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第五章 愈傷組織的培養(yǎng),第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化 第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生 第三節(jié) 人工種子,1,第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化,1 愈傷組織的誘導(dǎo) 2 影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素,2,愈傷組織(callus)：離體組織或器官進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞分裂，形成一種高度液泡化的無(wú)定形的薄壁細(xì)胞。,From embryo culture,From root,1 愈傷組織的誘導(dǎo),3,,,4,5,2 愈傷組織的形成,從外植體脫分化形成典型的愈傷組織大致可分為三個(gè)時(shí)期：,6,2. 1 起始期：,細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。 外植體的細(xì)胞處在靜止?fàn)顟B(tài)。 一些刺激因素(如機(jī)械損傷、改變光照強(qiáng)度、增加氧等)和激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活動(dòng)加強(qiáng)，蛋白質(zhì)和核酸的合成, 誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂。,7,起始期細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的變化,激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活動(dòng)加強(qiáng)，蛋白質(zhì)和核酸的合成增加, 誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂。 每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)總增加量可達(dá)200 % 酶活性增強(qiáng)，氣體交換增加，如氧氣的吸收增加 細(xì)胞的大小沒(méi)有多大改變,8,2. 2 分裂期:,分裂期：外植體細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)以后脫分化，不斷分裂增生子細(xì)胞的過(guò)程。 脫分化：細(xì)胞由靜止期進(jìn)入分裂期，恢復(fù)分裂機(jī)能,9,分裂期外植體的特征:,,細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。,10,外層細(xì)胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外層細(xì)胞數(shù)目增加， 細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞的核和核仁增大到最大。逐步回到分生組織狀態(tài)。 隨著細(xì)胞不斷分裂和生長(zhǎng)，細(xì)胞總干重、蛋白質(zhì)和核酸量大大增加，新細(xì)胞壁合成極快。 細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。,細(xì)胞的主要表現(xiàn):,11,2. 3 形成期：,指在分裂期的末期，細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織內(nèi)產(chǎn)生不同形態(tài)和功能的細(xì)胞。,12,細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：內(nèi)部細(xì)胞發(fā)生分裂，形成像維管束或類似分生組織，組成的鳥巢狀結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞的體積相對(duì)穩(wěn)定，不再減少。 出現(xiàn)了各種類型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞等。 生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色。,細(xì)胞特點(diǎn)：,13,,14,,,,,Red,White callus,Green callus,Yellow callus,,,根據(jù)愈傷色澤劃分為：,愈傷組織的分類,15,易碎的愈傷,堅(jiān)硬的愈傷,生根的愈傷,滲出粘性多糖的愈傷,根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為：,16,,文心蘭的根（a）莖（b）葉（c）誘導(dǎo)的愈傷組織,根據(jù)愈傷發(fā)生部位：,17,胚性愈傷組織 表面呈顆粒狀、組織結(jié)構(gòu)緊湊、再生力強(qiáng)。,非胚性愈傷組織 表面粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松。,根據(jù)愈傷難易程度：,胚性愈傷組織容易形成胚狀體,非胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100％，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)較低。,18,愈傷組織生長(zhǎng)周期,愈傷組織生長(zhǎng)周期為2－4周。 在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間以后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，或有毒代謝物的積累，導(dǎo)致愈傷組織停止生長(zhǎng)，甚至老化變黑、死亡。 轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基：定期地將它們分成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基上，可以長(zhǎng)期保持旺盛的生長(zhǎng)。,19,第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化,1 愈傷組織的誘導(dǎo) 2 影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素,20,,（1）不同植物和外植體誘導(dǎo)愈傷組織能力的差異。 不同植物種類、同一植物不同器官來(lái)源及其生理狀況、年齡的外植體的脫分化（形成愈傷組織）能力有很大差別。 煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比較容易，禾本科植物的脫分化比較難； 花的脫分化比較容易，莖、葉的脫分化比較難； 幼嫩組織的脫分化比較容易，成熟的老組織脫分化比較難。,2 影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素,21,（2）培養(yǎng)基種類對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。 誘導(dǎo)愈傷組織常用的培養(yǎng)基為MS和B5。 （3）外源激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響---重要因素。 （4）培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響: 濕度條件、溫度條件、光照條件。,22,2,4-D和BA濃度對(duì)銀膠菊莖段愈傷組織生長(zhǎng)的影響,23,各種生長(zhǎng)素對(duì)黃瓜各外植體愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng) （各種生長(zhǎng)素濃度為10μmol/L）,24,,,,,,,,,25,第五章 愈傷組織的培養(yǎng),第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化 第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生 第三節(jié) 人工種子,26,1 愈傷組織形態(tài) 發(fā)生方式,愈傷組織器官發(fā)生,通過(guò)體細(xì)胞胚胎/胚狀體途徑再生植株,,,第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生,27,2 愈傷組織器官發(fā)生,先不定芽，在莖基部長(zhǎng)根 先長(zhǎng)根 后長(zhǎng)芽 在不同部位分別形成根和芽,28,29,影響愈傷組織器官發(fā)生的因素：,植物激素的作用 外植體自身因素,,30,（1）外植體自身因素（內(nèi)因）,①母體植株的遺傳基礎(chǔ) 被子植物比裸子植物容易，被子植物中茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科和十字花科植物成功報(bào)道最多； 無(wú)性繁殖植物比有性繁殖植物的容易； 同種植物不同品種（基因型）的培養(yǎng)效果不同,31,② 外植體的類型 影響培養(yǎng)的難易：一般生理狀態(tài)年輕，來(lái)源于生長(zhǎng)活躍或生長(zhǎng)潛力大的組織和器官的細(xì)胞容易培養(yǎng)。,32,例：百合：鱗莖的鱗片分化能力：外層中層內(nèi)層,33,34,高：有利于根的形成和愈傷組織的形成； 適中：有利于根芽的分化； 低：有利于芽的形成,生長(zhǎng)素 細(xì)胞分裂素,,＝,適宜的植物激素配比在器官分化中有著重要的作用。,（2）植物激素的作用（外因）,35,蘆薈的植物組織培養(yǎng)過(guò)程,1 2 3 4 5,6 7 8 9,10 11,36,芽（單芽、叢芽）,37,1 愈傷組織形態(tài) 發(fā)生方式,愈傷組織器官發(fā)生,通過(guò)體細(xì)胞胚胎/胚狀體途徑再生植株,,,第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生,38,,3.1 胚狀體/體細(xì)胞胚（embryoid） ：指植物細(xì)胞、組織或器官的離體培養(yǎng)中，起始于一個(gè)非合子細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)育過(guò)程分化出的類似胚一樣的細(xì)胞群。 經(jīng)過(guò)：球形胚－心形胚－魚雷形胚－成熟胚,3 體細(xì)胞胚發(fā)生途徑,39,,,Development of the Arabidopsis Embryo,40,,石龍芮胚狀體發(fā)生的過(guò)程,41,,,香蕉心形體細(xì)胞胚,,玫瑰心形體細(xì)胞胚,42,,,43,3.2 體細(xì)胞胚的產(chǎn)生方式,1）直接在器官上發(fā)生 2） 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生途徑 3）愈傷組織發(fā)生途徑 : 幼胚、胚和子葉 4）單細(xì)胞發(fā)生途徑：花藥培養(yǎng)中的小孢子發(fā)育成 4）原生質(zhì)體發(fā)生途徑,胚性愈傷組織,44,1）生長(zhǎng)素 2）其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用 3）氨源形態(tài)的影響 4）其他培養(yǎng)條件對(duì)胚狀體發(fā)生的影響,3.3 體細(xì)胞胚狀體誘導(dǎo)的影響因素,45,3.4 體細(xì)胞胚狀體誘導(dǎo)的影響因素,1）生長(zhǎng)素 形成體細(xì)胞胚的關(guān)鍵是除去或降低培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素成分（如2,4-D）。 愈傷組織在生長(zhǎng)素0.5～1mg/L的培養(yǎng)基上分化形成分生細(xì)胞團(tuán)（稱胚性細(xì)胞團(tuán)）； 轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)素含量很低或沒(méi)有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上，就能發(fā)育為胚狀體。,46,,原因：2,4-D等生長(zhǎng)素可以誘導(dǎo)內(nèi)源乙烯（Eth）產(chǎn)生；內(nèi)源Eth不影響愈傷增殖，但抑制愈傷組織進(jìn)一步分化成胚。 乙烯也會(huì)導(dǎo)致纖維素酶或（和）果膠酶活性的增強(qiáng)，從而破壞胚性細(xì)胞團(tuán)，使原胚不能發(fā)生組織分化。,47,,2）其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用 細(xì)胞分裂素有利于胚狀體的形成 0.1μg·L-1 玉米素促進(jìn)胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生。 GA3、ABA抑制成胚；,48,,3）氨源形態(tài)的影響 還原N（NH4+） 氧化N（NO3-） 有機(jī)氮 （氨基酸、水解酪蛋白等） 野生胡蘿卜葉柄節(jié)段的培養(yǎng)中，只有在含一定數(shù)量還原態(tài)氮的培養(yǎng)基時(shí)，才能有胚胎發(fā)生， 用NH4+ 和水解酪蛋白優(yōu)于NO3- 或谷氨酰胺。,49,,4）其他培養(yǎng)條件對(duì)胚狀體發(fā)生的影響 液體培養(yǎng) 適宜pH5-6 光照：不需要光或半天光照時(shí)間 溫度25 ℃左右,50,,光照強(qiáng)度50-60 μE m2 s-1,光照強(qiáng)度5-10 μE m2 s-1,(圖 光對(duì)大豆不同品種子葉體細(xì)胞胚發(fā)生的影響 ),51,3.4 體細(xì)胞胚途徑再生植物的優(yōu)點(diǎn),1）數(shù)量比不定芽多 2）獲得速度快 3）結(jié)構(gòu)完整 4）胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和保存； 5）胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。,52,第五章 愈傷組織的培養(yǎng),第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化 第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生 第三節(jié) 人工種子,53,人工種子是指外面包裹一層有機(jī)薄膜的植物胚狀體。 胚狀體或芽：有生命的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。 人工胚乳：供胚狀體維持生命力。 人工種皮：保護(hù)作用。,1 定義與結(jié)構(gòu),第三節(jié) 人工種子,54,1）結(jié)構(gòu)完整，體積小，便于貯藏與運(yùn)輸，可直接播種，易于機(jī)械化操作； 2）不受季節(jié)限制，不受環(huán)境制約，胚狀體數(shù)量多、繁殖快、有利于工廠化生產(chǎn)；,人工種子的優(yōu)點(diǎn):,3) 有利于繁殖生育周期長(zhǎng)、自交不親合、珍貴稀有的一些植物，也可大量繁殖無(wú)病毒材料； 4) 加入抗生素、農(nóng)藥、菌肥等成分，提高人工種子活力和品質(zhì)； 5) 由無(wú)性繁殖體系產(chǎn)生胚， 固定雜種優(yōu)勢(shì)。,55,2 制作,,,,人工種子制作過(guò)程,,,,,,,,,胚狀體,人工胚乳,,,其他物質(zhì),,,人工種皮,,包埋技術(shù),56,第一步胚狀體誘導(dǎo),1）選取目標(biāo)植物 2）誘導(dǎo)愈傷組織 3）愈傷組織增生 4）胚狀體誘導(dǎo),57,胚狀體同步增殖：,DNA合成抑制劑 低溫處理 調(diào)節(jié)滲透壓 分離過(guò)篩 調(diào)節(jié)植物激素配比,58,第二步人工胚乳制作,人工胚乳的成分 無(wú)機(jī)鹽混合物 碳水化合物：淀粉和糖 蛋白質(zhì) 各種附加成分：如固氮細(xì)菌、殺蟲劑、殺菌劑、除草劑和植物激素等,59,第三步 人工種皮制作,1）包埋介質(zhì)的選擇： 無(wú)毒、透氣、保水性好 有足夠硬度（不脹大），保證安全（不泄露營(yíng)養(yǎng)物） 包埋材料： 瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、淀粉、動(dòng)物膠、角叉膠、刺槐豆膠、阿拉伯樹膠、果膠、蛋白膠、黃芪膠等種類。,60,2）包埋技術(shù) 用褐藻酸鈉等水溶性凝膠經(jīng)與Ca2+進(jìn)行離子交換后凝固，用于包埋單個(gè)胚狀體。,61,62,,,63,貯藏與發(fā)芽 一般將人工種子貯藏在4-7℃低溫、相對(duì)濕度小于67%的條件下。實(shí)際上，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，人工種子的萌發(fā)率會(huì)顯著下降。,64,現(xiàn)在已有胡蘿卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡膠等幾十種植物的人工種子試種成功，但由于成本較高，中國(guó)尚未應(yīng)用于生產(chǎn)。,黃連,65,人工種子取得了很大的進(jìn)展，但至今仍有一些問(wèn)題沒(méi)有解決： ◆人工種皮尚不盡如人意，貯藏困難 ◆生產(chǎn)成本高 ◆流程復(fù)雜,4 局限性：,66,第五章 愈傷組織的培養(yǎng),第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化 第二節(jié) 愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生 第三節(jié) 人工種子,67,,1.名詞解釋：愈傷組織 胚狀體,2.愈傷組織培養(yǎng)對(duì)外植體有何要求？,3.愈傷組織形態(tài)發(fā)生有哪些情況？,思考題,68,,器官培養(yǎng)（Organ culture ） ： 主要指植物根、葉、莖、花、果實(shí)等器官在離體條件下，在無(wú)菌的人工環(huán)境種做進(jìn)一步培養(yǎng)發(fā)育，最終長(zhǎng)成幼苗的過(guò)程。 特點(diǎn)：能保持它們所具有的特征性結(jié)構(gòu)，通過(guò)器官培養(yǎng)可快速大量地繁殖。,第六章 營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng),69,第六章 營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng),第一節(jié) 根的培養(yǎng) 第二節(jié) 莖的培養(yǎng) 第三節(jié) 葉的培養(yǎng),70,