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食品安全地方標準 《 植物源性食品中 α液相色譜 質(zhì)譜法 》 編 制 說 明 （ 送審稿 ） 吉林省 農(nóng)業(yè)科學院 二〇 一 二 年 十 一 月 目 錄 一、 研究背景 ………………………………………………………… ………… 2 二、 任務來源 … ……………………………………………………… ………… 2 三、 制定 本 標準的必要性和意義 ……………………………………… ………… 2 四、 標準制定 的 主要 過程 ………………………………………… …………… 3 五、 制定標準 的原則和依據(jù) ………………………………………… ………… 4 六、 標準主要條款的說明 …………………………………………… ………… 4 1、標準的名稱 … ……………………………………………………… ………… 4 2、標準的范圍 … ……………………………………………………… ………… 4 3、方法原理 … ……………………………………………………… …………… 5 4、前處理條件 … ……………………………………………………… …………… 5 5、儀器分析條件 … …………………………………………………… …………… 6 6、檢出限 … …………… ………………………………………… …………… 9 7、線性范圍 … …………………………………………………… ……………1 0 8、準確度、精密度 … …………………………………………… …………… 11 七、 標準驗證情況說明 … …………………………………………… ……………1 3 八 、 驗證結論 ………………………………………………………… ……………1 3 九、本標準作為強制性地方標準的建議 ………………………………… ………1 3 十、貫徹標準要求和措施建議 … ………………………………… ………………1 4 十一、參考文獻 ………………… ………………………………… ……………1 4 1 一、 研究背景 玉米赤霉烯酮類毒素及其代謝產(chǎn)物具有雌激素類物質(zhì)的生物活性，食品中的該物質(zhì)通過食用逐漸在人體內(nèi)蓄積，造成人體性激素機能紊亂及影響第二性征的正常發(fā)育，在外部條件誘導下，可能致癌。尤其是對女嬰的危害更為嚴重，易造成性早熟。隨著研究的深入，人們已經(jīng)認識到只進行玉米赤霉烯酮是不夠的，同時對食品中 α能正確評價其污染程度及潛在風險。目前國內(nèi)各科研機構正積極開展農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)、檢測、監(jiān)督管理和風險評估的研究，其中食品中 玉米赤霉烯酮及其次生代謝物的測定是重要的研究內(nèi)容之一。 二、 任務來源 任務來源：吉林省衛(wèi)生廳 任務編號： 32 - 2012 歸口單位：吉林省 農(nóng)業(yè)委員會 起草單位：吉林省 農(nóng)業(yè)科學院 三、 制定 本 標準的必要性和意義 玉米赤霉烯酮的檢測技術相對已經(jīng)成熟，其中高效液相色譜法使用最為廣泛，目前國家標準使用的全部為高效液相色譜法，但是該方法有 一個弊端，就是定性能力較差，檢測中往往造成假陽性，且靈敏度不高。而液相色譜 質(zhì)譜法則可很好的解決這兩個問題。同時玉米赤霉醇是玉米赤霉烯酮的主要代謝產(chǎn)物，同樣具有類雌激素作 用，若玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯醇，兩個指標中，有一項明顯偏高，則致病的幾率則大大增加。目前對玉米赤霉醇檢測標準僅有用于動物源性食品檢測的，而植源性食品中沒有檢測方法。在此情況下，我們提出《植物源性食品中 α液相色譜 質(zhì)譜法》地方標準的制訂，是非常具有前瞻性及先進性的，可以彌補監(jiān)管機構和質(zhì)檢機構對植物源性食品中玉米赤霉醇檢測無標準可依的現(xiàn)狀，使檢測方法統(tǒng)一化、規(guī)范化、標準化。 四、 標準制定的主要過程 1、 前期工作 （一）調(diào)查研究階段： 2012 年 1 月～ 2012 年 6 月 該標準立 項后，標準起草小組立即著手進行有關 α業(yè)標準、國際標準和國外先進標準查新工作，同時咨詢了國內(nèi)相關專家的意見和建議。在大量收集、整理和分析國內(nèi)外在該研究領域的有關技術資料，并按制定標準的要求進行分類整理的基礎上，明確了標準制定的技術路線。 （二）起草階段： 2012 年 7 月～ 2012 年 11 月 標準起草小組按照計劃任務書的要求，結合專家咨詢意見建議以及其它制定標準的要求，研究建立標準方法的實驗方案，并進行條件試驗。 起草人員認真查閱了標準制定的有關文件，通 過參加標準宣貫培訓， 對標準的格式、內(nèi)容、術語表達方式等進行了深入學習，嚴格遵循 準化工作導則 第 1 部分：標準的結構和編寫》和 準編寫規(guī)則 第 4 部分 :化學分析方法》給出的規(guī)則起草了《植物源性食品中 α液相色譜 質(zhì)譜法》。起草小組成員對標準的草案進行了多次修改，形成了征求意見稿。 向吉林省食品藥品檢驗所等 10 個檢測機構發(fā)出了征求意見稿，有 6 個機構提出了修改意見， 征求專家意見匯總處理表 見附件 1。 （三） 實驗室間的 驗證工作 ： 2012 年 11 月 2012 年 11 月， 我們選定了 吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院等 省內(nèi)三家權威的檢測機構進行了 實驗室間的 比對 驗證工作。通過統(tǒng)計分析各個實驗室的檢測數(shù)據(jù)，驗證了方法的準確度和精密度、檢出限等。參加驗證的實驗室一致認為：該方法適用于測定 植物源性食品中 α含量，具有測定結果準確可靠、操作簡單、快速等特點。 驗證 報告 見附件 2。 五、 制定標準的原則和依據(jù) 本標準編制遵循 “先進性、實用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性 ”的原則，盡可能與國際通行標準接軌，注重標準的可操作性，嚴格按照 準化工作導則 第 1 部分：標準的結構和編寫規(guī)則》和 準編寫規(guī)則 第 4 部分：化學分析方法》的要求進行編寫。 六、 標準主要條款的說明 1、 標準的名稱 植物源性食品中 α液相色譜 質(zhì)譜法 2、 標準的范圍 本標準規(guī)定了植物源性食品中 α質(zhì)譜 /質(zhì)譜測定方法。適用于成品糧及其加工制品（面粉、淀粉等）、 食用植物油脂及其加工制品 等中 α 3、 方法原理 試料 中 α霉烯酮經(jīng)三氯甲烷提取，采用堿性水溶液 萃取并調(diào)至中性后，再經(jīng) 二氯甲烷萃取后，使用液相色譜 質(zhì)譜儀測定，外標法定量 。 4、 前處理條件 取 稱取試料 10 g（精確至 g）于 100 塞錐形瓶中。 固體樣品 加入50 氯甲烷（ 植物油脂樣品加入 35 氯甲烷（ ， 蓋緊塞子，于振蕩提取器上（ 振蕩提取 30 化 使用中速濾紙過濾提取液（ 并用三氯甲烷定容至 50 1)。 吸取25.0 取液 ( 125 液漏斗（ ，加入 5 和氯化鈉溶液（ 混勻，再 加 入 25 %氫氧化鈉（ 液，劇烈振蕩 1 置分層，棄去三氯甲烷層。 再用 25 氯甲烷 重復 萃取一次，棄去三氯甲烷層。加入 25 檬酸溶液（ ， 混勻。 再 加入 25 氯甲烷（ 劇烈振蕩 1 置分層。 將 二氯甲烷層溶液通過裝有 5 g 無水硫酸鈉（ 漏斗。 再用 25 氯甲烷重復萃取一次，操作同上。 另用 5 氯甲烷沖洗無水硫酸鈉，合并二氯甲烷萃取液 至 濃縮瓶中， 40 ℃ 以下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干 。殘 留 物用 5 氯甲烷溶解并轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中，于40 ℃ 以下用微弱氮氣吹干，殘留物用 1.0 腈 解， 于漩渦混合器上（ 漩渦混勻后，過 膜 （ ，供儀器測定 。 處理條件的確定 取溶劑的選擇 比較了三氯甲烷、乙腈、無水乙醚三種提取溶劑的提取效果 。其中三氯甲烷和乙醚提取效率較高，考慮到乙醚揮發(fā)性高，操作過程中不易控制，因此我們選擇了三氯甲烷作為提取溶劑。 取時間的選擇 比較了 10203060果發(fā)現(xiàn)隨著提取時間的增加，提取效率不斷提高， 30后不再增加，因此確定 30 α此選擇氫氧化鈉作為第一次萃取的溶液，以除去脂類和色素等脂溶性的雜質(zhì)。對 1%、 2%和 3%四種濃度的氫氧化鈉的萃取效率進行了比較，發(fā)現(xiàn)氫氧化鈉的濃度為 2%時較為合適。 5 儀器參考條件 譜參考條件 a） 色譜柱： 譜柱， 100 .1 徑 m； b） 柱溫： 40 ℃ ； c） 流動相、流速及洗脫梯度：流速 0.3 mL/脫梯度見表 1； d） 進樣量： 30 μL。 表 1 流動相、流速及洗脫梯度 時間 /速 /（ mL/ A 相：水 /% B 相：乙腈 /% 0 50 5 75 100 100 00 0 00 0 譜參考條件的確定 比較了甲醇和水、乙腈和水作為流動相的洗脫效果，發(fā) 現(xiàn)兩者相當。但是甲醇和水用作流動相時系統(tǒng)壓力較高，因此選擇了乙腈和水系統(tǒng)作為流動相。 對于 α用 50%乙腈等度系統(tǒng)和梯度洗脫時分離效果相當，等度洗脫時分析時間較長，同時梯度洗脫可有效除去極性較弱的雜質(zhì)，因此選擇了梯度洗脫的方式。 比較了 501005018色譜柱，發(fā)現(xiàn)100分析較短， 4此選擇了 100 .1 粒徑 m）的 a）電離方式：電噴霧電離； b）掃描方式：負離子掃描； c）檢測方式：多反應監(jiān)測（ d）離子源溫度： 350 ℃ ； e）干燥氣流量： 10 L/ f）監(jiān)測離子、去簇電壓及碰撞能量：見表 2。 表 2 α簇電壓及碰撞能量 化合物名稱 監(jiān)測離子 去簇電壓 碰撞能量 α319/275a； 319/160 15； 米赤霉烯酮 317/175a； 317/131 25； 譜參考條件的確定 對掃描方式、離子源溫度和干燥氣溫度等進行了優(yōu)化，確定出最佳的質(zhì)譜條件。對 α撞能量等進行了優(yōu)化，同時參考相關標準和文獻篩選出最佳的定性和定量離子對。 準溶液、 玉米 空白樣品、 玉米加標 樣品 多反應監(jiān)測（ 譜圖 按照確定的前處理方法和儀器參考條件對 標準溶液、 玉米空白樣品、玉米 、大豆、淀粉、花生、小麥面粉、大米、芝麻油、玉米油及大豆油等樣品的空白 加標 進行 測定，多反應監(jiān)測（ 譜圖見圖 1～圖 11。 圖 1 0.5 ng/準溶液 譜圖 圖 2 空白玉米樣品 譜圖 圖 3 空白玉米 樣品 加標 譜圖 圖 4 空白 大豆 樣品 加標 譜圖 圖 5 空白 淀粉樣品 加標 譜圖 圖 6 空白 花生樣品 加標 譜圖 圖 7 空白 小麥面粉樣品 加標 譜圖 圖 8 空白 大米樣品 加標 譜圖 圖 9 空白 芝麻油樣品 加標 圖 10 空白 玉米油樣品 加標 圖 11 空白 大豆油樣品 加標 6、 檢出限 和定量限 以信噪比為 3時計算方法的檢出限 。 以樣品取樣量為 10 g，確定 αmg/mg/信噪比為 10時計算方法的定量限限 。 以樣品取樣量為 10 g，確定 αmg/mg/、 線性范圍 配制了 ng/ng/ng/ng/10.0 ng/0.0 ng/50.0 ng/100 ng/不同濃度系列 α準溶液上機測定 ， 結果發(fā)現(xiàn) ng/20.0 ng/性曲線見圖 6 和圖 7。 圖 6 α 圖 7 玉米赤霉烯酮線性曲線圖 8、 回收率、 準確度 和 精密度 在 玉米、大豆、水稻、花生、 玉米 淀粉、面粉、大豆油、玉米色拉油、芝麻油等 空白 樣品 中 加入 α玉米赤霉烯酮 標準物質(zhì) ， 進行 回收率 與精密度實驗 。 實驗 室內(nèi)回收率及 重復性 測定 結果見表 3，實驗室間回收率及 再現(xiàn)性 測定結果見表 4。 表 3 不同基質(zhì)空白樣品中 α n=6） 樣品名稱 被測組分 添加濃度 /(μg/回收率范圍 /% 相對標準偏差 /% 玉米 α米赤霉烯酮 豆 α米赤霉烯酮 稻 α米赤霉烯酮 生 α米赤霉烯酮 米淀粉 α米赤霉烯酮 粉 α米赤霉烯酮 豆油 α米赤霉烯酮 米色拉油 α米赤霉烯酮 麻油 α米赤霉烯酮 3 不同基質(zhì)空白樣品中 α和玉米赤霉烯酮添加回收率及精密度（ n=6） 樣品 項目 添加水平 /(μg/平均測定回收率 /% 平均值 /% 吉林省 質(zhì)檢院 吉林商檢 長春市 質(zhì)檢院 本所 玉米 α赤霉烯醇 12 60 玉米赤霉烯酮 60 大豆 α赤霉烯醇 12 60 玉米赤霉烯酮 60 大米 α赤霉烯醇 12 60 玉米赤霉烯酮 60 玉米油 α赤霉烯醇 12 60 玉米赤霉烯酮 60 七、 方法驗證 本方法經(jīng) 吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院、吉 林出入境檢驗檢疫局技術中心、長春市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院等 三個實驗室的技術人員進行了方法驗證試驗 。 八、 驗證結論 經(jīng)驗證該檢測方法在精密度、準確度、檢出限等方面完全達到了測定 植物源性食品中 α測要求，其方法方便、快捷，應推廣應用。 九、本標準作為強制性地方標準的建議 通過以上一系列的實驗研究，建立了 植物源性食品中 α測方法。該方法準確可靠。 建議把 《植物源性食品中α液相色譜 質(zhì)譜法》 作為強制性地方標準批準發(fā)布。 十、 貫徹標 準要求和措施建議 1、技術措施 要求熟練掌握前處理技術，了解儀器性能、原理，且能熟練操作，能對檢測結果進行分析。 2、管理措施 本技術標準在實施過程，嚴格執(zhí)行檢驗規(guī)范，熟悉檢驗方法和有關的法規(guī)，做到科學、公正、準確、不受其他因素干擾，確保檢驗結果的準確可靠。 3、實施方案 標準由吉林省衛(wèi)生廳發(fā)布，計劃于 發(fā)布實施，由 政主管部門負責監(jiān)督實施。 標準被批準后，組織力量，進行宣貫實施，通過該標準的貫徹實施，確保食品安全和保障人體健康等方面將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會 效益。 十一、 參考文獻 [1] 物中玉米赤霉烯酮的測定 . 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