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. 1、LogKow的公式 Kow定義為分配平衡時某一有機化合物在辛醇相中的濃度（C0）與其在水相中非解離形式濃度（Cw）的比值，即： Kow=C0/Cw LogKow即為對Kow取對數(shù)。由上述對Kow的定義可以看出，LogKow值代表著物質(zhì)在有機相和水相中的分配，也即物質(zhì)在細(xì)胞中的溶解性情況（相似相溶）。LogKow數(shù)值越大，代表有機化合物在辛醇中的濃度越高，即表明物質(zhì)較容易穿過細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，越容易進入細(xì)胞；反之，LogKow數(shù)值越小，代表有機化合物在辛醇中的濃度越低，物質(zhì)較不容易穿過細(xì)胞膜的的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，越容易溶于細(xì)胞外水溶液。 測定PBDE同系物的辛醇-水分配系數(shù)，首先可以用實驗方法： （1） 產(chǎn)生柱法：將一定體積的PBDE正辛醇（水飽和）溶液加入產(chǎn)生柱中，使用一定體積的蒸餾水（正辛醇飽和）循環(huán)通過恒溫（25+0.5℃）產(chǎn)生柱中過程的正辛醇層，連續(xù)測定5個水相濃度，直至兩相平衡，由此求出分配系數(shù)。 （2） 反相高效液相色譜法：利用反向液相色譜系統(tǒng)來模擬正辛醇—水分配系統(tǒng)。在HPLC系統(tǒng)中測試出PBDE及已知其LogKow值的參比物的容量因子K，再根據(jù)參比物的lgK-lgKow標(biāo)準(zhǔn)曲線計算PBDE的lgKow值。 其次可以用Leo碎片法計算得，即是基于從經(jīng)驗得來的碎片常數(shù)f和結(jié)構(gòu)因子F的加和， 即lgKow=∑碎片常數(shù)〔f〕+結(jié)構(gòu)因子（F） f和F值可以通過查表得到，要輸入的唯一信息是化合物的結(jié)構(gòu)參數(shù)，但PBDE中連接的結(jié)構(gòu)類型較為復(fù)雜，所以碎片可能會有很多f值可用，考慮的因子過多，容易出現(xiàn)誤差。 再次可以使用EPI Suite 軟件進行計算，這種方法較為方便且對于疏水性較強的PBDE，計算值更為精準(zhǔn)。 2、PCR技術(shù)的原理 PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 PCR技術(shù)的應(yīng)用: 1、核酸的基礎(chǔ)研究：基因組克隆 2、不對稱PCR制備單鏈DNA用于DNA測序 3、反向PCR測定未知DNA區(qū)域 4、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）用于檢測細(xì)胞中基因表達水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA 5、熒光定量PCR用于對PCR產(chǎn)物實時監(jiān)控 6、cDNA末端快速擴增技術(shù) 7、檢測基因的表達 8、醫(yī)學(xué)應(yīng)用：檢測細(xì)菌、病毒類疾??；診斷遺傳疾病；診斷腫瘤；應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)。 PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛：生命學(xué)科，醫(yī)學(xué)工程，遺傳工程，疾病診斷，法醫(yī)學(xué)，考古學(xué)都有其運用。PCR除了是一個診斷工具外，更重要的是它有廣泛的運用。在我所研究的環(huán)境科學(xué)方向中，可以利用PCR本身直接可用來鑒定特定基因的存在與否的特點，對環(huán)境中能對污水起凈化作用的菌種進行PCR技術(shù)鑒定?？梢赃M一步了解該菌種的凈化機理，有利于菌種培養(yǎng)。也可以用來偵測基因是否有異常 (Gene mutation, deletion, and rearrangement)。另外在演化上的分析，經(jīng)由PCR的運用也產(chǎn)生重大的進展。近來，在環(huán)境科學(xué)的研究上，特別是細(xì)胞間訊息的傳遞分子，諸如介白質(zhì) (Interleukines) 及各種生長因子 (Growth factors) 基因的表現(xiàn)都可用PCR來進行質(zhì)與量的分析。 3、微生物學(xué)家生平 歷屆列文虎克獎得主 1877 C. G. Ehrenberg，Germany 1885 F. Cohn，Poland 1895 L. Pasteur，F(xiàn)rance 1905 M. W. Beijerinck，Netherlands 1915 Sir D. Bruce，United Kingdom 1925 F. d’Herelle，Egypt 1935 S. Nikolaevitch Winogradsky，F(xiàn)rance 1950 S. A. Waksman，United States 1960 A. Lwoff，F(xiàn)rance 1970 C. B. van Niel，United States 1981 R. Y. Stanier，F(xiàn)rance 1992 C. R. Woese，United States 2003 Karl Stetter，Germany 部分簡介： 1877 C. G. Ehrenberg，Germany 克里斯汀戈特弗里德埃倫伯格（1795.4.19－1876.6.27），生于德國德利慈（Delitzsch），他最早在萊比錫大學(xué)研讀神學(xué)，后來到柏林研讀醫(yī)學(xué)與自然科學(xué)。探險家亞歷山大馮洪堡是他的好友。著名博物學(xué)家、動物學(xué)家、比較解剖學(xué)家、地理學(xué)家、微生物學(xué)家。他是當(dāng)代最多產(chǎn)的自然科學(xué)家之一，細(xì)菌即是由他命名的。 1905 M. W. Beijerinck，Netherlands 拜耶林克就讀于荷蘭萊頓大學(xué)，并在在瓦赫寧根大學(xué)農(nóng)業(yè)學(xué)校微生物專業(yè)（現(xiàn)在的瓦赫寧恩大學(xué)）成為了一名教師，后來在代爾夫特技術(shù)學(xué)院（現(xiàn)代爾夫特理工大學(xué)）（從1895年）。他建立了代爾夫特大學(xué)微生物學(xué)。他研究農(nóng)業(yè)微生物學(xué)和工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域的生物學(xué)。他卻不公平的被同時代的羅伯特科赫和路易斯巴斯德所掩蓋，因為與他們不同，拜耶林克沒研究過人類疾病。 他被認(rèn)為是病毒學(xué)的開創(chuàng)者，他在1898年通過過濾實驗證明煙草花葉病的病原體比細(xì)菌還要細(xì)小，并因此推論出病毒的存在。他把這種病原體命名為“virus”。（伊萬諾夫斯基也在1892年發(fā)現(xiàn)了病毒，但他沒有公布他的發(fā)現(xiàn)。）他主張病毒是一種液體，但后來美國化學(xué)家斯坦利證明了病毒其實是微粒。[1] 拜耶林克也發(fā)現(xiàn)了氮氣轉(zhuǎn)化為植物所能夠吸收的銨離子的過程──固氮作用。在這個過程中，附于某些品種植物（莢果）的根部上的細(xì)菌為其提供養(yǎng)分，是植物與細(xì)菌之間的共生的典型例子，也對維持泥土肥沃起著關(guān)鍵作用。 拜耶林克發(fā)現(xiàn)了通過還原硫酸鹽進行缺氧呼吸的細(xì)菌，他認(rèn)識到細(xì)菌能夠以硫酸鹽代替氧氣作為最終電子受體。這個發(fā)現(xiàn)深遠(yuǎn)地影響到我們現(xiàn)時對生物地質(zhì)化學(xué)循環(huán)的認(rèn)識。 1935 S. Nikolaevitch Winogradsky，F(xiàn)rance 謝爾蓋尼古拉耶維奇維諾格拉茨基(1856. 9. 1－1953. 2. 25）是俄國一位著名微生物學(xué)家，土壤微生物學(xué)的創(chuàng)立者之一。首先發(fā)現(xiàn)硝化作用為硝化細(xì)菌所引起。1885～1888年間，分離得到能使銨氧化為亞硝酸鹽的亞硝化單胞菌屬和亞硝化球菌屬以及能使亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽的硝化桿菌屬兩種細(xì)菌。同時，他還研究了貝日阿托氏菌后確定了它利用無機物硫化氫作為能源、以二氧化碳作為碳源。他的研究揭示了土壤中化能無機營養(yǎng)型細(xì)菌的存在。 1992 C. R. Woese，United States卡爾理查德烏斯（1928年生于紐約州錫拉丘茲）是一位美國微生物學(xué)家和物理學(xué)家。烏斯因在1977年由對16S 核糖體RNA種系發(fā)生分類學(xué)分析定義了古菌（生物的一個新的域）而知名。他還是RNA世界學(xué)說的創(chuàng)始人，雖然當(dāng)時該理論還不叫那個名字。 2003 Karl Stetter，Germany一個邊緣生命的頑強追尋者贏得了微生物學(xué)的最高榮譽。2003年11月24日，德國雷根斯堡大學(xué)的極端微生物（extremophiles）專家Karl Stetter接受了荷蘭皇家科學(xué)院頒發(fā)的列文虎克勛章。 Stetter是世界上最成功的超嗜熱菌（hyperthermophiles）培養(yǎng)者，超嗜熱菌是指在能在90℃以上環(huán)境中生活且繁殖速度最快的微生物，而這個溫度條件下其它微生物立刻就會死亡。他和他的同事已經(jīng)識別出超過45種新古生菌物種，許多古生菌都能在滾燙的80C水域中生活。 Stetter是在一次家庭度假時做出其一生中最重大發(fā)現(xiàn)之一的。1980年，他和他的同事在冰島熱泉中發(fā)現(xiàn)了在80C以上溫度中生活的細(xì)菌?！熬褪窃谀菚r我靈感迸發(fā)?！彼f，“我想，上帝呀，還應(yīng)該有其它的細(xì)菌也能在高溫下生活。會不會還有細(xì)菌能在100C的沸水中生存？”懷疑德國政府不會資助這樣一個不著邊際的想法，他和他的妻子、也是一名微生物學(xué)家的Heidi決定在第二年夏季到西西里島附近的Vulcano島度假。在那兒，Heidi和他們6歲的女兒Sabine在裝滿取樣設(shè)備的救生筏上等待，Stetter則潛入火山熱孔中收集溫度范圍從105C到110C超熱水樣本。Heidi幫助把樣本裝到瓶子里，而Sabine負(fù)責(zé)讀取樣本的pH值，他回憶說?；氐綄嶒炇液?，Stetter檢測到這些超熱水樣本中含有豐富的超嗜熱菌。Stetter和他的同事最終從熱孔樣本中識別出11個新物種。 卡爾?烏斯（carl woese）20世紀(jì)70年代，卡爾博士率先研究了原核生物的進化關(guān)系。他沒有按常規(guī)靠細(xì)菌的形態(tài)和生物化學(xué)特性來研究，而是靠分析由dna序列決定的另一類核酸--核糖核酸（rna）的序列分析來確定這些微生物的親緣關(guān)系。 烏斯和他的同事們研究細(xì)菌的核糖核蛋白體中rna序列時，發(fā)現(xiàn)并不是所有的微小生物都是親戚。他們發(fā)現(xiàn)原來我們以為同是細(xì)菌的大腸桿菌和能產(chǎn)生甲烷的微生物在親緣關(guān)系上竟是那么不相干。它們的rna序列和一般細(xì)菌的差別一點也不比與魚或花的差別小。產(chǎn)甲烷的微生物在微生物世界是個異類，因為它們會被氧氣殺死，會產(chǎn)生一些在其它生物中找不到的酶類，因此他們把產(chǎn)生甲烷的這類微生物稱為第三類生物。后來又發(fā)現(xiàn)還有一些核糖核蛋白體rna序列和產(chǎn)甲烷菌相似的微生物，這些微生物能夠在鹽里生長，或者可以在接近沸騰的溫泉中生長。而我們知道，早期的地球大氣中沒有氧氣，而含有大量氨氣和甲烷，可能還非常熱。在這樣的條件下植物和動物無法生存，對這些微生物卻非常合適。在這種異常地球條件下，只有這些奇異的生物可以存活，進化并在早期地球上占統(tǒng)治地位，這些微生物很可能就是地球上最古老的生命。 因此，烏斯把這類第三生物定名為古生菌（archaea），成為和細(xì)菌域、真核生物域并駕齊驅(qū)的三大類生物之一。他們開始還沒有如此大膽，只是稱為古細(xì)菌（archaebacteria），后來他們感到這個名詞很可能使人誤解是一般細(xì)菌的同類，顯不出它們的獨特性，所以干脆把“bacteria”后綴去掉了。這就是古生菌一詞的來由。 路易斯 巴斯德Louis Pasteur (1822～1895).法國微生物學(xué)家,化學(xué)家。1847年他研究酒石酸的旋光性，發(fā)現(xiàn)酒石酸有右旋和左旋現(xiàn)象，經(jīng)過10年研究后提出分子不對稱性理論，開創(chuàng)了立體化學(xué)研究的途徑。在里爾他從事發(fā)酵、釀造的研究。1857年他發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌能導(dǎo)致乳酸發(fā)酵。他研究酵母的酒精發(fā)酵及其他微生物的發(fā)酵作用,證明了發(fā)酵是微生物活動的結(jié)果,不同微生物引起不同類型的發(fā)酵，創(chuàng)立了發(fā)酵的生物學(xué)理論，并建立了至今還在使用的消滅酒中雜菌的低溫消毒技術(shù)即巴斯德消毒法。他經(jīng)過5年研究,找出了威脅法國養(yǎng)蠶業(yè)的“蠶瘟”的病原體蠶微粒子，并提出了防治措施。他還研究了蠶的軟化病，發(fā)現(xiàn)了致病的弧菌。1868年他因病身體部分癱瘓，但仍繼續(xù)進行研究工作。1877年以后研究了人畜的多種傳染病如炭疽病、氣性壞疽、雞霍亂、疔瘡、骨髓炎、產(chǎn)褥感染、豬丹毒和狂犬病等。他成功地分離出并在實驗室中培養(yǎng)了炭疽桿菌，研究了病原菌的性質(zhì)。1880年他又分離出雞霍亂菌，并發(fā)現(xiàn)弱化的霍亂菌不能致病卻能使雞獲得免疫,根據(jù)這一發(fā)現(xiàn),他用經(jīng)高溫培養(yǎng)弱化了的炭疽病菌,對炭疽病試行防治,取得預(yù)期效果。對狂犬病的研究是他科學(xué)生涯中最后、也是最重要的一項工作。 賽爾曼?A?瓦克斯曼(Selman Abraham Waksman)（1888年7月22日－1973年8月16日），烏克蘭裔美國生物化學(xué)家和微生物學(xué)家。瓦克斯曼發(fā)現(xiàn)了鏈霉素和其他抗生素。瓦克斯曼首先將鏈霉素用于治療肺結(jié)核病人。瓦克斯曼因此獲得1950年Leeuwenhoek Medal;1952年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。 可奈里斯?貝爾那多斯?封?尼爾（Cornelis,Bernardus,Van,Niel）,德國人.發(fā)現(xiàn)紅色細(xì)菌的厭氧光合作用 獲得1970年Leeuwenhoek Medal. 4、簡述三種MIP技術(shù)(Southern blotting, northern blotting, western blotting 三種分子fp跡技術(shù)的原理和異同) 印跡（blotting）是生物學(xué)實驗中常用的檢測和分析方法。印跡（blotting）實驗的過程可以簡單描述為將待檢測的生物大分子經(jīng)電泳等方法分離后轉(zhuǎn)移并固定在膜（如：硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜）上，然后用特異性識別物質(zhì)（如探針）去識別，最后經(jīng)顯色反應(yīng)（同位素放射自顯影、熒光、化學(xué)發(fā)光等）在膜上顯示出結(jié)果------印跡。 Western Blotting與Southern Blotting、Northern Blotting的技術(shù)原理差別還是比較大的。這種差別體現(xiàn)在Southern Blotting和Northern Blotting是基于DNA和RNA分子之間堿基互補配對的特異性識別能力，而Western Blotting則基于抗原抗體之間特異的免疫反應(yīng)。Southern Blotting和Northern Blotting時使用帶有標(biāo)記（如同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記）的DNA或RNA探針去識別并結(jié)合到待檢測核酸上，然后直接顯影；而Western Blotting時要先用待檢測蛋白的“一抗”結(jié)合到待檢測蛋白上，再用可識別“一抗”并偶聯(lián)了某種酶的“二抗去檢測”一抗“，最后通過顯色反應(yīng)的信號來顯示待檢測蛋白的存在與否及量的多少。 另外，Southern Blotting和Northern Blotting兩者比較容易混淆。這兩種技術(shù)最關(guān)鍵的區(qū)別在于待檢測核酸的屬性，如果被檢測的是DNA，則該技術(shù)就是Southern Blotting，其探針可以是DNA也可以是RNA；類似地，如果被檢測的是RNA，不管探針是RNA還是DNA，該方法就叫作Northern Blotting。 除了以上三種Blotting技術(shù)，還有兩種不太常見的Blotting技術(shù)：Eastern Blotting和Southwestern blotting。 Eastern Blotting 是一種檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾的技術(shù)，其檢測目標(biāo)是蛋白質(zhì)上特定的修飾基團或部位，如脂肪酸鏈、糖基、磷酸化的氨基酸等等。在Eastern Blotting實驗中，通常要先用2D電泳將蛋白質(zhì)分離，然后轉(zhuǎn)到膜上，再用特異的探針去檢測。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能過程中普遍存在的調(diào)控手段！ Southwestern blotting 是一種檢測DNA和蛋白質(zhì)互作的方法，因此才有Southwestern之稱。首先用SDS-PAGE的方法將蛋白質(zhì)分離開來并轉(zhuǎn)移到膜上，然后在尿素的存在下去除SDS使蛋白盡可能復(fù)性，最后用帶標(biāo)記的特定序列的DNA探針去檢測。 以上簡單介紹的幾種Blotting技術(shù)都以檢測某種生物大分子的存在（或量的多少）為目的，所使用的去識別待檢測物質(zhì)的探針或抗體與待檢測物質(zhì)之間的結(jié)合是已知的、確定的。在這一點上做文章，就可以把blotting技術(shù)推廣到驗證蛋白質(zhì)相互作用這個領(lǐng)域。 5、吸收光譜與發(fā)射光譜的區(qū)別，分別列舉。 吸收光譜 發(fā)射光譜 定義 當(dāng)物質(zhì)所吸收的電磁輻射能與該物質(zhì)的原子核、原子或分子的兩個能級間躍遷所需的能量滿足△E = hv的關(guān)系時，將產(chǎn)生吸收光譜。 物質(zhì)通過電致激發(fā)、熱致激發(fā)或光致激發(fā)等激發(fā)過程獲得能量，變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)原子或分子M* ，當(dāng)從激發(fā)態(tài)過渡到低能態(tài)或基態(tài)時產(chǎn)生發(fā)射光譜。通過測量物質(zhì)的發(fā)射光譜的波長和強度來進行定性和定量分析的方法叫做發(fā)射光譜分析法。 能量吸收/發(fā)射類型 原子吸收、分子吸收、磁場誘導(dǎo)吸收 原子發(fā)射、分子發(fā)射 光譜吸收類型 紫外可見分光光度法、原子吸收光譜法、紅外吸收光譜法、順磁共振波譜法、核磁共振波譜法 g 射線光譜法、X射線熒光分析法、原子發(fā)射光譜分析法、原子熒光光譜分析法、分子熒光光譜分析法、分子磷光光譜分析法、化學(xué)發(fā)光分析法 激發(fā)方式 粒子轟擊，發(fā)生X射線 高壓交流火花、電弧，產(chǎn)生紫外、可見或紅外輻射 電磁輻射照射，產(chǎn)生熒光 放熱的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光 6、色譜與質(zhì)譜的區(qū)別，描述連用技術(shù)（可參考21） 色譜法,又稱色層法或?qū)游龇?，是一種物理化學(xué)分析方法，它利用不同溶質(zhì)（樣品）與固定相和流動相之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別，當(dāng)兩相做相對移動時，各溶質(zhì)在兩相間進行多次平衡，使各溶質(zhì)達到相互分離。 質(zhì)譜分析法是通過對被測樣品離子的質(zhì)荷比的測定來進行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運動行為的不同，把離子按質(zhì)荷比（m/z）分開而得到質(zhì)譜，通過樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果。 氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。 氣質(zhì)聯(lián)用儀，廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與鑒定中，其分辨率和靈敏度 氣質(zhì)聯(lián)用儀是生物樣品中藥物與代謝物定性定量的有效工具。氣質(zhì)聯(lián)用儀被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與鑒定，其具有GC的高分辨率和質(zhì)譜的高靈敏度，是生物樣品中藥物與代謝物定性定量的有效工具。 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：、親水性強、揮發(fā)性低的有機物，熱不穩(wěn)定化合物及生物大分子不揮發(fā)性化合物分析測定。HPLC-MS除了可以分析氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）所不能分析的強極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個方面的優(yōu)點：①分析范圍廣，MS幾乎可以檢測所有的化合物，比較容易地解決了分析熱不穩(wěn)定化合物的難題；②分離能力強，即使被分析混合物在色譜上沒有完全分離開，但通過MS的特征離子質(zhì)量色譜圖也能分別給出它們各自的色譜圖來進行定性定量；③定性分析結(jié)果可靠，可以同時給出每一個組分的分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；④檢測限低，MS具備高靈敏度，通過選擇離子檢測（SIM）方式，其檢測能力還可以提高一個數(shù)量級以上；⑤分析時間快，HPLC-MS使用的液相色譜柱為窄徑柱，縮短了分析時間，提高了分離效果；⑥自動化程度高，HPLC-MS具有高度的自動化。 7、微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分析方法及優(yōu)缺點 （1）傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法 優(yōu)：可以檢測環(huán)境中的活細(xì)胞，且對微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展起很重要的作用。 缺：采用配比簡單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少(<1%)，因而不能全面地反映微生物區(qū)系組成狀況，煩瑣、耗時。 （2）群落水平生理學(xué)指紋方法 通過檢測微生物樣品對多種不同的單一碳源的利用能力，來確定哪些基質(zhì)可作為能源，從而產(chǎn)生對基質(zhì)利用的生理代謝指紋，如BIOLOG鑒定系統(tǒng)。 優(yōu)：自動化，快速，目前已可用于絲狀真菌的鑒定 缺：僅能鑒定快速生長的微生物，誤差較大（pH），擁有的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫還不完善 （3）生物標(biāo)記物法 利用特定的標(biāo)記物標(biāo)記特定的微生物，將生物標(biāo)記物的組成模式（種類、數(shù)量和相對比例）作為指紋，估價微生物群落結(jié)構(gòu)。具體的方法是，先用一種合適的提取劑直接把生物標(biāo)記物從環(huán)境中提取出來，然后對提取物進行純化，后用合適的食品加以定量測定，如醌指紋法、脂肪酸圖譜分析。 優(yōu)點：不需要分離，克服由于培養(yǎng)而導(dǎo)致的微生物種群變化，具有一定的客觀性。 （4）以PCR為基礎(chǔ)的rRNA基因的分析方法 可用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析的基因組DNA的序列包括：核糖體操縱子基因序列（rDNA）、已知功能基因的序列、重復(fù)序列和隨機基因組序列等。方法包括克隆庫法、末端限制性片段長度多態(tài)性分析（TRFLP）、熒光原位雜交（FISH）、變性梯度凝膠電泳等。 優(yōu)：最常用的標(biāo)記序列rRNA（rDNA）在細(xì)胞中相對穩(wěn)定，同時含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類的一個重要指標(biāo)。 方法 定義 優(yōu)點 缺點 克隆文庫 利用PCR擴增特定的基因 片段,建立克隆庫然后測 序分析多樣性. 實現(xiàn)復(fù)雜微生物群落的高 分辨率分析,提供群落中優(yōu) 勢成員的信息. 測序數(shù)量有限,結(jié)果不能 反映真正的多樣性,無法 定量. 工作量大。 DGGE 通過PCR擴增特定的基因 片段,利用DNA解鏈點和GC 含量不同在變性膠上實現(xiàn) 分離. 快速,可作多樣品分析,直 觀呈現(xiàn)物種豐度,可分析菌 群的時間動態(tài)性,可切膠對 條帶測序鑒定未知菌. 對多樣性高的樣品結(jié)果 不太理想,分辨率低, 分 析序列較短影響特異性 及二次引物設(shè)計. FISH 利用熒光標(biāo)記的各類16s rRNA寡核苷酸探針,進行 原位雜交探測 提供固定群落中微生物形 態(tài)、空間分布的信息。 分辨率低 T-RFLP 應(yīng)用熒光標(biāo)記引物擴增基 因,PCR產(chǎn)物用限制性酶切 后產(chǎn)生不同長度的帶標(biāo)記 片段, 可用色譜法分離 快速,可作多樣品分析, 提 供群落中優(yōu)勢成員的信息, 可分析菌群的時間動態(tài)性. 分辨率低, 無法結(jié)合測 序, 對未知菌株無法鑒 定. Next-gen sequencing 利用合成原理的高度平行 測序技術(shù)，直接分析基因 多樣性. 可以測量高豐度菌群的變 化,可以鑒定新種. 信息量極大，重復(fù)性比 較有挑戰(zhàn)性,測序長度不 長, 可能影響分析結(jié)果. PhyloChip Assay 利用已知微生物序列的數(shù) 據(jù)庫設(shè)計探針的微距陣雜 交技術(shù). 快速, 可定量, 不管是高 豐度還是低豐度的菌群都 可以提供可重復(fù)的結(jié)果. 已知微生物的數(shù)據(jù)庫總 是在擴展, 所以特定時 間內(nèi)有局限性. 8、六溴聯(lián)苯醚和七溴聯(lián)苯醚結(jié)構(gòu)與功能 多溴聯(lián)苯醚的最大用途是作為阻燃劑，在產(chǎn)品制造過程中添加到復(fù)合材料中去，以提高產(chǎn)品的防火性能。多溴聯(lián)苯醚(PBDES)是一類環(huán)境中廣泛存在的全球性有機污染物。由于其具有環(huán) 多溴聯(lián)苯醚境持久性，遠(yuǎn)距離傳輸，生物可累積性及對生物和人體具有毒害效應(yīng)等特性，對其環(huán)境問題的研究已成為當(dāng)前環(huán)境科學(xué)的一大熱點。 在室溫下，PBDEs具有蒸汽壓低和親脂性強的特點，沸點為310℃～425℃，在水中溶解度很小，且其隨著溴代數(shù)目的增加而降低，所以一般做處理研究時，都是將其溶于有機溶劑或有機溶劑和水的混合液中。由于其在室溫下蒸汽壓低和親脂性強的特點，可以散逸到空氣中，隨大氣長距離遷移；可以隨食物鏈生物富集和放大。在水中溶解度與正辛醇/水分配系數(shù)有關(guān)。PBDEs與多氯聯(lián)苯（PCBs）相似，PBDEs化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在自然界很難發(fā)生化學(xué)降解和光降解，也很難被微生物降解。商業(yè)產(chǎn)品中工業(yè)五溴聯(lián)苯醚毒性最大，在很低的劑量下就可以引起毒性，而十溴聯(lián)苯醚則需要很大劑量才能表現(xiàn)出來。 除了生產(chǎn)廠家以粉塵的方式向周圍環(huán)境排放外，多溴聯(lián)苯醚污染環(huán)境的主要途徑是對于含多溴聯(lián)苯醚的電子垃圾進行焚燒、粉碎和掩埋處理等。由于多溴聯(lián)苯醚在環(huán)境中相當(dāng)穩(wěn)定，難以降解，所以，土壤里的殘留量逐年增加。而且多溴聯(lián)苯醚不溶于水，易溶于脂肪，所以，容易被動物吸收而在食物鏈中逐漸富集。 兩者屬于POPs，是多溴聯(lián)苯醚（PBDE）的同系物。 具有以下特點：?易釋放：無化學(xué)鍵束縛，游離狀態(tài)?化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定?親脂疏水性?生物富集、食物鏈放大?高溫分解為劇毒PBDDs?肝毒性、甲狀腺受體毒性、發(fā)育毒性 比較分析PBDE與不同物種甲狀腺激素受體相互作用的分子機理： 首先，應(yīng)當(dāng)構(gòu)建污染物小分子和激素受體蛋白質(zhì)大分子的結(jié)構(gòu)。用ChembioOffice中的Chemdraw，MOE或SYBYL-X等軟件畫出PBDE的結(jié)構(gòu)，而構(gòu)建甲狀腺激素受體TR的晶體結(jié)構(gòu)可利用同源模建技術(shù)，如I-TASSER server或Suiss-Model模建軟件進行構(gòu)建，或從PBD數(shù)據(jù)庫中直接提取甲狀腺激素受體TR的晶體結(jié)構(gòu)。 其次，將構(gòu)建好的PBDE分子與甲狀腺激素受體結(jié)構(gòu)利用如eHiTS軟件進行分子對接分析，形成復(fù)合物，使我們更為客觀的理解污染物小分子與激素受體大分子之間的聯(lián)系，以便于研究者選擇在QSAR研究中表征PBDE與甲狀腺激素受體之間反應(yīng)的分子特征參數(shù)。后可通過分子動力學(xué)模擬技術(shù)，如利用Amber 11，NAMD，Thinker等軟件對PBDE與受體結(jié)合后復(fù)合物間的相互作用進行動態(tài)模擬。通過高分辨率的視覺觀察，進一步了解PBDE與受體間的結(jié)合模式，對復(fù)合物進行構(gòu)象分析，觀察出受體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化位點，從而找出對應(yīng)氨基酸突變，在分子層面上對污染物與蛋白質(zhì)受體的相互作用機理有了更為科學(xué)客觀的解釋。 9、工業(yè)催化與環(huán)境催化的區(qū)別 差異 工業(yè)催化 環(huán)境催化 反應(yīng)物濃度 ≧90%，可以更加精制 ppb-ppm 反應(yīng)毒物濃度 <1%，甚至完全去除 5-20%，反應(yīng)物濃度的數(shù)百倍或數(shù)萬倍，不可去除 反應(yīng)條件 可選擇423-773k， 可選擇空速1000-5000/h 溫度：300-1273k 空速可達10000000/h 10.生物培養(yǎng)法制取可燃燃料技術(shù) 這種技術(shù)就是我們通常所說的“水變油技術(shù)”。其原理是：通過在水中有目的的養(yǎng)殖藻類作物，利用藻類的光合作用獲得碳?xì)浠衔锘蛘咛細(xì)溲趸衔?，然后通過其他方法制取相應(yīng)的可燃燃料。 藻類作物產(chǎn)品主要有兩種途徑用以制取可燃燃料。方法一是從經(jīng)過處理的藻類產(chǎn)品中提煉中間產(chǎn)品，繼而通過化學(xué)合成的方法制取合成汽油。方法二是對藻類產(chǎn)品進行發(fā)酵，提煉后直接獲得醇類燃料產(chǎn)品——如甲醇、乙醇等產(chǎn)品。方法一和方法二也可以結(jié)合使用。 由于藻類作物生長時需要消耗大量的氮磷等元素，因此該技術(shù)尤其適合與城市污水廠整合，用于處理生活污水，如能控制好成本問題，將擁有良好的發(fā)展前景。 其二 最新一期《自然》雜志報道了美國賓西法尼亞州立大學(xué)教授克雷格.格蘭姆斯的“水變油”實驗：賓西法尼亞大學(xué)操場內(nèi)，上演了一幕讓人瞠目結(jié)舌的奇跡。研究者將二氧化碳和水蒸氣裝入一種納米試管中，在光的作用下，開始發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成俗稱“天然氣”的甲烷。 13 年后，原本只會在科幻片中出現(xiàn)的“水變油”技術(shù)變成現(xiàn)實，他的發(fā)明者同樣是美國高校的一群科學(xué)家。賓西法尼亞州立大學(xué)材料工程學(xué)教授克雷格.格蘭姆斯和他在賓西法尼亞州立大學(xué)的同事們一起在學(xué)校的草地內(nèi)，用二氧化鈦納米管（大約135 納米寬，0.1 毫米長）去催化水蒸氣和二氧化碳，結(jié)果喜出望外地得到想要的結(jié)果——碳?xì)浠铩? “這是一個相當(dāng)艱難的項目，我們?yōu)榇搜芯砍^一年半，而且是在完全沒有先例參考的情況下完成的。” 格蘭姆斯告訴記者，盡管在他之前，已經(jīng)有科學(xué)家提出了用二氧化鈦納米顆粒催化反應(yīng)，但由于催化效果不明顯，科學(xué)家普遍認(rèn)為這一研究沒有任何價值。對此，格蘭姆斯卻提出不同觀點。經(jīng)過無數(shù)次的失敗嘗試，他發(fā)現(xiàn)當(dāng)水蒸氣和二氧化碳通過二氧化鈦納米管，同時引入氮氣，另外在納米管的表面負(fù)載了銅和鉑的納米顆粒，生成碳?xì)浠瘜W(xué)物的速度比以前快了20 倍左右。 格蘭姆斯還指出，“水變油”技術(shù)順帶提供給二氧化碳一個絕佳的處理方式。“我相信如果有一個集中的二氧化碳來源，就像煤電廠一樣，這個生產(chǎn)工藝就能得到工業(yè)應(yīng)用?！? 瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)校的物理化學(xué)家Michael Gr tzel 稱這個結(jié)果是基礎(chǔ)性的研究，它表明納米管通過變化試驗，能讓“水變油”具備更高的轉(zhuǎn)化效率?？屏_拉多州葛爾登市的國家可再生能源實驗室的電子化學(xué)家約翰。特納也表示，這是很好的工作，很有科學(xué)性。但他指出，處理二氧化碳，或許還有更好的方法?，F(xiàn)在已有人通過工業(yè)生產(chǎn)，把二氧化碳變?yōu)楹铣蓺猓铱梢栽谕粋€生產(chǎn)過程中把合成氣轉(zhuǎn)化為液態(tài)碳?xì)浠衔?，而格蘭姆斯的實驗則需要依靠太陽光提供轉(zhuǎn)換條件，這樣一來，二氧化碳轉(zhuǎn)換為碳?xì)浠衔?，就變成了間斷性生產(chǎn)過程。 <僅供參考> 11、土壤微生物自凈催化原理 土壤自凈是指土壤本身通過吸附、分解、遷移、轉(zhuǎn)化等自然作用，使土壤中污染物的濃度降低直至消失的過程。土壤因土壤中含有各種各樣的微生物和土壤動物，對外界進入土壤的各種物質(zhì)可分解轉(zhuǎn)化。微生物對于土壤的自凈作用必須具備2個方面的條件：一是土壤中存在著多種多樣的微生物，這些微生物能夠適應(yīng)變化了的環(huán)境，具有或產(chǎn)生酶，具備代謝功能，能夠轉(zhuǎn)化或降解土壤中難降解的有機化合物，能夠轉(zhuǎn)化或固定土壤中的重金屬；二是進入土壤的有機化合物大部分具有可生物降解性，即在微生物的作用下由大分子化合物轉(zhuǎn)變?yōu)楹唵涡》肿踊衔锏目赡苄?，進入土壤的重金屬具有微生物轉(zhuǎn)化或固定的可能性。 對有機物的修復(fù)：在好氧條件下，它能將有機污染物徹底氧化，分解成C0z、H20、 S042、P043、NO2、NO3等無機物。在厭氧條件下， 能將有機物降解，轉(zhuǎn)化成小分子有機酸、H20、Hz、 CH 等。 對重金屬的修復(fù)：微生物對重金屬污染土壤生物修復(fù)作用主要通過微生物對重金屬的溶解，轉(zhuǎn)化與固定作用來實現(xiàn)的。微生物對重金屬的溶解主要是通過各種代謝活動直接或間接地進行的。一些微生物可對重金屬進行生物轉(zhuǎn)化，其主要 作用機理是微生物能夠通過氧化、還原、甲基化和 脫甲基化作用轉(zhuǎn)化重金屬，改變其毒性，從而形成某些微牛物對重金屬的解毒機制。微牛物對重金屬的生物固定作用主要表現(xiàn)在胞外絡(luò)合作用、胞外沉淀作用以及胞內(nèi)積累3種作用方式上。 微生物修復(fù)的環(huán)境條件： 1） 營養(yǎng)。 微生物的生長需要維持一定量的C：N：P比例，需要多種營養(yǎng)物質(zhì)及某些微量營養(yǎng)元素。C：N：P最佳比值為100：10：1。在環(huán)境脅迫下，微生物維持生存可能需要更多的能量。如重金屬可引起脫氫酶活性下降，脫氫酶活性與土壤有機碳之比可作為確定向重金屬污染的土壤中添加營養(yǎng)的重要參考指標(biāo)。 2） 電子受體。微生物氧化還原反應(yīng)的最終電子受體包括溶解氧、有機物分解的中問產(chǎn)物和無機酸根。土壤中污染物氧化分解的最終電子受體的種類和濃度極大地影響微生物作用的速度和程度。研究表明，好氧條件有利于大多數(shù)有機物和重金屬污染物的微生物降解和轉(zhuǎn)化。充分的氧氣供給是微生物修復(fù)重要的一環(huán)。 3） 共代謝基質(zhì)。 微生物不能依靠某種有機物生長不一定意味著這種污染物能夠抵抗微生物的攻擊，因此當(dāng)存在其他底物時，這種污染物就會通過共代謝作用而生物降解。所謂共代謝是指某些難降解的有機化合物，通過微生物的作用能被改變化學(xué)結(jié)構(gòu)，但并不能被用作碳源和能源，微生物必須從其他底物獲取大部或全部的碳源 和能源。許多微生物都有共代謝的能力，各種各樣的底物都可能被利用，其降解反應(yīng)可能涉及除氧化作用外的各種反應(yīng)。 其中微生物體系的生化過程在土壤凈化過程中起著重要作用。微生物的整個生化作用伴隨著一系列的催化降解過程。微生物以其酶體系為催化作用的依托，完成整個過程。酶本身就是一種具有特異性，高活性的催化劑。微生物種類繁多，各種生物催化作用不盡相同，但是基本原理如上所述。至于展開到什么程度，大伙根據(jù)自己所熟悉的領(lǐng)域各種所長即可。 12、基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)系是什么？ ⑴基因組用于描述生物的全部基因和染色體組成的概念，1986年美國科學(xué)家Thomas Roderick首先提出了基因組學(xué)的概念（genomics），指對所有基因進行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析，因此，基因組學(xué)研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測序為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics）和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)（functional genomics），后者又被稱為后基因組（postgenome）研究。 ⑵蛋白質(zhì)組（proteome）指一個細(xì)胞或組織所表達的全部蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)組學(xué)是對不同時間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體研究的學(xué)科，不僅包括蛋白質(zhì)的定性和定量，還包括它們的定位、修飾、活性、功能、相互作用，它從蛋白質(zhì)水平上探索蛋白質(zhì)表達模式及功能模式，從而為藥物開發(fā)、新陳代謝途徑調(diào)節(jié)控制等提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。目前對蛋白質(zhì)組的研究總體可以分為兩個方面，即對蛋白質(zhì)表達模式（或蛋白質(zhì)組成）和蛋白質(zhì)功能模式（目前集中在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系）的研究。 ⑶蛋白質(zhì)組學(xué)是從基因組學(xué)中慢慢發(fā)展而來的，但是兩者有著很大的區(qū)別。不僅在于①蛋白質(zhì)組種類、數(shù)量上更加龐大和復(fù)雜；還在于②已經(jīng)制造出的蛋白質(zhì)具有其相對獨立的代謝過程；③對于內(nèi)外部條件和刺激的能動反應(yīng)性；④復(fù)雜的相互作用，“沒有一種蛋白質(zhì)是能夠獨立完成其生物功能的”，并組成復(fù)雜而精密的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)(network)。 答案2 基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)是現(xiàn)代分子生物學(xué)深入研究和發(fā)展的兩個重要的研究領(lǐng)域，從本質(zhì)的研究對象來看說，顧名思義分別為基因組DNA和蛋白質(zhì)，一方面，蛋白質(zhì)是基因選擇性表達并發(fā)揮相應(yīng)功能的產(chǎn)物，即基因決定蛋白表達，另一方面，蛋白的表達又具有階段性，同時受到環(huán)境因素的干擾，和生物機體的基因又不是絕對的對等關(guān)系，要遠(yuǎn)比基因組復(fù)雜多變。因此兩者之間即存在聯(lián)系又有區(qū)別。 對基因組學(xué)的研究主要經(jīng)歷了兩個階段，前期的研究主要集中于基因作圖、核苷酸序列分析，確定基因組成和基因定位，被稱為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)，后期研究的核心包括基因組的多樣性與進化規(guī)律，基因組的表達及其調(diào)控，模式生物體基因的研究，它是結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的延伸與拓展，被稱作功能基因組學(xué)，又稱作后基因組學(xué)階段。但生物功能的主要體現(xiàn)者是蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)有其自身特有的活動規(guī)律，僅僅從基因的角度來研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此，后基因組學(xué)時代的到來，使得蛋白質(zhì)組學(xué)的研究興起。 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對象是基因組表達的全部蛋白質(zhì)及其存在方式，它的研究包括蛋白質(zhì)的表達模式、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)胞內(nèi)分布及移位、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用等方面，其中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作中的重要部分，蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生和發(fā)展得益于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的發(fā)展。 蛋白質(zhì)是體現(xiàn)生物功能的分子,蛋白質(zhì)分子由基因所編碼,故蛋白質(zhì)組學(xué)研究是基因組學(xué)(特別是功能基因組學(xué))研究的深入和延伸。蛋白質(zhì)組學(xué)是隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展而產(chǎn)生的，它是功能基因組學(xué)深入研究的一個分支的組學(xué)研究，同時，它又是分子研究終點，是生物性狀的最直接反應(yīng)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的數(shù)據(jù)與基因組學(xué)數(shù)據(jù)的整合，將會在基因組學(xué)功能研究上發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體的蛋白質(zhì)水平上，在一個更深層上來探討和發(fā)現(xiàn)生命活動的根本規(guī)律及研究人類發(fā)病機制等，它是后基因組時代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容。 兩者的根本區(qū)別在于，一個機體只有一個基因組，但它們表達的產(chǎn)物蛋白質(zhì)組卻是不斷變化的，在不同的組織細(xì)胞，不同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)和不同的外界環(huán)境中都是不一樣的。蛋白質(zhì)組內(nèi)蛋白質(zhì)數(shù)目要大大多于基因組內(nèi)的基因數(shù)目，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究要遠(yuǎn)比基因組學(xué)復(fù)雜。 13、比較紫外線可見光譜與紅外光譜的異同？（從產(chǎn)生的途徑及過程，譜圖形狀） 相同點：（1）.都屬于分子光譜（2）.都是由于分子中的能級躍遷產(chǎn)生的。（3）.利用這兩種光譜都能進行定性，定量和結(jié)構(gòu)分析。 不同點：（1）產(chǎn)生機理不同：紫外也稱電子光譜。是由于分子中價電子躍遷所產(chǎn)生的，且能級差大△E→大，ν→大;而紅外光譜稱為振轉(zhuǎn)光譜是振動和轉(zhuǎn)動能級躍遷，能級差小，△E→小 V→小。（2）從研究對象和使用范圍上，紫外光譜只能分析不飽和有機化學(xué)物。特別是有共軛體系的化合物及少數(shù)無機物。紅外適用于分析那些分子振動偶極矩變化不為0的所有化合物（包括有機和無機。） 14、有機化合物在電子轟擊離子源中有可能產(chǎn)生哪些類型的離子？ 答案見19題 15、列舉與你研究密切相關(guān)的生物標(biāo)記物，描述具體作用原理及基本的研究流程。 生物標(biāo)志物是指示生物機體受到外界干擾而導(dǎo)致機體異常的標(biāo)志性物質(zhì)，它可以是一個分子（例如DNA、RNA、控制機體新陳代謝的一些關(guān)鍵酶蛋白等），也可以是細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、細(xì)胞核和細(xì)胞膜等，還可以是機體的組織、個體、種群、群落和生態(tài)系統(tǒng)。例如，作為環(huán)境污染物質(zhì)的有機磷農(nóng)藥可以對生物體神經(jīng)細(xì)胞中的乙酰膽堿酯酶的產(chǎn)生和表達造成影響，那么乙酰膽堿酯酶就可以作為檢測有機磷農(nóng)藥神經(jīng)毒性的生物標(biāo)志物。通常一些環(huán)境中的污染物質(zhì)會對生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生有害影響，這其中的影響機制可能是通過對機體產(chǎn)生氧化損傷而導(dǎo)致細(xì)胞毒性的發(fā)生，那么在檢測外來物質(zhì)的細(xì)胞毒性時可以將氧化應(yīng)激發(fā)生中一些細(xì)胞內(nèi)分子的變化作為評價污染物質(zhì)細(xì)胞毒性的研究指標(biāo)，例如丙二醛、抗氧化酶系統(tǒng)和谷胱甘肽含量等，下面將詳細(xì)介紹其原理和研究思路。 我們的研究團隊的目標(biāo)物質(zhì)主要是擬除蟲菊酯等農(nóng)藥，研究模型主要包括大鼠、斑馬魚、大型蚤和一些人類和動物的細(xì)胞系等，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有很強的水生毒性，也有研究表明其還會產(chǎn)生細(xì)胞毒性、免疫毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，下面我就分別從這幾個方面簡單介紹幾個常用的生物標(biāo)志物。 1、關(guān)于魚類等內(nèi)分泌干擾的生物標(biāo)志物： 當(dāng)生物體（魚類，斑馬魚等）暴露于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、DDT等具有雌激素效應(yīng)的物質(zhì)時，生物體的生長、發(fā)育、生殖以及內(nèi)分泌系統(tǒng)就會受到這些外來物質(zhì)的干擾，從生物體的表現(xiàn)型看，可能會導(dǎo)致身體彎曲、脊椎畸形、雄性器官退化等，生物體的形態(tài)是通過蛋白表現(xiàn)出來的，蛋白又是受基因表達控制的。卵黃蛋白原是卵黃蛋白的前體，在一些卵生脊椎動物（例如魚類等）中，只有發(fā)育成熟的雌性體內(nèi)才有控制這種蛋白的基因表達，最終轉(zhuǎn)化成卵黃蛋白，在胚胎、雌雄幼體和雄性體內(nèi)這種基因處于休眠狀態(tài)，并不表達。所以通常將卵黃蛋白原做為篩選環(huán)境中的雌激素和類雌激素物質(zhì)的生物標(biāo)志物，即如果在雄性體內(nèi)或者幼體內(nèi)卵黃蛋白原基因大量表達，就說明該物質(zhì)具有雌激素或類雌激素效應(yīng)，可以干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常運行，從而影響生物體的生殖和發(fā)育。通常檢測機體卵黃蛋白的表達可以分別從基因和蛋白水平檢測，在蛋白水平上的檢測可以利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)，即直接檢測血漿、肝組織和整個機體勻漿中的卵黃蛋白原水平，這種方法通常利用已經(jīng)商業(yè)化的試劑盒，依照說明書上的方法步驟進行，蛋白水平上的檢測方法還有免疫雜交法、放射性免疫法和間接指示法等；另一種是基因水平上的檢測，即先提取出機體勻漿細(xì)胞中的RNA，然后通過設(shè)計出卵黃蛋白原基因的上游和下游引物利用反轉(zhuǎn)錄PCR和實時定量PCR檢測機體內(nèi)卵黃蛋白原基因的表達，在PCR過程中也需要嚴(yán)格按照商業(yè)化試劑盒的操作步驟進行。我們組的張穎等的研究表明聯(lián)苯菊酯會對斑馬魚的胚胎-幼體的發(fā)育產(chǎn)生毒性，一方面探討了聯(lián)苯菊酯的急性毒性、對斑馬魚胚胎孵化率和亞致死畸變、游動行為的影響外，還通過檢測斑馬魚體內(nèi)卵黃蛋白原基因的表達研究了它的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，暴露于一定劑量的聯(lián)苯菊酯，胚胎-幼體斑馬魚體內(nèi)的卵黃蛋白原基因表達增加，從而證實了聯(lián)苯菊酯對斑馬魚胚胎-幼體的發(fā)育毒性。 2、與氧化損傷相關(guān)的生物標(biāo)志物： 我們組的胡芬等研究了氯菊酯對大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞PC12氧化損傷的對映體選擇性，其中也涉及了很多關(guān)于對氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性研究過程中的一些生物標(biāo)志物。在正常情況下，生物機體內(nèi)的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，當(dāng)氧化自由基（例如羥基自由基、過氧羥基自由基等）的產(chǎn)生增多而抗氧化物質(zhì)減少時，就會產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶類變性從而喪失催化功能，同時還會導(dǎo)致核酸和染色體等的損傷。具體來說，機體細(xì)胞中的氧化物質(zhì)（統(tǒng)稱為活性氧簇ROS）包括超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等，抗氧化物質(zhì)包括一些酶類和還原性物質(zhì)，例如，超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽過氧化物酶、維生素C、維生素E和谷胱甘肽GSH等。通常也正是把這些氧化物質(zhì)和康氧化物質(zhì)作為評價氧化損傷的生物標(biāo)志物，常用的有ROS、SOD、CAT等，另外還可以將氧化自由基損傷細(xì)胞后的一些產(chǎn)物作為氧化應(yīng)激檢測的生物標(biāo)志物，例如丙二醛MDA等。MDA是氧化自由基氧化細(xì)胞膜脂質(zhì)后的產(chǎn)物，它的含量的測定可以反映出細(xì)胞膜受損程度，同時它的生成還會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等分子發(fā)生交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。具體的研究方法首先是將細(xì)胞暴露于氯菊酯不同的對映體和外消旋體一定的時間，然后離心收集上清液，測各個指標(biāo)的含量，這些指標(biāo)檢測方法一般是利用已經(jīng)商業(yè)化的試劑盒，嚴(yán)格按照上面的操作步驟進行。這篇文章主要是從對映體水平來檢測氯菊酯的氧化損傷功能和細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示1R-trans-PM毒性最大。該實驗除了研究氯菊酯的氧化損傷外還做了細(xì)胞活性的檢測，在這其中也用到了一個細(xì)胞活性檢測的生物標(biāo)志物乳酸脫氫酶LDH的釋放。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時，細(xì)胞內(nèi)的LDH就會大量釋放到血清中，通過對血清中LDH的測定就會間接反映出細(xì)胞活性大小。具體的檢測方法也是根據(jù)商業(yè)化的試劑盒的步驟嚴(yán)格進行。 3、與免疫毒性相關(guān)的生物標(biāo)志物： 免疫系統(tǒng)是生物體的三大系統(tǒng)之一，與神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)有著較為密切復(fù)雜的聯(lián)系，免疫系統(tǒng)不僅包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等組成的免疫組織，還包括這些組織細(xì)胞合成釋放的一些細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子TNF a和白細(xì)胞介素ILs等，這些免疫細(xì)胞核因子在維持生物體的健康穩(wěn)定過程中起著重要的作用。目前也已經(jīng)有很多的研究表明擬除蟲菊酯類農(nóng)藥會引起生物體免疫系統(tǒng)的免疫抑制等毒性作用，一方面可能造成免疫細(xì)胞大量凋亡，另一方面會引起這些免疫調(diào)節(jié)因子合成和釋放的變化。那么在檢測環(huán)境干擾物質(zhì)對免疫細(xì)胞（例如，單核巨噬細(xì)胞等白細(xì)胞）的免疫毒性研究中，除了可以把污染物質(zhì)引起的細(xì)胞毒性（例如，細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的檢測）做為研究終點，還可以把調(diào)節(jié)機體免疫功能的細(xì)胞因子作為檢測判斷環(huán)境干擾物質(zhì)免疫毒性的生物標(biāo)志物。 我們組的張穎等人就做過關(guān)于五種不同類型的擬除蟲菊酯及其三種常見的代謝產(chǎn)物（醇、醛、酮三類代謝產(chǎn)物）對單核巨噬細(xì)胞U937的免疫抑制研究。在該研究中，我們選取的研究模型是單核細(xì)胞U937，它是最大的白細(xì)胞，在人體免疫中起著關(guān)鍵作用，該細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中可以產(chǎn)生腫瘤壞死因子TNF a、白細(xì)胞介素6、10和12等，所以我們就對暴露于一定劑量擬除蟲菊酯代謝產(chǎn)物一定時間后細(xì)胞系產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)因子TNF a、IL6、IL10和IL12p70做了定量研究。TNF a是一種促炎癥反應(yīng)物質(zhì)，它可以保護細(xì)胞免受外來物質(zhì)的干擾從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，它在細(xì)胞凋亡通路中起著重要作用。IL6可以刺激活化B細(xì)胞增殖產(chǎn)生抗體，對免疫反應(yīng)有正調(diào)節(jié)作用，IL10卻是抑制前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對免疫反應(yīng)起著負(fù)調(diào)節(jié)作用，IL12p70也可以增強細(xì)胞的殺傷活性，對免疫有著正調(diào)節(jié)作用。在該實驗中，暴露于擬除蟲菊酯代謝物的U937細(xì)胞培養(yǎng)一段時間后收集上清液，然后利用酶聯(lián)免疫吸附法依據(jù)商業(yè)化的試劑盒操作步驟進行檢測。結(jié)果表明，母本和代謝產(chǎn)物都分別在不同程度上對單核細(xì)胞產(chǎn)生了免疫抑制作用和細(xì)胞毒性作用，而且代謝產(chǎn)物引起的免疫毒性要明顯高于母本化合物，在代謝產(chǎn)物中，免疫毒性和細(xì)胞毒性最強的是醇類衍生物和酸類代謝衍生物。 16、確定自己感興趣的微生物生態(tài)位，設(shè)計實驗方案，從空間或者時間上進行菌群結(jié)構(gòu)多樣性對比，并分析菌群差異，部分精確到屬和種。 感興趣的微生物生態(tài)位：真菌群落 實驗方案： 1樣品DNA的提取 對于土壤樣品DNA的提取，通常會采用改良后的Bead-Beating法。具體方法是：稱取10 g土樣，放入盛有數(shù)粒無菌玻璃珠（直徑3～5 mm）的三角瓶中，加15 mL提取緩沖液；在180 r/min，37℃條件下振蕩30 min后，加2 mL 20%SDS繼續(xù)振蕩10 min；65℃水浴1 h后，6 000g離心15 min；收集上清液，加0.5倍體積PEG(30%)-NaCl(1.6 mol/L)，混勻后室溫下靜止2 h，在10 000g離心20 min，沉淀用2 mL TE重新懸?。患? mol/L NaAC至終濃度0.3 mol/L，用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，0.6倍體積異丙醇沉淀2 h，12 000g離心20 min，沉淀干燥后，200μL TE溶解，經(jīng)純化后，-20℃保存。 對于液體樣品，需要首先進行離心，將收集的沉淀物重新溶解后，即可進行DNA提取操作。對于DNA提取前的預(yù)處理，可選用常規(guī)方法，如機械研磨法、酶解制備原生質(zhì)體法、氯化芐法等，需根據(jù)不同樣品的具體特征進行選擇。DNA提取完畢后，可以通過電泳進行檢查，或者利用紫外可見分光光度計檢查DNA的純度。如純度不夠，可以利用純化試劑盒做進一步的純化。 2 PCR擴增 在PCR擴增中，引物的選擇、擴增程序和PCR產(chǎn)物的質(zhì)量都可能造成群落結(jié)構(gòu)的分析偏差，因此需要慎重對待。 引物的選擇, 對于特定微生物種群或類群的DNA擴增，需要根據(jù)其分類等級的DNA特征，設(shè)計相應(yīng)的具有特定堿基序列的引物。對于真菌，目前常采用18S rDNA和IST序列的部分片段進行DNA擴增。 擴增程序一般包括預(yù)變性、變性、退火和延伸幾個主要過程。為了提高擴增產(chǎn)物質(zhì)量，需要根據(jù)擬擴增DNA片段的長度，確定適宜的反應(yīng)體系、反應(yīng)時間、反應(yīng)循環(huán)數(shù)和反應(yīng)溫度等。其中，退火溫度的確定在各影響因素中最為關(guān)鍵，可通過溫度梯度PCR試驗進行確定. 對于PCR產(chǎn)物的檢查，采用瓊脂糖凝膠電泳進行。需要注意，常用染料溴化乙啶（EB）為致癌物質(zhì)，可以用Goldview染色替代。Goldview有與EB相同的靈敏性，且安全無毒。 3 DGGE DGGE藥品的準(zhǔn)備：目前，真菌DGGE技術(shù)多采用雙梯度法（即聚丙稀酰胺和變性劑為2個梯度）以減緩條帶的進一步遷移，提高分離效果。聚丙烯酰胺濃度范圍一般為6～12 g/100 mL；而變性劑尿素和去離子甲酰胺的梯度一般選取40%～55%這個區(qū)間（可根據(jù)不同的需要進行調(diào)整）。另外，制備凝膠還需要過硫酸銨以及TEMED。 DGGE凝膠的制備：凝膠制備步驟繁瑣，一般包括以下步驟：擦凈玻璃板，組裝梯度生成裝置，進膠，插上梳子，試漏檢驗，凝膠，清洗用具。其中每一步操作都可能對電泳質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響，因此整個過程均需精心操作。 電泳：在膠凝固好之后，即可進行電泳操作。首先將電泳槽中的液體預(yù)熱到設(shè)定溫度，將玻璃板與凝膠板架固定好同時檢查并確認(rèn)無漏水現(xiàn)象，將凝膠板架、溫度控制系統(tǒng)以及電泳槽組裝好，接通電源，當(dāng)溫度再次加熱到所需溫度時，關(guān)掉所有電源，拔掉梳子進樣；然后再將溫度控制裝置再次組裝好，接通溫控器電源，溫度調(diào)致所需，打開heat鍵，運行5 min后，打開電泳儀電源以及bump鍵，調(diào)節(jié)電壓到所需，調(diào)節(jié)時間。 染色及成像：電泳完畢后，剝膠染色。銀染法和采用SYBR GreenⅠ等新型染料的染色法，均可獲得較為理想的染色效果，但SYBR GreenⅠ等新型染料價格昂貴，因此前者更為常用。將凝膠染色后，采用凝膠成像儀掃描，即可獲得用于微生物群落分析的DGGE圖譜。 分析菌群差異： 利用PCR-DGGE技術(shù)，可以對來源于環(huán)境中的微生物進行功能基因甚至是基因組學(xué)的研究，并可以同時分析多個樣品，因此該技術(shù)成為目前監(jiān)測微生物群落動態(tài)的一種強有力的工具。通過該項技術(shù)可以獲得比較全面的不同環(huán)境中的真菌及各類微生物的相關(guān)信息。 條帶分析及回收：DGGE圖譜可以采用Quantity one（Bio-rad）軟件進行分析，從中可以獲得優(yōu)勢菌群及群落結(jié)構(gòu)的基本信息。對于凝膠上的特異性DNA條帶，可以進行切割回收，PCR擴增后測序。通過Blast軟件，將獲得的序列與GenBank進行比對，并下載最相近的序列，以phylip軟件按最小相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，通過RDP數(shù)據(jù)庫，可尋找到最相近的種屬。 17、 以單聚焦質(zhì)譜儀為例,說明組成儀器各個主要部分的作用及原理。雙聚焦質(zhì)譜儀為什么能提高儀器的分辨率? （1）僅用一個扇形磁場進行質(zhì)量分析