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(一)、蛋白質(zhì)的相對分子量(二)、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)(三)、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)(四)、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)(五)、蛋白質(zhì)的變性(六)、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),七、蛋白質(zhì)的性質(zhì),（一）蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量(Mr),蛋白質(zhì)相對分子量在10000~1000000之間。測定方法：化學(xué)成分、滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。,最準(zhǔn)確可靠的方法是超離心法：蛋白質(zhì)顆粒在25~50萬倍重力場的離心力作用下從溶液中沉降下來。,沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient,S）：單位（cm）離心場里的沉降速度。沉降系數(shù)的單位常用S，1S單位=110-13（S）,根據(jù)化學(xué)成分測定最小相對分子質(zhì)量測定蛋白質(zhì)分子中某一特殊成分的百分含量根據(jù)其百分含量可計(jì)算出最低相對分子質(zhì)量（假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一個(gè)）。如所含已知成分不是一個(gè)單位，則真實(shí)相對分子質(zhì)量等于最小相對分子質(zhì)量的倍數(shù)。最小相對分子質(zhì)量＝（已知成分的相對分子、原子質(zhì)量）/已知成分的百分含量,,,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時(shí)溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）。,（二）蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn),蛋白質(zhì)電泳的方向、速度取決于其所帶電荷的正負(fù)性、電荷數(shù)以及分子顆粒大小。,自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳。等電聚焦電泳：利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。,（三）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),布郎運(yùn)動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象、不能透過半透膜，具有吸附能力,蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的因素：1）表面形成水膜（水化層）2）帶相同電荷,透析法：利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（dialysis）。,應(yīng)用,,（四）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng),1.加高濃度鹽類：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出----鹽析（saltingout）。,分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。,2.加有機(jī)溶劑：與水分子的競爭性結(jié)合作用。,3.加重金屬鹽：硝酸銀、醋酸鉛、三氯化鐵等。,4.加生物堿試劑,單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。,（五）蛋白質(zhì)的變性(denaturation),定義：天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，其分子內(nèi)部原有的高度規(guī)律性結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)都有所改變，但并不導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的破壞，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性作用。,特征：1.生物功能喪失2.理化性質(zhì)改變：溶解度降低；結(jié)晶能力喪失；3.生化性質(zhì)改變：肽鏈松散，反應(yīng)基團(tuán)增加，易被酶消化。變性因素：高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、各種射線、某些化學(xué)試劑。,復(fù)性(renaturation)定義：當(dāng)變性因素除去之后，已變性的蛋白質(zhì)又可重新回復(fù)到天然構(gòu)象，這一現(xiàn)象叫復(fù)性。變性的應(yīng)用①利用變性：酒精消毒高壓滅菌血清化驗(yàn)重金屬鹽中毒②防止變性：低溫保存生物制品,核糖核酸酶變性與復(fù)性作用,Nativeribonuclease,Denativereducedribonuclease,Nativeribonuclease,變性,復(fù)性,,（六）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),—OH,N,,,,,,蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜,蛋白質(zhì)在在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。,八、蛋白質(zhì)的分類,1.蛋白質(zhì)形狀,球狀蛋白（globularprotein）,纖維狀蛋白(fibrousprotein),,2.分子組成,簡單蛋白(simpleprotein)（按溶解度）,結(jié)合蛋白(conjugatedprotein)（按輔基）,,核蛋白,糖蛋白與蛋白聚糖,脂蛋白,色蛋白,磷蛋白,,,3、電泳：根據(jù)性質(zhì)：蛋白質(zhì)的兩性解離影響因素：電荷種類及數(shù)量、分子大小及形狀、溶液離子強(qiáng)度及pH等1.凝膠電泳2.SDS-PAGE電泳法3.雙向電泳,九、蛋白質(zhì)的分離純化,1、透析、鹽析、等電點(diǎn)沉淀2、超速離心：分子大小及形狀,,,,,4、層析（chromatography)（1）離子交換層析：電荷（2）分子篩（凝膠過濾層析）：分子大小及形狀（3）親和層析：生物特性,,,,測定多肽鏈的N－端氨基酸：(1)2，4—二硝基氟苯(DNFB)法(2)異硫氰酸苯酯(PITC)法，又稱Edman降解法，(3)氨肽酶法測定多肽鏈的C－端氨基酸：(1)還原法：用硼氫化鋰(LiBH4)試劑可將C-端氨基酸還原成相應(yīng)的α－氨基醇。肽鏈完全水解后，代表C－末端氨基酸的游離的α－氨基醇可用層析法加以鑒定。(2)羧肽酶,1.胰蛋白酶水解Lys和Arg殘基的羧基端；2.胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸殘基的羧基端，如Phe、Trp、Tyr。,假定有一個(gè)未知氨基酸序列的五肽，對其進(jìn)行一系列分析結(jié)果如下：(1)1mmol五肽水解生成2mmolGlu，1mmolLys和2mmolTrp。(2)五肽用胰蛋白酶水解成氨基酸組成分別為Glu1、Trp1以及Glu1、Lys1、Trp1的一個(gè)二肽及一個(gè)三肽。(3)DNFB處理胰蛋白酶水解的一個(gè)肽段，再酸水解后得到DNP-Glu。用胰凝乳蛋白酶處理原來的五肽生成肽段及游離Glu。試從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷該五肽的氨基酸序列,Glu-Trp-Lys-Trp-Glu,必需氨基酸------人體自身不能合成或合成速度不能滿足人體需要，必須從食物中攝取的氨基酸。對成人來說，這類氨基酸有8種，包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。非必需氨基酸------人體可以自身合成或由其它氨基酸轉(zhuǎn)化而得到，不一定非從食物直接攝取不可。,1．下列哪一類氨基酸對于人體全部是必須氨基酸A．堿性氨基酸B．酸性氨基酸C．分枝氨基酸D．芳香氨基酸,1.氨基酸的結(jié)構(gòu)式、分類、三字母代號；2.氨基酸的重要理化性質(zhì)：兩性解離和pI；3.蛋白質(zhì)1-4級結(jié)構(gòu)層次特點(diǎn)、作用力；4.蛋白質(zhì)的重要理化性質(zhì):膠體性質(zhì)、蛋白質(zhì)沉淀、變性；5.蛋白質(zhì)純化及分子量測定方法和原理;6.氨基酸序列測定（DNFB、PITC、蛋白酶）；7.名詞解釋：pI，必需氨基酸，別構(gòu)效應(yīng)，構(gòu)象，肽平面，超二級結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)變性,本章重點(diǎn),測定多肽鏈的C一末端氨基酸的方法有：(1)還原法：用硼氫化鋰(LiBH4)試劑可將C-端氨基酸還原成相應(yīng)的α－氨基醇。肽鏈完全水解后，代表C－末端氨基酸的游離的α－氨基醇可用層析法加以鑒定。Sanger早期就是采用這種方法測定胰島素A、B鏈的C-末端殘基。(2)肼解法：是目前測定C－末端氨基酸殘基的最重要的化學(xué)方法。多肽鏈與無水肼加熱發(fā)生肼解，所有的肽鍵均斷裂，除C－末端氨基酸以游離形式存在外，其他的氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化臺物。肼解后產(chǎn)生的C一末端氨基酸，可用層析法加以鑒定。(3)酶法：羧肽酶是一類肽鏈外切酶，專一地從肽鏈的c—末端開始逐個(gè)降解，釋放出游離的氨基酸。,,1.可逆沉淀(非變性沉淀)在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。2.不可逆沉淀(變性沉淀)在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。,問答題和計(jì)算題,1、為什麼說蛋白質(zhì)是生命活動最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)？2、試比較Gly、Pro與其它常見氨基酸結(jié)構(gòu)的異同，它們對多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的形成有何影響？3、試舉例說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（包括一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系）。4、為什么說蛋白質(zhì)水溶液是一種穩(wěn)定的親水膠體？5、什麼是蛋白質(zhì)的變性？變性的機(jī)制是什麼？舉例說明蛋白質(zhì)變性在實(shí)踐中的應(yīng)用。名詞解釋,1、重要名詞：isoelectricpoint（pI）；domain;subunit；allostericeffect;proteindenaturation;moleculardisease；peptidebond,氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級鍵氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大疏水相互作用力對維持三級結(jié)構(gòu)特別重要鹽鍵數(shù)量小二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定,離子鍵,氫鍵,范德華力,疏水相互作用力,凝膠過濾法填料內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。一定型號的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外；洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大。商品名：Sephadex；Sepharose,,,4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑普通蛋白質(zhì)電泳的泳動速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大小、形狀）用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)電）；且荷質(zhì)比相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合SDS多；分子小，結(jié)合SDS少）不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的遷移率作圖測出待測樣品的遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對分子質(zhì)量,