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《基因工程的基本操作程序》 教學(xué)目標(biāo) 1.簡述基因工程原理及基本操作程序。 2.嘗試設(shè)計某一轉(zhuǎn)基因生物的研制過程。 3.培養(yǎng)學(xué)生探索科學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度 教學(xué)重難點 【教學(xué)重點】 基因工程基本操作程序的四個步驟。 【教學(xué)難點】 （1）從基因文庫中獲取目的基因。 （2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。 教學(xué)工具 多媒體 教學(xué)過程 復(fù)習(xí)提問： 1.DNA重組技術(shù)的基本工具有那些，各自的作用和特點是什么？ 2.我們所學(xué)過的育種方法有那些？其中基因工程育種有那些優(yōu)點？ 導(dǎo)入：通過基因工程的概念我們可知,我們能夠應(yīng)用DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)賦予生物以新的遺傳特征，但是無論是DNA重組技術(shù)還是轉(zhuǎn)基因技術(shù)都需要找到對我們有利的目的基因，我們該如何去尋找目的基因哪，目的基因又將如何連接到載體上哪，以及如何將載體導(dǎo)入受體？這些都是我們所要共同探究的問題!現(xiàn)在讓我們共同學(xué)習(xí)一下1.2基因工程的基本操作。 思考1.我們在前面提到的蘇云芽孢桿菌中的抗蟲基因、胰島素基因、干擾素基因等都可以作目 的基因?？墒且诤棋摹盎蚝Ｑ蟆敝?，找到特定的目的基因可以用什么樣的方法和途徑呢？ 2、基因工程的基本操作程序主要包括： 、 、 新課教學(xué)： 基因工程的基本操作步驟主要包括：目的基因的獲取；基因表達(dá)載體的構(gòu)建；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；目的基因的檢測與鑒定。 一．目的基因的獲取 1．目的基因：主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。 2．目的基因的獲取方法： （1）從基因文庫中獲取 基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因。 構(gòu)建基因文庫的目的：為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。 基因組文庫：含有一種生物的所有基因。 部分基因文庫（如cDNA文庫）：含部分基因，可由mRNA反轉(zhuǎn)錄而來。 （2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 PCR：是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。 原理：DNA雙鏈復(fù)制 原料：模板DNA；RNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子 方法：DNA受熱變性解旋為單鏈、冷卻后RNA引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、DNA聚合酶作用下延伸合成互補(bǔ)鏈。 特點：指數(shù)形式擴(kuò)增 二．基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1．目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在；可以遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 目的基因： 2．基因表達(dá) 啟動子：位于基因首端，RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位， 驅(qū)動轉(zhuǎn)錄基因 載體的組成 終止子：位于基因尾端，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來 標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因 3．方法：同種限制酶分別切割載體和目的基因，再用DNA連接酶把兩者連接。 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合（以質(zhì)粒為運(yùn)載體） 4．條件：同種限制酶、DNA連接酶、ATP（目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因） 三．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。 ① 導(dǎo)入植物細(xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，再讓農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞） 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 ②導(dǎo)入動物細(xì)胞：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中） ③導(dǎo)入微生物細(xì)胞：Ca2＋處理受體細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞，再進(jìn)行混合。 提示：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理是利用農(nóng)桿菌（胞內(nèi)寄生菌）對植物的感染而把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。 四．目的基因的檢測和鑒定 ①檢測是否插入目的基因，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條 鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的DNA雜交，看是否有雜交帶。 ②檢測是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。 ③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。抗體與蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原－抗體雜交，看是否有雜交帶。 ④還可以進(jìn)行個體水平的鑒定，根據(jù)其性狀。 提示：①DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA探針雜交；②抗原－抗體雜交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來的。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 課后小結(jié) 本節(jié)學(xué)習(xí)的基因工程的基本操作程序和方法是對轉(zhuǎn)基因植物、動物、微生物的概括。如果在本課將要結(jié)束時，做個練習(xí)，帶領(lǐng)學(xué)生結(jié)合設(shè)計某一轉(zhuǎn)基因生物的具體過程，可將基因工程操作程序有機(jī)地串起來，從而加深對這一程序的認(rèn)識。例如，煙草是人類健康的“殺手”。如果讓它生產(chǎn)出人類需要的藥物蛋白，應(yīng)如何操作？通過這一實例引導(dǎo)學(xué)生結(jié)合目的基因從何而來，表達(dá)載體如何構(gòu)建，如何導(dǎo)入煙草，如何檢測藥物蛋白產(chǎn)生與否等問題加以設(shè)計。可加深學(xué)生對基因工程原理的理解。不同學(xué)生會有不同的方法，讓學(xué)生通過相互比較，相互借鑒，達(dá)到相互學(xué)習(xí)的目的。學(xué)生在課下還可查閱《科學(xué)》雜志等參考讀物，了解科學(xué)家成功的做法。 課后習(xí)題 1．基因工程的正確操作步驟是(　　) ①使目的基因與載體相結(jié)合 ②將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 ③驗證目的基因的表達(dá)是否符合特定性狀要求 ④提取目的基因 A．③②④①　　　　　　　　 B．②④①③ C．④①②③ D．③④①② 解析：選C。在基因工程操作中，首先要提取目的基因，然后使目的基因與載體結(jié)合，再將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，最后是目的基因的檢測與表達(dá)。 2．下列獲取目的基因的方法中需要模板的是(　　) ①從基因文庫中獲取目的基因?、诶肞CR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?、鄯崔D(zhuǎn)錄法　④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成DNA A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③ 解析：選D。PCR技術(shù)利用的是DNA雙鏈復(fù)制原理。即將DNA雙鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為聚合反應(yīng)的模板。反轉(zhuǎn)錄法是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，先反轉(zhuǎn)錄形成互補(bǔ)的單鏈DNA，再合成雙鏈DNA。①④則均不需要模板。 3．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)歷下述30多次循環(huán)：95℃下使模板DNA變性、解鏈→55 ℃下復(fù)性(引物與DNA模板鏈結(jié)合)→72℃下引物鏈延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關(guān)PCR過程的敘述中不正確的是(　　) A．變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現(xiàn) B．復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對原則完成 C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 D．PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需酶的最適溫度較高 解析：選C。本題考查PCR擴(kuò)增過程。解題的關(guān)鍵是要全面理解PCR擴(kuò)增過程。DNA分子被破壞是指DNA分子被解旋成兩條長鏈，破壞的部位是連接兩條長鏈之間的氫鍵，方法有多種，用解旋酶、高溫等都可使DNA解旋。B項中引物有兩種，分別與模板DNA鏈3′端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對。C項中的原料不正確，合成DNA的原料是四種脫氧核苷酸。PCR技術(shù)中DNA合成過程中的溫度在70～75℃。 板書 1.2 基因工程的基本操作程序 一、 目的基因的獲取 二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 （基因工程的核心） 三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 四、目的基因的檢測和鑒定