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復習舊知識1、腐乳的制作用的是什么微生物？細胞結構？生殖方式？代謝類型？2、腐乳的前期發(fā)酵的目的是什么？時間多長？3、腐乳制作過程中有哪些措施可以預防雜菌污染？,2、前期發(fā)酵的作用，一是使豆腐表面有一層菌膜包住，形成腐乳的“體”；二是毛霉分泌以蛋白酶為主的各種酶，有利于豆腐所含有的蛋白質水解為各種氨基酸。后期發(fā)酵主要是酶與微生物協(xié)同參與生化反應的過程。通過腌制并配入各種輔料（紅曲、面曲、酒釀），使蛋白酶作用緩慢，促進其他生化反應，生成腐乳的香氣。,泡菜的制作,金湖二中生物教研組,泡菜是一種以濕態(tài)發(fā)酵方式加工制成的浸制品，為泡酸菜類的一種。泡菜制作容易，成本低廉，營養(yǎng)衛(wèi)生，風味可口，利于貯存。在我國四川、東北、湖南、湖北、河南、廣東、廣西等地民間均有自制泡菜的習慣。目前較受歡迎的是川味和韓味泡菜，在許多風味餐館里，都有其蹤影，它鮮嫩清脆，可以增進食欲，幫助消化與吸收。如果自己在家也做一些這樣的泡菜，做為每天飯前小菜，或以它配菜，烹成各種菜肴，不失為一件美事。但是泡菜含亞硝酸鹽具制癌作用危害身體健康，所以不易多吃,基礎知識(一)乳酸菌發(fā)酵,2）乳酸菌形態(tài)、結構,常見的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌,原核細胞(你認為有哪些結構？),乳酸菌種類很多，在自然界中分布廣泛，空氣、土壤、植物體表、人或動物的腸道內都有乳酸菌的分布。,1）乳酸菌自然界分布,在無氧的情況下，將葡萄助分解成乳酸異養(yǎng)厭氧型,3）乳酸菌發(fā)酵原理（代謝類型）,思考并回答：1、你能寫出乳酸菌分解葡萄糖的反應式嗎？2、用乳酸桿菌制作酸奶時，牛奶的營養(yǎng)和能量會發(fā)怎樣的變化？為什么？3、把100毫升的牛奶分別放入100、200、300、400毫升的容器中進行乳酸發(fā)酵，最先發(fā)酵成功的是哪個？你能說出理由嗎？5、你能說出乳酸桿菌與酵母菌的異同嗎?,基礎知識(一)乳酸菌發(fā)酵,亞硝酸鹽分布列舉：蔬菜中亞硝酸鹽的平均含量約為4mg/Kg，咸菜中亞硝酸鹽的平均含量在7mg/Kg以上，而豆粉中平均含量可達10mg/Kg。,1）亞硝酸鹽的有關知識：,基礎知識（二）亞硝酸鹽,亞硝酸鹽(包括亞硝酸鉀和亞硝酸鈉)為白色粉末，易溶于水，在食品生產中用作食品添加劑。自然界中，亞硝酸鹽分布廣泛。,2）我國食品衛(wèi)生標準規(guī)定的亞硝酸鹽含量標準,亞硝酸鹽一般不會危害人體健康，但是，當人體攝入的亞硝酸鹽總量達到0.3～0.5g時，會引起中毒，達3g時會引起死亡。,我國衛(wèi)生標準規(guī)定，亞硝酸鹽的殘留量在肉制品中不得超過30mg/Kg，醬腌菜中不超過20mg/Kg，而嬰兒奶粉中不得超過2mg/Kg。,3）亞硝酸鹽的危害,基礎知識（二）亞硝酸鹽,思1：為什么含有抗生素的牛奶不能發(fā)酵成酸奶？,答：酸奶的制作依靠的是乳酸菌的發(fā)酵作用?？股啬軌驓⑺阑蛞种迫樗峋纳L，因此含有抗生素的牛奶不能發(fā)酵成酸奶。,基礎知識（二）亞硝酸鹽,膳食中的絕大多數(shù)亞硝酸鹽在人體內以“過客”的形式隨尿排出，只有在特定的條件下（適宜的PH、溫度和一定的微生物作用），才會轉變成致癌物——亞硝胺。大量動物實驗表明，亞硝胺具有致癌作用，同時對動物具有致畸和致突變作用。研究表明，人類的某些癌癥可能與亞硝胺有關。,問1：人類的某些癌癥可能與亞硝酸鹽有什么關系？,問2：你能設計實驗證明亞硝胺能使動物細胞發(fā)生癌變嗎？,基礎知識（二）亞硝酸鹽,思2：為什么日常生活中要多吃新鮮蔬菜，不吃存放時間過長、變質的蔬菜？,答：有些蔬菜，如小白菜和蘿卜等，含有豐富的硝酸鹽。當這些蔬菜放置過久發(fā)生變質（發(fā)黃、腐爛）或者煮熟后存放太久時，蔬菜中的硝酸鹽會被微生物還原成亞硝酸鹽，危害人體健康。,基礎知識（二）亞硝酸鹽,請你根據(jù)實驗流程示意圖和提供的資料（P10），思考有關問題，然后進行實驗設計，并寫出詳細的實驗方案。,實驗設計,1、材料、器具、步驟、條件等？2、如何制作泡菜？3、如何提取泡菜亞硝酸鹽、怎樣測定等？,實驗設計,[資料一]泡菜的制作按照清水與鹽的質量比為4：1的比例配制鹽水，將鹽水煮沸冷卻。將經(jīng)過預處理的新鮮蔬菜混合均勻，裝入泡菜壇內，裝至半壇時，放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，續(xù)裝至八成滿，再徐徐注入配置好的鹽水，使鹽水沒過全部菜料，蓋好壇蓋。在壇蓋邊沿的水槽中注滿水，以保證壇內乳酸菌發(fā)酵所需的無氧環(huán)境。在發(fā)酵過程中要注意經(jīng)常補充水槽中的水。發(fā)酵時間長短受室內溫度的影響。,[資料二]測定亞硝酸鹽含量的原理在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與（對氨基苯磺酸）發(fā)生重氮化反應后，與（N－1－萘基乙二胺鹽酸鹽）結合生成玫瑰紅溶液。將經(jīng)過反應顯色后的待測樣品與已知濃度的標準液進行目測比色，即可大致估算出樣品中的亞硝酸鹽含量。我們還學過哪些顏色反應？,實驗設計,思3：為什么泡菜壇內有時會長一層白膜，這層白膜是怎么形成的？,形成白膜是由于產膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厭氧微生物，泡菜發(fā)酵液營養(yǎng)豐富，其表面氧氣含量也很豐富，適合酵母菌的繁殖。,泡菜壇本身質地好壞對泡菜與泡菜鹽水有直接影響，故用于泡菜的壇子應經(jīng)嚴格檢驗，其優(yōu)劣的區(qū)分方法如下：①觀型體:泡菜壇以火候老、釉質好、無裂紋、無砂眼、形體美觀的為佳。②看內壁:將壇壓在水內，看內壁，以無砂眼、無裂紋、無滲水現(xiàn)象的為佳。③視吸水:壇沿摻入清水一半，用廢紙一卷，點燃后放壇內，蓋上壇蓋，能把沿內水吸干（從壇沿吸入壇蓋內壁）的泡菜壇質量較好，反之則差。④聽聲音:用手擊壇，聽其聲，鋼音的質量則好，空響、砂響、音破的質次。,操作提示（一）泡菜壇的選擇,,腌制過程中，要注意控制腌制的時間、溫度和食鹽的用量。溫度過高、食鹽用量不足10％、腌制時間過短，容易造成細菌大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。一般在腌制10天后，亞硝酸鹽的含量開始下降。,操作提示（二）腌制條件,關注：在腌制后的前6天內，泡菜中的亞硝酸鹽含量就可以達到最高峰。而第9天后泡菜中的亞硝酸鹽含量開始有明顯下降。這可能是由于泡菜在開始腌制時，壇內環(huán)境有利于某些細菌的繁殖（包括一些硝酸鹽還原菌），這些細菌可以促進硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。但隨著腌制時間的延長，乳酸細菌也大量繁殖，對硝酸鹽還原菌產生一定的抑制作，使其生長繁殖受到影響，造成泡菜中亞硝酸鹽的含量又有所下降。,思考2、用水封閉壇口起什么作用？不封閉有什么結果？,水封閉壇口起著使壇內與壇外空氣隔絕的作用，空氣中21％是氧氣，這是最簡易的造成無氧環(huán)境的方法。這樣，壇內可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌進行乳酸發(fā)酵。如不封閉，則會有許多需氧菌生長，蔬菜會腐爛。說出壇內微生物的代謝類型的變化情況。,思考1、加入白酒有什么作用？,白酒可抑制泡菜表面雜菌的生長，它也是一種調味劑，可增加醇香感。,1.配制溶液對氨基苯磺酸溶液：稱取0.4克對氨基苯磺酸，溶解于100ml體積分數(shù)為20％的鹽酸中，避光保存(4mg/ml)。N－1－萘基乙二胺鹽酸鹽溶液：稱取0.2克N-1－萘基乙二胺鹽酸鹽，溶解于100ml的水中，避光保存(2mg/ml)。亞硝酸鈉溶液：稱取0.10克于硅膠干燥器中干燥24小時的亞硝酸鈉，用水溶解至500ml，再轉移5ml溶液至200ml容量瓶，定容至200ml(5ug/ml)（如何計算）提取劑：分別稱取50克氯化鎘、氯化鋇，溶解于1000ml蒸餾水中，用鹽酸調節(jié)pH至1。氫氧化鋁乳液和2.5mol/l的氫氧化鈉溶液。,操作提示(三)測定亞硝酸鹽含量的操作,2.配制標準顯色液（注意：加入幾種液體和順序）,1用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml亞硝酸鈉溶液（相當于1μg、2μg、3μg、4μ、g5μ、g7.5μg），分別置于50ml比色管中，再取1支比色管作為空白對照。2在7支試管中分別加入2.0ml對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5分鐘。3再分別加入1.0mlN－1－萘基乙二胺鹽酸鹽溶液，4加蒸餾水至50ml，混勻，觀察亞硝酸鈉溶液顏色的梯度變化。,操作提示(三)測定亞硝酸鹽含量的操作,3.制備樣品處理液（注意：所加液體和程序）1將3壇泡菜做好標記后，分別稱取0.4千克泡菜，用榨汁機粉碎，過濾得到約200ml汁液。（如何獲得汁液？）2取其中100ml轉移至500ml容量瓶中，加200ml蒸餾水、100ml提取劑（BaCl2+CdCl2），在搖床上振蕩提取1h，再加入40ml氫氧化鈉溶液，用蒸餾水定容至500ml后，立即過濾。3將60ml濾液轉移至100ml容量瓶中，加入氫氧化鋁乳液（制備的氫氧化鋁膠體能吸附泡菜汁液中的雜質，使泡菜汁透明澄清，以便進行后續(xù)的顯色反應。），定容至100ml，過濾。此時，濾液變得無色透明。得樣品處理液。,操作提示(三)測定亞硝酸鹽含量的操作,操作提示(三)測定亞硝酸鹽含量的操作,4.比色吸取40ml透明澄清的濾液，轉移到50ml比色管中，將比色管做好標記。按步驟2的方法分別加入對氨基苯磺酸溶液和N－1－萘基乙二胺鹽酸鹽溶液，并定容至50ml，混勻，靜置15分鐘后，觀察樣品顏色的變化，并與標準顯色液比較，找出與標準液最相近的顏色，記錄對應的亞硝酸鈉含量，并計算。每隔2天測一次，將結果記錄下來。,操作提示(三)測定亞硝酸鹽含量的操作,操作提示(三)測定亞硝酸鹽含量的操作,三只泡菜壇中的亞硝酸鹽含量變化的絕對數(shù)量雖然不同，但整體的變化趨勢卻基本相同。在腌制后的第五天，三只泡菜壇中亞硝酸鹽的含量都達到最高峰（分別達到0.6mg/kg、0.2mg/kg、0.8mg/kg），為什么不同的壇內的亞硝酸鹽的含量不同？,你能根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，繪制亞硝酸鹽含量隨腌制時間而變化的相關的曲線圖嗎？,實驗結果分析與評價,1．你能否用顯微鏡觀察到腌制泡菜的鹽水中乳酸菌的形態(tài)結構特征?2．你腌制的泡菜成功嗎?色澤如何?口味如何?亞硝酸鹽的含量是否符合標準？3．隨著泡制時間的延長，三只泡菜壇中亞硝酸鹽含量的變化趨勢如何?你能分析形成這種趨勢的原因嗎?4．結合亞硝酸鹽含量的變化趨勢，分析在泡菜的腌制過程中，什么時候食用最好?為什么?5．制作方法有需要改進的地方嗎?,（一）泡菜腌制的質量如何可以根據(jù)泡菜的色澤和風味進行初步的評定，還可以在顯微鏡下觀察乳酸菌形態(tài)，比較不同時期泡菜壇中乳酸菌的含量。,實驗結果分析與評價,（二）亞硝酸鹽含量的測定配制的亞硝酸鹽標準使用液與樣品液顯色后，目測比色效果如何，是否與標準液的濃度相吻合。如果不吻合，還應在已知濃度范圍內，改變濃度梯度，進一步配制標準使用液。,（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄在實驗進行過程中，應及時對泡菜中亞硝酸鹽含量進行鑒定，比較不同時期亞硝酸鹽含量的變化及其對泡菜質量的影響。,課題延伸1．你能否在查閱資料的基礎上，設計利用乳酸菌發(fā)酵制作酸奶的實驗?2．制作酸奶的過程中是否會產生亞硝酸鹽?請設計實驗方案，用來檢驗自己的假設。,課題延伸,P12練習22.答：果酒的制作主要利用的是酵母菌的酒精發(fā)酵，果醋的制作利用的是醋酸菌將酒精轉變?yōu)榇姿岬拇x，腐乳的制作利用的主要是毛霉分泌的蛋白酶等酶類，泡菜的制作利用的是乳酸菌的乳酸發(fā)酵。傳統(tǒng)發(fā)酵技術都巧妙地利用了天然菌種，都為特定的菌種提供了良好的生存條件，最終的發(fā)酵產物不是單一的組分，而是成分復雜的混合物。,參考資料：泡菜發(fā)酵的階段泡菜在發(fā)酵期間，由于乳酸菌的發(fā)酵作用，發(fā)酵產物乳酸不斷累積，因此可以根據(jù)微生物的活動情況和乳酸積累量，將泡菜發(fā)酵過程分為三個階段。,發(fā)酵初期蔬菜剛入壇時，其表面帶入的微生物，主要以不抗酸的大腸桿菌和酵母菌等較為活躍，它們進行異型乳酸發(fā)酵和微弱的酒精發(fā)酵，發(fā)酵產物為乳酸、乙醇、醋酸和二氧化碳等。由于有較多的二氧化碳產生，氣泡會從壇沿水槽內的水中間歇性地放出，使壇內逐漸形成嫌氣狀態(tài)。此時泡菜液的含酸量約為0.3%～0.4%，是泡菜初熟階段，其菜質咸而不酸、有生味。,發(fā)酵中期由于初期乳酸發(fā)酵使乳酸不斷積累，pH下降，嫌氣狀態(tài)形成，乳酸桿菌開始活躍，并進行同型乳酸發(fā)酵。這時乳酸的積累量可達到0.6%～0.8%。pH為3.5～3.8。大腸桿菌、腐敗菌、酵母菌和霉菌的活動受到抑制。這一期間為泡菜完全成熟階段，泡菜有酸味而且清香。,發(fā)酵后期在此期間繼續(xù)進行的是同型乳酸發(fā)酵，乳酸含量繼續(xù)增加，可達1.0%以上。當乳酸含量達到1.2%以上時，乳酸桿菌的活性受到抑制，發(fā)酵速度逐漸變緩甚至停止。此階段泡菜酸度過高、風味不協(xié)調。從乳酸的含量、泡菜的風味品質來看，在初期發(fā)酵的末期和中期發(fā)酵階段，泡菜的乳酸含量為0.4%～0.8%，風味品質最好，因此，常以這個階段作為泡菜的成熟期。,