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實驗四動物細胞培養(yǎng)基的配置和原代培養(yǎng),一實驗項目簡介,1、實驗學(xué)時6學(xué)時2實驗過程：A動物細胞培養(yǎng)液的配置B采用組織培養(yǎng)法培養(yǎng)魚類細胞,二、實驗原理,原代細胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細胞、組織或器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織(或器官)，經(jīng)消化，分散為單個游離的細胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的地生長及繁殖。細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g(shù)。,魚類細胞組培的一些方法：,（1）組織塊固定法當(dāng)組織量較少時可采用此法。它是將組織剪成約一立方毫米的小塊,按一定比例將組織塊貼在瓶壁上,至少三十分鐘以上,然后輕輕加人營養(yǎng)液置溫箱培養(yǎng)。（2）機械分散法此法適用于細胞間連接較松散的組織,如胚胎組織及幼魚全魚。將組織剪成約一立方毫米耐的小塊,放入底部有一銅網(wǎng)的注射器內(nèi),用手的壓力將組織擠出網(wǎng)孔,最后將分散的組織吹打后加人營養(yǎng)液分裝培養(yǎng)。（3）絡(luò)合劑分散法目前使用的絡(luò)合劑主要是乙二胺四乙酸,它能與細胞間鈣離子、鎂離子結(jié)合而使細胞連接松散,經(jīng)吹打即可分散。該法目前主要用于囊胚細胞培養(yǎng)及上皮型細胞系的傳代。（4）酶消化法該法是目前采用極為廣泛的方法,適用于絕大多數(shù)組織器官。所用的酶主要是胰酶,常用濃度是0.25%。根據(jù)酶消化時溫度的不同,又可進一步分為冷消化法及熱消化法。（5）冷消化法此法是將組織剪成約刀的小塊,然后置一倍體積的胰酶中,四攝氏度培養(yǎng)。,三、實驗?zāi)康?1、掌握動物細胞培養(yǎng)緩沖液、消化液的配置。2掌握動物細胞原代培養(yǎng)的基本過程。,四、實驗試劑,DMEM培養(yǎng)基胰蛋白酶Hanks緩沖液抗生素溶液牛血清70%乙醇去離子水,五、實驗用品,器材：解剖剪、解剖鑷、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，,六、實驗步驟,培養(yǎng)液的配置1、DMEM培養(yǎng)液的配置：將1袋袋裝的干粉溶解于1L去離子水中，加3.7gNaHCO3,溶解，調(diào)節(jié)PH7.2,過濾除菌，4℃保存。2、雙抗溶液的配置：將青霉素、鏈霉素溶解于生理鹽水中，至青霉素最終濃度為100U/mL。,六、實驗步驟,3、D-Hanks緩沖溶液：稱取8gNaCl，0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4,0.35gNaHCO3溶解于1000mL去離子水中，高壓滅菌，4℃保存。,六、實驗步驟,魚類細胞的組織培養(yǎng)法1．取材：迅速處死動物，無菌分離肝臟,置D-Hanks液中,沖洗肝臟至灰白色。,,六、實驗步驟,2.接種、培養(yǎng)：將肝臟剪成1mm1mm1mm的組織塊,用D-Hanks液洗3次,去掉血細胞,37℃下用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用D-Hanks液洗2次,培養(yǎng)液洗2次,將肝組織塊貼壁于組織培養(yǎng)瓶中,每個培養(yǎng)瓶放組織塊20～25塊。加少許培養(yǎng)液,將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)置于培養(yǎng)箱中,在37℃條件下培養(yǎng),2h后補充培養(yǎng)液,并翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。,六、實驗步驟,3．觀察置于37℃培養(yǎng)的細胞．需逐日進行觀察．主要觀察：(1)培養(yǎng)物是否被污染，如培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且混濁，表示該瓶被污染。(2)細胞生長狀況與培養(yǎng)液顏色的變化，如培養(yǎng)液變?yōu)樽霞t色，一般細胞生長不好?？赡苁瞧咳瓷w緊或營養(yǎng)液pH過高。,六、實驗步驟,待細胞已基本長成致密單層時，此時即可進行傳代培養(yǎng)了。,七、注意事項,細胞培養(yǎng)要求無菌操作。無菌是細胞培養(yǎng)成功的首要條件。重視進人無菌室操作前必須將培養(yǎng)瓶外表消毒提防試劑瓶中的液體浸濕瓶蓋,這往往是試驗污染的重要因素之一。,八魚類細胞原代培養(yǎng)意義,魚類培養(yǎng)細胞作實驗驗對象，有著活體魚無法比擬的優(yōu)點：(I)成本低，細胞系的維護不需要大型的養(yǎng)殖設(shè)備和大量的換水與換氣。(2)重復(fù)性好，實驗條件可以精確控制。因此，對魚類細胞系進行深入研究，無論在理論研究方面，還是在實際應(yīng)用方面，都具有深遠意義。,八魚類細胞原代培養(yǎng)意義,在對細胞的營養(yǎng)需求有比較深人認識的基礎(chǔ)上,化學(xué)成分明確的無蛋白培養(yǎng)基已被用于中國倉鼠卵巢細胞匯和雜交瘤細胞的培養(yǎng)。雖然魚類細胞培養(yǎng)中尚未成功應(yīng)用無血清培養(yǎng)技術(shù),但在這方面的研究已有一定基礎(chǔ),相信在不久的將來魚細胞培養(yǎng)技術(shù)會有所突破,更廣泛地應(yīng)用于研究領(lǐng)域。,