)基，移入一級種子罐內攪拌后，直接進蒸汽進行實罐消毒，消后體積250L，降溫至35℃后，在火焰的保護下，利用壓差法將種子接入一級種子罐內，接種量5～6瓶，進行培養(yǎng)。 培養(yǎng)溫度：35℃ 罐壓：0.4 kg/cm2 培養(yǎng)時間：38小時 通氣量：1：0.5 V/V/分以上 攪拌轉速：200～220轉/分 移種標準：菌絲形態(tài)呈菊花團邊緣全部散開或呈網(wǎng)狀，無雜菌。 2.2.3二級種子罐：（消后體積1.5T） 空罐消毒、實罐消毒及分過濾器消毒均同一級種子罐。移種管道消毒為2～3 kg/cm2 保壓2小時。 按二級種子罐配方配好培養(yǎng)基，移入二級種子罐內攪拌后，直接進蒸汽進行實罐消毒，消后體積1.5L，降溫至35℃后，通過移種管道將一級種子罐的成熟種子移入，進行培養(yǎng)。 培養(yǎng)溫度：35℃ 罐壓：0.3 kg/cm2 培養(yǎng)時間：22小時 通氣量：1：0.8 V/V/分以上 攪拌轉速：200～220轉/分 移種標準：菌絲形態(tài)呈網(wǎng)狀，量多無雜菌。 2.2.4發(fā)酵罐：（消后體積10T） 空罐消毒：壓力 1.5～2.0kg/cm2 溫度 125～130℃ 保溫、保壓 30分鐘 實罐消毒：壓力 1.0 kg/cm20.1kg/cm2 預熱時間30～45分鐘為宜 溫度 119～122℃ 保溫、保壓 30分鐘 分過濾器消毒：壓力 1.2～1.4kg/cm2 保溫、保壓35分鐘 移種管道消毒：2～3 kg/cm2 保壓2小時。 按發(fā)酵罐配方配好培養(yǎng)基，移入罐內攪拌后，直接進蒸汽進行實罐消毒，消后體積10T，降溫至35℃后，通過移種管道接入二級種子罐內的種子，進行發(fā)酵培養(yǎng)。 培養(yǎng)溫度：35℃ 罐壓：24小時前0.2 kg/cm2，24小時后0.1 kg/cm2 通氣量：1：1.2 V/V/分以上 攪拌轉速：不少于170轉/分。 發(fā)酵罐補料：（總補料量26T） 第一個補料很關鍵，必須在發(fā)酵液泡沫下去后（大約18小時）菌絲生長良好，無雜菌，可補3T。 第二個補料：23～25小時 補料4T 第三個補料：28～30小時 補料5T 第四個補料：35～40小時 補料5T 第五個補料：41～45小時 補料6T 第六個補料：52～55小時 補料6T或酌情補入。 如果以上菌絲濃度偏高，第六個補料可考慮補稀方（即原方的1/2） 放罐標準： 發(fā)酵周期：96小時左右 發(fā)酵單位上升遲緩或不在上升 PH有回升趨勢 2.3提取部分 2.3.1酸化中和 將放罐發(fā)酵液放入發(fā)酵罐，加鹽酸酸化至PH1.5～2.0，然后加工業(yè)用NaOH中和至PH6.4～6.8，酸化可使慶大霉素由菌絲中充分溶出，中和有利于732樹脂的吸附。 2.3.2 732樹脂靜態(tài)吸附 中和后的發(fā)酵液按6萬μ/ml樹脂的交換容量，投人銨型732樹脂攪拌吸附6～7小時，測廢液單位在20μ/m1以下，過60目振蕩篩分離樹脂，樹脂抽入漂洗柱，反沖漂洗干凈。 2.3.3飽和樹脂的洗滌，解吸及脫色： 飽和樹脂裝人樹脂柱，先用自來水反沖洗至無懸浮物，然后用0.4N HCl正向沖洗，流速1/20V/分鐘（每分鐘流樹脂體積的1/20），約洗樹脂體積的20－30倍量，洗至無Ca2+、Mg2+后（以NaOH檢查），再用無鹽水沖至無Cl－。再通人4.5％的氨水進行解吸，流速上1/100V/分鐘，至流出液PH＝ 7.0時與711樹脂柱串聯(lián)，收集樹脂體積的8倍量，流出單位在 300μ/ml以下之后，9～10倍量作下次解吸氨水套用。 2.3.4薄膜濃縮 解吸流出液約半倍量后，開始濃縮，濃縮過程中蒸汽壓力。不超過0.5kg/cm2，真空度在600mmHg以上，濃縮2－3遍后， 用萘氏試劑檢查濃縮液應無NH4＋，濃度達到6Be(波美度)，化學效價15萬μ/ml左右，以備轉鹽、碳脫, 壓入炭脫罐。 2.4 精制部分（轉鹽、炭脫、過濾） 加入的濃縮液進行攪拌，用12N的H2SO4調PH6.0～6.2，加濃縮液體積的7％左右的活性炭進行脫色，溫度為65～75℃，歷時60～90分鐘，趁熱減壓過濾，脫色液透光度95％以上，效價15萬μ/ml左右，經(jīng)PE管精濾器過濾，用于水針劑的制備或用于無菌噴霧干燥。 2.5無菌噴粉部分: 根據(jù)《藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范，GMP》的要求，對原料藥生產(chǎn)的精、烘、包工序必須采用潔凈技術設計，設立控制區(qū)（潔凈度100000級）、潔凈區(qū)（潔凈度10000級），局部采用100級層流凈化。并按照GMP要求進行生產(chǎn)管理。在無菌噴霧干燥過程中，所有進入系統(tǒng)的物料、空氣、人員、設備等都必須按規(guī)定凈化、消毒，產(chǎn)品的收集也必須在100級層流保護下進行。 無菌噴粉工藝流程 精制好的硫酸慶大霉素濃縮液，按10萬μ/ml配制后，經(jīng)過濾除菌，用轉子流量計15L/小時送至噴霧干燥塔。 霧化濃縮液的壓縮空氣經(jīng)冷卻，分離油水，過濾除去細菌和異物后送至噴霧干燥塔，壓力0.9～1.0 kg/cm2。 干燥用熱空氣經(jīng)預過濾，加熱，中效過濾和高效過濾后得到凈化熱空氣進入噴霧干燥塔，進口溫度120～130℃，出口溫度70～80℃。干燥后，熱空氣和成品自噴霧干燥塔出口送至旋風分離器，經(jīng)分離得到硫酸慶大霉素無菌粉，在100級層流保護下用玻璃瓶收集，尾氣經(jīng)袋濾器過濾后排空。 工藝流程中，自中效過濾器開始，整個系統(tǒng)在正壓下操作，以防止外界非凈化空氣侵入系統(tǒng)。 2.6無菌壓縮空氣部分 2.6.1原理簡介 好氧微生物在培養(yǎng)過程中，需要大量的氧氣，以滿足微生物的生長、繁殖以及代謝的需要。這些氧氣通常是由空氣提供的?？諝庵饕怯傻獨?、氧氣、二氧化碳、惰性氣體、水蒸氣以及懸浮在空氣中的塵埃等組成的混合物?？諝庵泻写罅康奈⑸?。見表 表 空氣中常見的微生物種類及其大小 微 生 物 寬(μm) 長(μm) 產(chǎn)氣桿菌 1.0～1.5 1.0～2.5 蠟狀芽孢桿菌 1.3～2.0 8.1～25.8 普通變形桿菌 0.5～1.0 1.0～3.0 地衣芽孢桿菌 0.5～0.5 1.8～3.3 巨大芽孢桿菌 0.9～2.1 2.0～10.0 覃狀芽孢桿菌 0.6～1.6 1.6～13.6 枯草芽孢桿菌 0.5～1.1 1.6～4.8 普通變性桿菌 0.5～1.0 1.0～3.0 金黃小球菌 0.5～1.0 0.5～1.0 酵 母 菌 3.0～5.0 5.0～19.0 病 毒 0.0015～0.225 0.0015～0.28 霉狀分枝桿菌 0.6～1.6 1.6～13.6 空氣中的微生物是依附在塵埃上的，空氣中的塵埃數(shù)與細菌數(shù)的關系式如式1－1和圖 y=0.003x-2.6 1—1 空氣中的塵埃濃度與微生物數(shù)量的關系 空氣過濾除菌就是對空氣進行預處理，去處油、水的干擾，維持一定的氣流速度，保持過濾器在比較高的效率下進行過濾，以截留空氣中所含微生物，取得無菌空氣。 2.6.2空氣過濾除菌流程： 這種兩級冷卻、加熱除菌流程，是一個比較完善的空氣除菌流程，可適應各種氣候條件，能充分地分離油水，使空氣達到低的相對濕度下進入過濾器，以提高過濾效率。該流程的特點是兩次冷卻、兩次分離、適當加熱。兩次冷卻、兩次分離油水的好處是能提高傳熱系數(shù)，節(jié)約冷卻用水，油水分離得比較完全。經(jīng)第一次卻器冷卻后，大部分的水、油都已結成較大的霧粒，且霧粒濃度較大，故適宜用旋風分離器分離。第二冷卻器使空氣進一步冷卻后析出一部分較小霧粒，宜采用絲網(wǎng)分離器分離，這樣發(fā)揮絲網(wǎng)能夠分離較小直徑的霧粒和分離效果高的作用。第上級冷卻到30～35℃，第二級冷卻到20～25℃。除水后，空氣的相對濕度仍是100％，須用絲網(wǎng)分離器后的加熱器加熱，將空氣中的相對濕度降低至50％～60％，以保證過濾器的正常運行。 兩級冷卻、加熱除菌流程尤其適用于潮濕的地區(qū)，其他地區(qū)可根據(jù)當?shù)氐那闆r，對流程中的設備作適當?shù)脑鰷p。 思考題 1、 硫酸慶大霉素產(chǎn)品質量標準有哪些檢測項目組成？ 2、 怎樣進行發(fā)酵罐空罐消毒和實罐消毒？ 3、 簡述壓縮空氣的過濾除菌流程 4、 簡述無菌噴粉的工藝流程 5、簡述硫酸慶大霉素生產(chǎn)工藝流程圖