基因工程-5-重組DNA構(gòu)建與篩.ppt
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三重組DNA分子構(gòu)建與篩選,一、粘末端DNA片段的連接,(一)具有相同粘末端的連接,,,,(二)具有不同粘性末端的連接用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和外源DNA進(jìn)行切割后,在它們兩端會(huì)產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端,經(jīng)DNA連接酶連接后即產(chǎn)生定向重組體。,HindIII,二、平末端DNA片段的連接,(一)直接用T4連接酶連接,(二)同聚物加尾法,優(yōu)點(diǎn):接“尾”后的載體不能自身環(huán)化,提高了轉(zhuǎn)化效率。缺點(diǎn):①可能改變目的基因或載體的閱讀框,影響外源DNA表達(dá)②外源DNA無法收回,(三)銜接物連接法,銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10~12個(gè)核苷酸組成,具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。,(四)DNA接頭連接法接頭的一端是齊平的,而另一端是某種內(nèi)切酶的粘性末端,(五)PCR引入酶切位點(diǎn),防止載體自身環(huán)化的措施1、堿性磷酸酶脫磷酸基法2、雙酶切法3、過量法:基因片段:載體(5:1or10:1),,三、重組DNA連接注意事項(xiàng),第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌轉(zhuǎn)化、電激法二、重組DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法載體介導(dǎo)、基因槍法三、重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)染,一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌,(一)轉(zhuǎn)化,將外源DNA分子導(dǎo)入某一宿主細(xì)菌細(xì)胞的過程都叫轉(zhuǎn)化。,為了有效地使細(xì)菌吸收外源的DNA分子,我們通常要對(duì)它們進(jìn)行一些物理或化學(xué)的處理,處理后的細(xì)胞吸收外源DNA的能力大大提高,被稱為感受態(tài)細(xì)胞。,1、轉(zhuǎn)化過程E.coli:感受態(tài)細(xì)胞+重組DNA分子加入LB擴(kuò)增涂布選擇性平板,,,,,,2、DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞過程①吸收:DNA分子吸附于受體菌表面②轉(zhuǎn)入:雙鏈DNA分子解鏈,單鏈DNA進(jìn)入,另一條鏈降解③自穩(wěn):進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的單鏈又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA④表達(dá):目的基因隨載體同時(shí)被復(fù)制,轉(zhuǎn)錄,翻譯,3、質(zhì)粒DNA的大小及構(gòu)型對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響,(1)大?。?0Kb,轉(zhuǎn)化效率很低(2)構(gòu)型超螺旋>環(huán)形>線狀,熱激法(HeatShockMethod),(三)電激法(electroperation),電激法是利用高壓電脈沖的作用對(duì)原生質(zhì)體或細(xì)胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法。,可逆擊穿:擊穿小孔可在一定時(shí)間內(nèi)復(fù)原。,不可逆擊穿:擊穿小孔不可修復(fù),處理細(xì)胞成活率低。,1.電轉(zhuǎn)化流程,(1)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備,(2)電轉(zhuǎn)化操作程序電擊復(fù)蘇涂布,(3)電擊杯清洗,二、重組DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法,(一)載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法,1、共培養(yǎng)法(cocultivation),(1)原生質(zhì)體共培養(yǎng)法,取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛長出細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng),促使農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。,,,(2)葉盤共培養(yǎng)法,優(yōu)點(diǎn):適用性廣,對(duì)于那些能被農(nóng)桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。,2、活體接種(inoculationinvivo),(1)基因槍法,80年代末期,由康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出,主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限。,該方法是利用一種物理儀器裝置,將鎢、金等金屬微粒加速?zèng)_擊細(xì)胞,把細(xì)胞擊孔,使目的基因進(jìn)入受體。,,,基因槍所用材料:(1)鎢粉使用起來經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果;但容易被氧化,顆粒易聚集,并且對(duì)植物細(xì)胞的毒害也比金粉大。,(2)將DNA包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等,但多用前兩種。,(3)所用動(dòng)力系統(tǒng):火藥爆炸力電弧放電高壓氣體,基因槍法的特點(diǎn):(1)轉(zhuǎn)化效率高。,(2)受體廣泛。,(3)操作簡單。,(2)微注射法(micro-injection),微量注射:用注射針或微針在受體細(xì)胞或組織穿刺成孔,DNA隨穿刺孔進(jìn)入細(xì)胞或隨穿刺針頭—道進(jìn)入。,顯微注射:利用顯微注射儀,通過機(jī)械方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。,,常用的細(xì)胞固定方法有3種:一、瓊脂糖包埋法二、多聚賴氨酸粘連法三、吸管支持法,(2)DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染技術(shù),(3)電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù),(4)脂質(zhì)體載體法,(5)細(xì)胞核的顯微注射法,三、重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法,(1)磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù),(6)活體電穿孔技術(shù),(6)活體電穿孔技術(shù),活體電穿孔法(invivoelectroporation)是將外源基因通過電場作用,導(dǎo)入動(dòng)物目標(biāo)組織或器官。,活體電穿孔法的特點(diǎn):靶器官的選擇面廣對(duì)導(dǎo)入的外源基因片段的大小沒有限制,從幾KB或十幾KB的表達(dá)載體,到100~200KB的YAC、BAC基因組,都有成功導(dǎo)入并獲得表達(dá)的報(bào)道?;铙w電穿孔法操作簡單快速,電穿孔的時(shí)間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作。,活體電穿孔法在基因治療方面的應(yīng)用,腦瘤的治療人單核細(xì)胞趨化物蛋白基因到大鼠腦瘤治療機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病骨骼肌導(dǎo)入促紅細(xì)胞生成素基因,第四節(jié)重組DNA分子的篩選,外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可能的三種情況:,,,,,,,,,,(1),(2),(3),,,,,,,,,,,,轉(zhuǎn)化,E.coli,一、重組體的篩選,遺傳檢測方法抗藥性標(biāo)記插入失活β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)免疫化學(xué)方法放射性抗體檢測核酸雜交方法轉(zhuǎn)譯篩選法,(一)遺傳檢測方法原理:根據(jù)載體DNA分子上的篩選標(biāo)記賦予受體細(xì)胞在篩選平板上表型的變化。如抗藥性引起生長與不長;顏色變化等。方法:①插入失活抗生素平板篩選法(pBR322系統(tǒng))由于外源DNA的插入引起抗藥性失活——插入失活,插入失活-環(huán)絲氨酸篩選法,,,,,,四環(huán)素+環(huán)絲氨酸,氨芐青霉素,②放射免疫篩選法1.放射免疫篩選過程A、制備抗原:培養(yǎng)菌落(噬菌斑)B、制備抗體:免疫動(dòng)物C、抗原抗體反應(yīng)D、檢測:放射自顯影E、選出重組體,,,2.放射免疫篩選法優(yōu)點(diǎn):①可以選出無表型特征的克隆3.放射免疫篩選法缺點(diǎn):①必須是表達(dá)載體②需要放射性物質(zhì)——同位素:污染昂貴,,,,(三)核酸雜交方法,探針(probe):用來探知被測物存在的小分子DNA或RNA。,標(biāo)記物:探針上結(jié)合的易被檢測的化合物。,分子雜交(molecularhybridization):探針DNA或RNA與被測物的互補(bǔ)結(jié)合叫分子雜交。,一、基本概念,二、核酸探針類型,雙鏈DNA探針DNA探針核酸探針單鏈DNA探針RNA探針單鏈RNA探針放射性標(biāo)記探針探針標(biāo)記非放射性標(biāo)記探針,,,,核酸探針的類型和稱謂常有以下幾種:,非放射性標(biāo)記原理,,三、菌落原位雜交,菌落生長轉(zhuǎn)移到NC膜上DNA釋放和變性固定雜交洗膜放射自顯影查找陽性克隆,四、斑點(diǎn)雜交(Dotblot),模板制備點(diǎn)膜固定雜交洗膜放射自顯影查找陽性克隆,四、斑點(diǎn)雜交(Dotblot),五、轉(zhuǎn)譯篩選法,無細(xì)胞翻譯系統(tǒng),1、雜交阻斷轉(zhuǎn)譯,要求:被研究的目的基因編碼有豐富的mRNA。,原理:,,2、雜交釋放轉(zhuǎn)譯,- 1.請仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對(duì)于不預(yù)覽、不比對(duì)內(nèi)容而直接下載帶來的問題本站不予受理。
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