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附件2 保健食品中羅格列酮和格列苯脲的快速檢測 膠體金免疫層析法 （KJ201902） 1　 范圍 本方法規(guī)定了保健食品中羅格列酮和格列苯脲的膠體金免疫層析快速篩查方法。 本方法適用于聲稱具有輔助降血糖功能的保健食品中羅格列酮和格列苯脲成分的快速篩查。 2　 原理 本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的羅格列酮和格列苯脲等物質(zhì)經(jīng)提取后與膠體金標記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中羅格列酮和格列苯脲成分進行定性判定。 3　 試劑與材料 3.1　 試劑 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。 3.1.1　 甲醇：色譜純。 3.1.2　 三羥甲基氨基甲烷，Tris堿。 3.1.3　 濃鹽酸。 3.1.4　 吐溫-20。 3.1.5　 鹽酸溶液：量取濃鹽酸（3.1.3）16.7 mL，用水溶解并稀釋至100 mL。 3.1.6　 緩沖液：稱取12.1 g Tris堿（3.1.2），加適量水溶解，混勻，用鹽酸溶液（3.1.5）調(diào)節(jié)pH至8.0，加入5.0 g吐溫-20（3.1.4）攪拌均勻，定容至1000 mL。 3.2　 參考物質(zhì) 參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度均≥99%。 表1 參考物質(zhì)信息表 序號 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號 分子式 相對分子量 1 馬來酸羅格列酮 Rosiglitazone maleate 155141-29-0 C18H17N3O3S 355.41 2 格列苯脲 Glyburide 10238-21-8 C23H28ClN3O5S 494.00 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3　 標準溶液配制 3.3.1　 羅格列酮標準儲備液（1.0 mg/mL）：精密稱取適量羅格列酮參考物質(zhì)（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0?mg/mL的標準儲備液。-20℃避光保存，有效期1年。 3.3.2　 羅格列酮標準工作液（10?μg/mL）：精密移取適量羅格列酮標準儲備液（1.0mg/mL）（3.3.1）分別置于10?mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為10?μg/mL的標準工作液。-20℃避光保存，有效期3個月。 3.3.3　 格列苯脲標準儲備液（1.0 mg/mL）：精密稱取適量格列苯脲參考物質(zhì)（3.2），用甲醇（3.1.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0?mg/mL的標準儲備液。-20℃避光保存，有效期1年。 3.3.4　 格列苯脲標準工作液（10?μg/mL）：精密移取適量格列苯脲標準儲備液（3.3.3）分別置于10?mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10?μg/mL的標準工作液。-20℃避光保存，有效期3個月。 3.4　 材料 羅格列酮膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質(zhì)為保健食品。 格列苯脲膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質(zhì)為保健食品。 4　 設(shè)備與儀器 4.1　 設(shè)備 4.1.1　 天平：感量為0.1 mg和0.01 g。 4.1.2　 渦旋混合器。 4.1.3　 移液器：20-200 μL，100-1000 μL，5 mL。 4.1.4　 離心機：轉(zhuǎn)速可達4000 r/min以上。 4.2　 儀器 4.2.1　 讀數(shù)儀：產(chǎn)品配套可使用的檢測儀器（可選）。 4.2.2　 環(huán)境條件：溫度10-40℃，相對濕度≤80%。 5　 分析步驟 5.1　 試樣制備 液體樣品充分混勻，固體樣品充分粉碎混勻。 5.2　 試樣提取和凈化 5.2.1　 液體基質(zhì) 量取0.5 mL±0.02 mL試樣于15 mL離心管中，加入4 mL緩沖液（3.1.6），渦旋混合30 s，作為待測液。 5.2.2　 固體基質(zhì) 準確稱取試樣0.5 g±0.01 g于15 mL離心管中，加1 mL甲醇（3.1.1），渦旋30 s，4000 rpm離心2 min或靜置2 min。取250 μL上清液于2 mL離心管中，加入750 μL緩沖液（3.1.6），渦旋混合30s，作為待測液。 注：試樣提取和凈化（5.2）過程可按照試劑盒說明書操作，不做限定。 5.3　 測定步驟 5.3.1　 試紙條與金標微孔測定步驟 吸取200 μL樣品待測液于金標微孔中，抽吸5-10次使混合均勻，室溫溫育5 min；溫育結(jié)束后，將試紙條吸水海綿端垂直向下插入金標微孔中，室溫溫育5 min，從微孔中取出試紙條，去掉試紙條下端的吸水海綿，進行結(jié)果判定。 注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。 5.3.2　 檢測卡與金標微孔測定步驟 吸取200 μL上述待測液于金標微孔中，上下抽吸5-10次使混合均勻。室溫溫育5 min，將反應(yīng)液全部加入到檢測卡的加樣孔中，將金標微孔中全部溶液滴加到檢測卡上的加樣孔中，溫育5 min，進行結(jié)果判定。 注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。 5.4　 質(zhì)控試驗 每批樣品應(yīng)同時進行空白試驗和加標質(zhì)控試驗。 5.4.1　 空白試驗 準確稱取固體空白試樣0.5 g±0.01 g或量取液體空白試樣0.5 mL±0.02 mL于15 mL離心管中，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。 5.4.2　 加標質(zhì)控試驗 準確稱取固體空白試樣0.5 g±0.01 g或量取液體空白試樣0.5 mL±0.02 mL于15 mL離心管中，加入適量標準工作液（3.3.2），使羅格列酮參考物質(zhì)濃度為1.0 μg/g或1.0 μg/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。 準確稱取固體空白試樣0.5 g±0.01 g或量取液體空白試樣0.5 mL±0.02 mL于15 mL離心管中，加入適量標準工作液（3.3.4），使格列苯脲參考物質(zhì)濃度為1.0 μg/g或1.0 μg/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。 6　 結(jié)果判定 通過對比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結(jié)果判定。目視判定示意圖見圖1。結(jié)果判定也可根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。 6.1　 無效 控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條無效。 6.2　 陰性結(jié)果 控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當，均表示樣品中不含待測組分或含量低于方法檢測限，判為陰性。 6.3　 陽性結(jié)果 控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色明顯淺或檢測線（T線）不顯色，均表示樣品中待測組分含量高于方法檢測限，判為陽性。 6.4　 質(zhì)控試驗要求 空白試驗測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標質(zhì)控試驗測定結(jié)果應(yīng)為陽性。 圖1 目視判定示意圖 7　 結(jié)論 當檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)對結(jié)果進行確證。 8　 性能指標 8.1　 檢出限 固體樣品1.0 μg/g，液體樣品1.0 μg/mL。 8.2　 靈敏度 靈敏度≥95%。 8.3　 特異性 特異性≥90%。 8.4　 假陰性率 假陰性率≤5%。 8.5　 假陽性率 假陽性率≤10%。 注：性能指標計算方法見附錄A。 9　 其他 本方法分析步驟和結(jié)果判定可以根據(jù)廠家試劑盒的說明書進行，但應(yīng)符合或優(yōu)于本方法規(guī)定的性能指標。 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。但方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過驗證的滿足本方法規(guī)定的各項性能指標的試劑、試劑盒。 本方法參比標準為食品補充檢驗方法BJS201710《保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測》、藥品檢驗補充檢驗方法2009029《降糖類中成藥中非法添加化學(xué)藥品補充檢驗方法》。 本方法使用羅格列酮試劑盒可能與吡格列酮存在交叉反應(yīng)；格列苯脲試劑盒可能與格列美脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮、甲苯磺丁脲存在交叉反應(yīng)；當結(jié)果判定為陽性應(yīng)對結(jié)果進行確證。 - 8 - 附錄A 定性方法性能指標計算表 表A.1性能指標計算方法 樣品情況a 檢測結(jié)果b 總數(shù) 陽性 陰性 陽性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異（c2） c2=（?N12-N21?-1）2/（N12+N21）， 自由度（df）=1 靈敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特異性（p-，%） p-=N22/N2. 假陰性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特異性 相對準確度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由參比方法檢驗得到的結(jié)果或者樣品中實際的公議值結(jié)果； b由待確認方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用確認后的結(jié)果。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測結(jié)果相對準確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。 本方法負責起草單位：廣東省食品檢驗所。 驗證單位：江蘇省南通市食品藥品監(jiān)督檢測中心、南京工業(yè)大學(xué)。 主要起草人：汪廷彩、蔡若純、劉海虹、雷毅。