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第十二章細(xì)胞增殖及其調(diào)控,細(xì)胞增殖(cellproliferation)的意義,◆細(xì)胞增殖(cellproliferation)是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要特征之一,是生物繁育的基礎(chǔ)?！魡渭?xì)胞生物細(xì)胞增殖導(dǎo)致生物個(gè)體數(shù)量的增加?！舳嗉?xì)胞生物由一個(gè)單細(xì)胞(受精卵)分裂發(fā)育而來(lái)，細(xì)胞增殖是多細(xì)胞生物繁殖基礎(chǔ)?！舫审w生物仍然需要細(xì)胞增殖，主要取代衰老死亡的細(xì)胞，維持個(gè)體細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)平衡和機(jī)體的正常功能。◆機(jī)體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復(fù)等，都要依賴細(xì)胞增殖。,第一節(jié)細(xì)胞周期概述,一、什么是細(xì)胞周期,細(xì)胞周期指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過(guò)程，所需的時(shí)間叫細(xì)胞周期時(shí)間。其間細(xì)胞遺傳物質(zhì)和其他內(nèi)含物分配給子細(xì)胞。可分為四個(gè)階段（圖13-1）：①G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時(shí)間；②S期(synthesisphase)，指DNA復(fù)制的時(shí)期，只有在這一時(shí)期H3-TDR才能摻入新合成的DNA中；③G2期(gap2)，指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開(kāi)始之前的一段時(shí)間；④M期又稱D期(mitosisordivision)，細(xì)胞分裂開(kāi)始到結(jié)束。,,細(xì)胞周期可劃分為四個(gè)階段,細(xì)胞周期時(shí)間,不同細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)間差異很大S+G2+M的時(shí)間變化較小，細(xì)胞周期時(shí)間長(zhǎng)短主要差別在G1期有些分裂增殖的細(xì)胞缺乏G1、G2期,從增殖的角度來(lái)看，可將高等動(dòng)物的細(xì)胞分為三類：①連續(xù)分裂細(xì)胞，在細(xì)胞周期中連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)因而又稱為周期細(xì)胞，如表皮生發(fā)層細(xì)胞、部分骨髓細(xì)胞。②休眠細(xì)胞暫不分裂，這類細(xì)胞可長(zhǎng)期停留在G1早期而不越過(guò)R點(diǎn)，處于增殖靜止?fàn)顟B(tài)。它們合成具有特殊功能的RNA和蛋白質(zhì)，使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生分化，但這類細(xì)胞并未喪失增殖能力，在一定條件下可以恢復(fù)其增殖狀態(tài)，但需要經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的恢復(fù)時(shí)間，稱G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、腎細(xì)胞等。③不分裂細(xì)胞，指不可逆地脫離細(xì)胞周期，不再分裂的細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞，如神經(jīng)、肌肉、多形核細(xì)胞等等。,二、細(xì)胞周期時(shí)間的測(cè)定,標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）是一種常用的測(cè)定細(xì)胞周期時(shí)間的方法。其原理是對(duì)測(cè)定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期。,有關(guān)名詞：,TG1：G1期的持續(xù)時(shí)間TG2：G2期的持續(xù)時(shí)間TS：S期的持續(xù)時(shí)間TM：M期的持續(xù)時(shí)間TC：一個(gè)細(xì)胞周期的持續(xù)時(shí)間PLM：標(biāo)記的有絲分裂細(xì)胞所占的比例TDR：胸腺嘧啶核苷，是DNA的特異前體，能被S期細(xì)胞攝入，而摻進(jìn)DNA中。通常使用的是3H或者14C標(biāo)記的TDR。,測(cè)定原理（圖13-2）：,①待測(cè)細(xì)胞經(jīng)3H-TDR標(biāo)記后，所有S期細(xì)胞均被標(biāo)記。②S期細(xì)胞經(jīng)G2期才進(jìn)入M期，所以一段時(shí)間內(nèi)PLM=0。③開(kāi)始出現(xiàn)標(biāo)記M期細(xì)胞時(shí)，表示處于S期最后階段的細(xì)胞，已渡過(guò)G2期，所以從PLM=0到出現(xiàn)PLM的時(shí)間間隔為TG2。④S期細(xì)胞逐漸進(jìn)入M期，PLM上升，到達(dá)到最高點(diǎn)的時(shí)候說(shuō)明來(lái)自處于S最后階段的細(xì)胞，已完成M，進(jìn)入G1期。所以從開(kāi)始出現(xiàn)M到PLM達(dá)到最高點(diǎn)（≈100%）的時(shí)間間隔就是TM。⑤當(dāng)PLM開(kāi)始下降時(shí)，表明處于S期最初階段的細(xì)胞也已進(jìn)入M期，所以出現(xiàn)PLM到PLM又開(kāi)始下降的一段時(shí)間等于TS。⑥從PLM出現(xiàn)到下一次PLM出現(xiàn)的時(shí)間間隔就等于TC，根據(jù)TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1長(zhǎng)度。,細(xì)胞周期各階段的時(shí)間與PLM的關(guān)系,◆流式細(xì)胞儀測(cè)定法(FlowCytometry),DNA的含量隨細(xì)胞周期(G1，S，G2，M)的各個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)出周期性的變化：G1期，是細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)的合成期，即DNA合成前期,此時(shí)細(xì)胞核內(nèi)DNA含量保持二倍體；進(jìn)入S期后，DNA開(kāi)始合成，即DNA合成期,細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于二倍體至四倍體之間；細(xì)胞進(jìn)入G2期，即細(xì)胞分裂前期，DNA含量為四倍體,直到進(jìn)入M期，即細(xì)胞分裂期,細(xì)胞分成兩個(gè)子細(xì)胞,M期結(jié)束進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期。G1期:DNA的含量為二倍體S期:DNA的含量為二倍體至四倍體混合G2,M期:DNA的含量為四倍體,三、細(xì)胞同步化,細(xì)胞同步化(synchronization)是指在自然過(guò)程中發(fā)生或經(jīng)人為處理造成的細(xì)胞周期同步化，前者稱自然同步化，后者稱為人工同步化。,（一）自然同步化,1．多核體如粘菌只進(jìn)行核分裂，而不發(fā)生胞質(zhì)分裂，形成多核體。數(shù)量眾多的核處于同一細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)行同步化分裂，使細(xì)胞核達(dá)108，體積達(dá)5~6cm。瘧原蟲(chóng)也具有類似的情況。2．某些水生動(dòng)物的受精卵如海膽卵可以同時(shí)授精，最初的3次細(xì)胞分裂是同步的，再如大量海參卵受精后，前9次細(xì)胞分裂都是同步化進(jìn)行的。3．增殖抑制解除后的同步分裂如真菌的休眠孢子移入適宜環(huán)境后，它們一起發(fā)芽，同步分裂。,（二）人工同步化,1．選擇同步化,1）有絲分裂選擇法：使單層培養(yǎng)的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期，此時(shí)分裂活躍，MI高。有絲分裂細(xì)胞變圓隆起，與培養(yǎng)皿的附著性低，此時(shí)輕輕振蕩，M期細(xì)胞脫離器壁，懸浮于培養(yǎng)液中，收集培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液，依法繼續(xù)收集，則可獲得一定數(shù)量的中期細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)是，操作簡(jiǎn)單，同步化程度高，細(xì)胞不受藥物傷害，缺點(diǎn)是獲得的細(xì)胞數(shù)量較少。（分裂細(xì)胞約占1%～2%）2）細(xì)胞沉降分離法：不同時(shí)期的細(xì)胞體積不同，而細(xì)胞在給定離心場(chǎng)中沉降的速度與其半徑的平方成正比，因此可用離心的方法分離。其優(yōu)點(diǎn)是可用于任何懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,省時(shí)，效率高，成本低，缺點(diǎn)是同步化程度較低。,2．誘導(dǎo)同步化,1）DNA合成阻斷法：選用DNA合成的抑制劑，可逆地抑制DNA合成，而不影響其他時(shí)期細(xì)胞的運(yùn)轉(zhuǎn)，最終可將細(xì)胞群阻斷在S期或G/S交界處。5-氟脫氧尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高濃度ADR、GDR和TDR，均可抑制DNA合成使細(xì)胞同步化。其中高濃度TDR對(duì)S期細(xì)胞的毒性較小，因此常用TDR雙阻斷法誘導(dǎo)細(xì)胞同步化：在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)基中加入過(guò)量TDR。S期細(xì)胞被抑制，其它細(xì)胞繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，最后停在G1/S交界處。移去TDR。洗滌細(xì)胞并加入新鮮培養(yǎng)液、細(xì)胞又開(kāi)始分裂。當(dāng)釋放時(shí)間大于TS時(shí)，所有細(xì)胞均脫離S期，再次加入過(guò)量TDR，細(xì)胞繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)至G1/S交界處，被過(guò)量TDR抑制而停止。優(yōu)點(diǎn)是同步化程度高，適用于任何培養(yǎng)體系?？蓪缀跛械募?xì)胞同步化。缺點(diǎn)是產(chǎn)生非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體積增大。2）中期阻斷法：利用破壞微管的藥物將細(xì)胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較少。優(yōu)點(diǎn)是無(wú)非均衡生長(zhǎng)現(xiàn)象，缺點(diǎn)是可逆性較差。,3.條件依賴性突變株在細(xì)胞周期同步化中的應(yīng)用,將與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的條件依賴性突變株轉(zhuǎn)移到限定條件下培養(yǎng)，所有細(xì)胞便被同步化在細(xì)胞周期中某一特定時(shí)期。,四、特異的細(xì)胞周期,特異的細(xì)胞周期是指那些特殊的細(xì)胞所具有的與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞周期相比有著鮮明特點(diǎn)的細(xì)胞周期。,⑴爪蟾早期胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期,細(xì)胞分裂快,無(wú)G1期,G2期非常短,S期也短(所有復(fù)制子都激活),以至認(rèn)為僅含有S期和M期無(wú)需臨時(shí)合成其它物質(zhì)子細(xì)胞在G1、G2期并不生長(zhǎng)，越分裂體積越小細(xì)胞周期調(diào)控因子和調(diào)節(jié)機(jī)制與一般體細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞周期基本是一致的,⑵酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期,酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞周期在時(shí)相和調(diào)控方面相似，酵母細(xì)胞周期明顯特點(diǎn):酵母細(xì)胞周期持續(xù)時(shí)間較短；封閉式細(xì)胞分裂，即細(xì)胞分裂時(shí)核膜不解聚；紡錘體位于細(xì)胞核內(nèi)；在一定環(huán)境下，也進(jìn)行有性繁殖,⑶植物細(xì)胞的細(xì)胞周期,植物細(xì)胞的細(xì)胞周期與動(dòng)物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞周期非常相似，含有G1期、S期、G2期和M期四個(gè)時(shí)期。植物細(xì)胞不含中心體，但在細(xì)胞分裂時(shí)可以正常組裝紡錘體。植物細(xì)胞以形成中板的形式進(jìn)行胞質(zhì)分裂,中期(metaphase),◆所有染色體排列到赤道板(MetaphasePlate)上，標(biāo)志著細(xì)胞分裂已進(jìn)入中期◆是什么機(jī)制確保染色體正確排列在赤道板上？著絲粒微管動(dòng)態(tài)平衡形成的張力,關(guān)于細(xì)胞分裂：,.,,MTbehaviorduringformationofthemetaphaseplate.Initially,MTfromoppositepolesaredifferentinlength.,,Experimentaldemonstrationoftheimportanceofmecha-nicaltensioninmetaphasecheckpointcontrol.,后期(anaphase),◆排列在赤道面上的染色體的姐妹染色單體分離產(chǎn)生向極運(yùn)動(dòng)◆后期(anaphase)大致可以劃分為連續(xù)的兩個(gè)階段，即后期A和后期B后期A，動(dòng)粒微管去裝配變短，染色體產(chǎn)生兩極運(yùn)動(dòng)后期B，極間微管長(zhǎng)度增加，兩極之間的距離逐漸拉長(zhǎng)，介導(dǎo)染色體向極運(yùn)動(dòng),第二節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控,,◆在適當(dāng)時(shí)候激活細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的相關(guān)酶和蛋白,然后自身失活(正調(diào)控)◆確保每一時(shí)相事件的全部完成(負(fù)調(diào)控)◆對(duì)外界環(huán)境因子起反應(yīng)(如多細(xì)胞生物對(duì)增殖信號(hào)的反應(yīng)),細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的主要作用,一、研究背景,Rao和Johnson(1970、1972、1974)將Hela細(xì)胞同步于不同階段，然后與M期細(xì)胞混合，在滅活仙臺(tái)病毒介導(dǎo)下，誘導(dǎo)細(xì)胞融合，發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞融合的間期細(xì)胞產(chǎn)生了形態(tài)各異的早熟凝集染色體(prematurelycondensedchromosome，PCC)，這種現(xiàn)象叫做早熟染色體凝集(prematurechromosomecondensation)。,G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個(gè)部位開(kāi)始復(fù)制。G2期PCC為雙線染色體，說(shuō)明DNA復(fù)制已完成。,不同形態(tài)的PCC,不僅同類M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC，不同類的M期細(xì)胞也可以誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，如人和蟾蜍的細(xì)胞融合時(shí)同樣有這種效果，這就意味著M期細(xì)胞具有某種促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即成熟促進(jìn)因子(maturationpromotingfactor，MPF)。,早在1960s，YoshioMasui發(fā)現(xiàn)成熟蛙卵的提取物能促進(jìn)未成熟卵的胚胞破裂(GerminalVesicleBreakdown，GVBD)，后來(lái)Sunkara將不同時(shí)期Hela細(xì)胞的提取液注射到蛙卵母細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)G1和S期的抽取物不能誘導(dǎo)GVBD，而G2和M期的則具有促進(jìn)胚胞破裂的功能，它將這種誘導(dǎo)物質(zhì)稱為有絲分裂因子(MF)。后來(lái)在CHO細(xì)胞，酵母和粘菌中也提取出相同性質(zhì)的MF。這類物質(zhì)被統(tǒng)稱為MPF。,處于第六期的爪蟾卵母細(xì)胞（RD前期I），具GV。,Masui和Markert用孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，并用成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)注射到卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，繼續(xù)用該卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)新的卵母細(xì)胞，仍然可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。因而他們推測(cè)成熟卵母細(xì)胞中必然有一種物質(zhì)可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，即MPF。,1960sHartwell以芽殖酵母（圖13-16）為實(shí)驗(yàn)材料，利用阻斷在不同細(xì)胞周期階段的溫度敏感突變株（在適宜的溫度下和野生型一樣），分離出了幾十個(gè)與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncyclegene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M轉(zhuǎn)換點(diǎn)發(fā)揮重要的功能。Hartwell還通過(guò)研究酵母菌細(xì)胞對(duì)放射線的感受性，提出了checkpoint（細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)）的概念，意指當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，細(xì)胞周期會(huì)停下來(lái)。,芽殖酵母細(xì)胞周期,1970sPaulNurse等人以裂殖酵母（圖13-17）為實(shí)驗(yàn)材料，同樣發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞周期調(diào)控基因，如：裂殖酵母cdc2、cdc25的突變型在限制的溫度下無(wú)法分裂；wee1突變型則提早分裂，而cdc25和wee1都發(fā)生突變的個(gè)體卻會(huì)正常地分裂（圖13-18）。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)cdc2和cdc28都編碼一個(gè)34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行。而weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進(jìn)CDC2的活性。這也解釋了為何cdc25和wee1雙重突變的個(gè)體可以恢復(fù)野生型的表型。,Cdc25表達(dá)不足，細(xì)胞長(zhǎng)得過(guò)長(zhǎng)而不分裂；Wee1表達(dá)不足，細(xì)胞很小就開(kāi)始分裂了,1983年TimothyHunt首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過(guò)程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期劇烈振蕩，在每一輪間期開(kāi)始合成，G2/M時(shí)達(dá)到高峰，M結(jié)束后突然消失，下輪間期又重新合成，故命名為周期蛋白(cyclin)。后來(lái)在青蛙、爪蟾、海膽、果蠅和酵母中均發(fā)現(xiàn)類似的情況，各類動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞周期蛋白mRNA均能誘導(dǎo)蛙卵的成熟。用海洋無(wú)脊椎動(dòng)物和兩棲類的卵為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行這類實(shí)驗(yàn)，好處在于卵的量比較大，而且在胚胎發(fā)育的早期，細(xì)胞分裂是同步化的。,◆MPF是一種使多種底物蛋白磷酸化的蛋白激酶；由M期Cyclin-Cdk(Cyclin-dependentproteinkinase)形成的復(fù)合物。MPF=p34cdc2蛋白激酶+cyclinB周期蛋白,?MPF的作用,◆促進(jìn)染色體凝集●H1組蛋白磷酸化●H3組蛋白磷酸化◆核纖層磷酸化◆核被膜裝配◆細(xì)胞相關(guān)的酶與蛋白質(zhì)磷酸化,1988年M.J.Lohka純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由32KD和45KD兩種蛋白組成，二者結(jié)合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化（圖13-19）。后來(lái)PaulNurse（1990）進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明P32實(shí)際上是CDC2的同源物，而P45是cyclinB的同源物，從而將細(xì)胞周期三個(gè)領(lǐng)域的研究聯(lián)系在一起。2001年10月8日美國(guó)人LelandHartwell、英國(guó)人PaulNurse、TimothyHunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（圖13-20）。,2001年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者,二、CDK,CDC2與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，稱為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)，因此CDC2又被稱為CDK1，激活的CDK1可將靶蛋白磷酸化而產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)，如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失，將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等等。這些效應(yīng)的最終結(jié)果是細(xì)胞周期的不斷運(yùn)行。因此，CDK激酶和其調(diào)節(jié)因子又被稱作細(xì)胞周期引擎。,目前發(fā)現(xiàn)的CDK在動(dòng)物中有7種。各種CDK分子均含有一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。,三、CKI,細(xì)胞中還具有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDKinhibitor，CKI）對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，目前發(fā)現(xiàn)的CKI分為兩大家族,①Ink4(Inhibitorofcdk4)，如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特異性抑制cdk4cyclinD1、cdk6cyclinD1復(fù)合物。,②Kip(Kinaseinhibitionprotein)：包括P21cip1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能抑制大多數(shù)CDK的激酶活性，P21cip1還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）結(jié)合，直接抑制DNA的合成,四、Cyclin,周期蛋白不僅僅起激活CDK的作用，還決定了CDK何時(shí)、何處、將何種底物磷酸化，從而推動(dòng)細(xì)胞周期的前進(jìn)。目前從芽殖酵母、裂殖酵母和各類動(dòng)物中分離出的周期蛋白有30余種，在脊椎動(dòng)物中為A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分為G1型、G1/S型S型和M型4類（見(jiàn)表13-1）。各類周期蛋白均含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。,表13-1不同類型的周期蛋白,*包括D1-3，各亞型cyclinD，在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效,細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下，G1期cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。,圖13-22CyclinD與CDK結(jié)合使Rb釋放結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F,在G1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S限制點(diǎn)而進(jìn)入S期。向細(xì)胞內(nèi)注射CyclinE的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期，說(shuō)明細(xì)胞進(jìn)入S期需要CyclinE的參與。同樣將CyclinA的抗體注射到細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能抑制細(xì)胞的DNA合成，推測(cè)CyclinA是DNA復(fù)制所必需的。,在G2-M期，cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件。,圖13-23Cyclin的周期性變化,在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，通過(guò)一種未知的途徑，激活后期促進(jìn)因子APC，將泛素連接在cyclinB上，導(dǎo)致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個(gè)細(xì)胞周期（圖13-24）。,APC介導(dǎo)選擇性降解的靶蛋白與Ubiquitin結(jié)合(通過(guò)泛素依賴性途徑降解)APC主要介導(dǎo)兩類蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin.前者維持姐妹染色單體粘連,抑制后期啟動(dòng)；后者的降解意味著有絲分裂即將結(jié)束，即染色體開(kāi)始去凝集，核膜重建。Cdc20和Mad2蛋白位于動(dòng)粒上，在染色體結(jié)合有絲分裂紡錘體前將不能從動(dòng)粒上釋放，由于Mad2與Cdc20結(jié)合而抑制APC的活性。所以只有所有染色體都與紡錘體結(jié)合后，APC才有活性，才啟動(dòng)細(xì)胞向后期轉(zhuǎn)換。,圖13-24CyclinB的降解途徑,分裂期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱降解盒(destructionbox，圖13-25)。當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，通過(guò)泛素連接酶催化泛素與cyclin結(jié)合，cyclin隨之被26S蛋白酶體水解。G1周期蛋白也通過(guò)類似的途徑降解，但其N端沒(méi)有降解盒，C端有一段PEST序列與其降解有關(guān)。,泛素由76個(gè)氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞，故名泛素。共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識(shí)別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑，泛素相當(dāng)于蛋白質(zhì)被摧毀的標(biāo)簽。26S蛋白酶體是一個(gè)大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。,圖13-25細(xì)胞周期蛋白的降解盒與降解途徑,在蛋白質(zhì)的泛素化過(guò)程中（圖13-25），E1（ubiquitin-activatingenzyme，泛素激活酶）水解ATP獲取能量，通過(guò)其活性位置的半胱氨酸殘基與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素，然后E1將泛素交給E2（ubiquitin-conjugatingenzyme，泛素結(jié)合酶），最后在E3（ubiquitin-ligase，泛素連接酶）的作用下將泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。參與細(xì)胞周期調(diào)控的泛素連接酶至少有兩類，其中SCF（skp1-cullin-F-boxprotein，三個(gè)蛋白構(gòu)成的復(fù)合體）負(fù)責(zé)將泛素連接到G1/S期周期蛋白和某些CKI上，APC(anaphasepromotingcomplex)負(fù)責(zé)將泛素連接到M期周期蛋白上。,五、DNA復(fù)制當(dāng)且僅當(dāng)一次(P408),DNA的復(fù)制是由起始復(fù)制點(diǎn)（originsofreplication）開(kāi)始的，起始復(fù)制點(diǎn)也就是上一章提到的自主復(fù)制序列，散布在染色體上。在整過(guò)細(xì)胞周期中，起始復(fù)制點(diǎn)上結(jié)合有起始識(shí)別復(fù)合體（Originrecognitioncomplex,ORC），其作用就象一個(gè)停泊點(diǎn)，供其它調(diào)節(jié)因子?？?。,CDC6是其中的一個(gè)調(diào)節(jié)因子，在G1期CDC6含量瞬間提高，CDC6結(jié)合在ORC上，在ATP供能下，促進(jìn)6個(gè)亞單位構(gòu)成的MCM復(fù)合體和其他一些蛋白結(jié)合到ORC上，形成前復(fù)制復(fù)合體（pre-replicativecomplex，pre-RC），MCM實(shí)際上就是DNA解旋酶（helicase）。,S-CDK觸發(fā)pre-RC的啟動(dòng)，同時(shí)阻止了DNA再次進(jìn)行復(fù)制，因?yàn)镾-CDK將CDC6磷酸化，使其脫離ORC，磷酸化的CDC6隨后被SCF參與的泛素化途徑降解；S-CDK還可以將某些MCM磷酸化，使其被輸出細(xì)胞核。其它一些CDK也參與阻止pre-RC的再次形成，從而保證了DNA的復(fù)制當(dāng)且僅當(dāng)一次（圖13-26）。,微小染色體維持蛋白(Minichromosomemaintenanceproteins,Mcm),六、M期CDK的激活,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累，有絲分裂周期中，cyclin的積累是因?yàn)樵贕2-M期M-cyclin基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)。,隨著M-cyclin的積累，結(jié)合周期蛋白的M-CDK（CDK1）增加，但是沒(méi)有活性，這是因?yàn)閃ee1激酶將CDK1的Thr14和Tyr15磷酸化的緣故，這種機(jī)制保證了CDK-cyclin能夠不斷積累，然后在需要的時(shí)候突然釋放。,在M期，一方面Wee1的活性下降，另一方面CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDC25可被兩種激酶激活，一是polo激酶，另一個(gè)是M-CDK本身。激活的M-CDK還可以抑制它的抑制因子Wee1的活性，形成一個(gè)反饋環(huán)。因此不難想象只要有少量的CDK被CDC25或polo激活，立即就會(huì)有大量的CDK被活化。,CDK的激活還需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDKactivatingkinaseCAK)的作用下完成的。,CDK1的調(diào)節(jié)與活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase,Tyr15Inhibitory:AddedbyWee1RemovedbyCdc25,,Thr160Activating:CDKaddsafterCyclinbinding,,七、細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn),細(xì)胞要分裂，必須正確復(fù)制DNA和達(dá)到一定的體積，在獲得足夠物質(zhì)支持分裂以前，細(xì)胞不可能進(jìn)行分裂。細(xì)胞周期的運(yùn)行，是在一系列稱為檢驗(yàn)點(diǎn)（checkpoint）的嚴(yán)格檢控下進(jìn)行的，當(dāng)DNA發(fā)生損傷，復(fù)制不完全或紡錘體形成不正常，周期將被阻斷。,細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)由感受異常事件的感受器、信號(hào)傳導(dǎo)通路和效應(yīng)器構(gòu)成，主要檢驗(yàn)點(diǎn)包括（圖13-28）：,G1/S檢驗(yàn)點(diǎn):在酵母中稱start點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中稱R點(diǎn)(restrictionpoint)，控制細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G1進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？,S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？,G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？,中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）：任何一個(gè)著絲點(diǎn)沒(méi)有正確連接到紡錘體上，都會(huì)抑制APC的活性，引起細(xì)胞周期中斷。,Fourcheckpoints,ATM（ataxiatelangiectasia-mutatedgene）是與DNA損傷檢驗(yàn)有關(guān)的一個(gè)重要基因。最早發(fā)現(xiàn)于毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥患者，人類中大約有1%的人是ATM缺失的雜合子，表現(xiàn)出對(duì)電離輻射敏感和易患癌癥。正常細(xì)胞經(jīng)放射處理后，DNA損傷會(huì)激活修復(fù)機(jī)制，如DNA不能修復(fù)則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，總之不會(huì)形成變異的細(xì)胞。,ATM編碼一個(gè)蛋白激酶，結(jié)合在損傷的DNA上，能將某些蛋白磷酸化，中斷細(xì)胞周期。其信號(hào)通路有兩條。,一條是激活Chk1（checkpointkinase）,Chk1引起CDC25的Ser216磷酸化，通過(guò)抑制CDC25的活性，抑制M-CDK的活性，使細(xì)胞周期中斷。,另一條是激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作為轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致P21的表達(dá)，P21抑制G1-S期CDK的活性，從而使細(xì)胞周期阻斷。,八、生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞增殖的影響,生長(zhǎng)因子是一大類與細(xì)胞增殖有關(guān)的信號(hào)物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子多達(dá)幾十種，多數(shù)有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，故又稱有絲分裂原（mitogen），如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF），少數(shù)具有抑制作用如抑素(chalone)，腫瘤壞死因子（TNF），個(gè)別如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)具有雙重調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)一類細(xì)胞的增值，而抑制另一類細(xì)胞。,生長(zhǎng)因子不由特定腺體產(chǎn)生，主要通過(guò)旁分泌作用于鄰近細(xì)胞。各種生長(zhǎng)因子分子量大小不同，如：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)由674個(gè)氨基酸組成，分子量達(dá)80KD，內(nèi)皮素僅由21個(gè)氨基酸組成。大多數(shù)生長(zhǎng)因子僅由一條肽鏈組成，如EGF、TGF-α、FGF，而PDGF、NGF、TGF-β，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF由兩條肽組成。,生長(zhǎng)因子的信號(hào)通路主要有：ras途徑，cAMP途徑和磷脂酰肌醇途徑。如通過(guò)ras途徑，激活MAPK，MAPK進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。如通過(guò)一種未知的途徑激活c-myc，myc作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)cyclinD、SCF、E2F等G1-S有關(guān)的許多基因表達(dá)，細(xì)胞進(jìn)入G1期（圖13-29）。,