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附件6 動物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的快速檢測 膠體金免疫層析法 (KJ201906) 1　 范圍 本方法規(guī)定了動物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的膠體金免疫層析快速檢測方法。 本方法適用于生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、豬肉、豬肝、豬腎中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、噁喹酸殘留的快速測定。 2　 原理 本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的喹諾酮類物質(zhì)與膠體金標記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導致檢測線顏色深淺的變化，通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中喹諾酮類物質(zhì)進行定性判定。 3　 試劑和材料 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。 3.1　 試劑 3.1.1　 乙腈。 3.1.2　 甲酸。 3.1.3　 分散固相萃取劑I：分別稱取硫酸鎂18 g、醋酸鈉4.5 g放于研缽中研碎。 3.1.4　 分散固相萃取劑II：分別稱取硫酸鎂27 g、N-丙基乙二胺（PSA）4.5 g放于研缽中研碎。 3.1.5　 甲酸-乙腈溶液：98 mL乙腈中加入2 mL甲酸，混勻。 3.1.6　 甲醇。 3.1.7　 稀釋液：脫脂奶粉︰水（1︰10）。 3.2　 參考物質(zhì) 喹諾酮類參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度≥99%。 表1 喹諾酮類參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量 序號 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號 分子式 相對分子量 1 洛美沙星 Lomefloxacin 98079-51-7 C17H19F2N3O3 351.35 2 培氟沙星 Pefloxacin 70458-92-3 C17H20FN3O3 333.36 3 氧氟沙星 Ofloxacin 82419-36-1 C18H20FN3O4 361.37 4 諾氟沙星 Norfloxacin 70458-96-7 C16H18FN3O3 319.33 5 達氟沙星 Danofloxacin 112398-08-0 C19H20FN3O3 357.38 6 二氟沙星 Difloxacin 5522-39-4 C28H33N3F2 449.58 7 恩諾沙星 Enrofloxacin 93106-60-6 C19H22FN3O3 359.16 8 環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin 85721-33-1 C17H18FN3O3 331.13 9 氟甲喹 Flumequine 42835-25-6 C14H12FNO3 261.25 10 噁喹酸 Oxolinic Acid 14698-29-4 C13H11NO5 261.23 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3　 標準溶液的配制 3.3.1喹諾酮類物質(zhì)標準儲備液（1 mg/mL）：分別精密稱取喹諾酮類參考物質(zhì)（3.2）適量，置于50 mL燒杯中，加入適量甲醇（3.1.6）超聲溶解后，用甲醇轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1 mg/mL的喹諾酮標準儲備液。-20℃避光保存，有效期6個月。 3.3.2喹諾酮類物質(zhì)標準中間液（1 μg/mL）：分別吸取喹諾酮類標準儲備液（1 mg/mL）（3.3.1）100 μL于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.6）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1 μg/mL的喹諾酮類標準中間液。 3.4　 材料 3.4.1　 金標微孔（含膠體金標記的特異性抗體）。 3.4.2　 試劑條或檢測卡。 4　 儀器和設備 4.1　 移液器：100 μL、200 μL和1 mL。 4.2　 渦旋混合器。 4.3　 離心機：轉(zhuǎn)速≥4000 r/min。 4.4　 電子天平：感量為0.01 g。 4.5　 孵育器：可調(diào)節(jié)時間、溫度，控溫精度±1℃。 4.6　 讀數(shù)儀。 4.7　 氮吹儀。 4.8　 環(huán)境條件：溫度15℃～35℃，濕度≤80%（采用孵育器與讀數(shù)儀時可不要求環(huán)境溫度）。 5　 分析步驟 5.1　 試樣制備 液體乳直接用于測定，豬肉、豬肝、豬腎用組織搗碎機等攪碎后備用。 5.2　 試樣的提取 5.2.1 生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳 分別吸取同等體積的液體乳樣品與稀釋液混合后為待測液。 5.2.2 豬肉、豬肝、豬腎 準確稱取2.5±0.01 g均質(zhì)后的組織樣品于15 mL離心管中，加入5 mL甲酸-乙腈溶液（3.1.5），渦旋混合1 min，振蕩5 min，4000 r/min離心5 min。將上清液2 mL轉(zhuǎn)入10 mL 離心管中，分別加入0.6 g分散固相萃取劑I(3.1.3)漩渦混合1 min、再加入0.6 g分散固相萃取劑II(3.1.4)后漩渦混合1 min，靜置分層后取1 mL于10 mL 離心管中，于氮吹儀60℃吹干后用1 mL樣品稀釋液溶解作為待測液。 5.3　 測定步驟 5.3.1 檢測卡測定步驟 5.3.1.1將檢測卡平放入孵育器中。小心撕開檢測卡的薄膜至指示線處，避免提起檢測卡和海綿。 5.3.1.2用移液器取待測液（5.2）300 μL，避免產(chǎn)生泡沫和氣泡。豎直緩慢的滴加至檢測卡兩側(cè)任意一側(cè)的凹槽中，將粘箔重新粘好。 5.3.1.3蓋上孵育器的蓋子，孵育器上的計時器自動開始計時，紅燈閃爍，孵育3 min。 5.3.1.4 取出檢測卡，不要擠壓樣品槽，放于讀數(shù)儀中，讀數(shù)前保持樣品槽一端朝下直到在讀數(shù)儀上讀取結(jié)果，或從孵育器上取出后直接目視法進行結(jié)果判定。 5.3.2試劑條與金標微孔測定步驟 吸取300 μL待測液（5.2）于金標微孔（3.4.1）中，抽吸5～10次使混合均勻，將試劑條（3.4.2）吸水海綿端垂直向下插入金標微孔中，孵育5～8 min，從微孔中取出試劑條，進行結(jié)果判定。 注：試劑條（或檢測卡）具體檢測步驟可參考相應的說明書操作。 5.4　 質(zhì)控試驗 每批樣品應同時進行空白試驗和加標質(zhì)控試驗。 5.4.1　 空白試驗 稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 5.4.2　 加標質(zhì)控試驗 準確稱取空白試樣（精確至0.01 g）置于具塞離心管中，加入一定體積的諾氟沙星標準中間液，使諾氟沙星終濃度為6 μg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 6　 結(jié)果判定 6.1　 讀數(shù)儀測定法 按讀數(shù)儀說明書要求操作直接讀取并進行結(jié)果判定， 6.2　 目視法 通過對比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結(jié)果判定。目視判定示意圖見圖1。 6.2.1　 無效 控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試劑條/檢測卡無效。 6.2.2　 陰性 檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當，表明樣品中喹諾酮類低于方法檢測限，判定為陰性。 6.2.3　 陽性 檢測線（T線）不顯色或檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺，表明樣品中喹諾酮類的含量高于方法檢測限，判定為陽性。 6.3　 質(zhì)控試驗要求 空白試驗測定結(jié)果應為陰性，加標質(zhì)控試驗測定結(jié)果應為陽性。 圖1 目視判定示意圖 7　 結(jié)論 當檢測結(jié)果為陽性時，應對結(jié)果進行確證。 8　 性能指標 8.1　 檢測限 生乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、豬肉、豬肝、豬腎中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、噁喹酸為3 μg/kg。 8.2　 靈敏度 靈敏度應≥99%。 8.3　 特異性 特異性應≥95%。 8.4　 假陰性率 假陰性率應≤1%。 8.5　 假陽性率 假陽性率應≤5%。 注：性能指標計算方法見附錄A。 9　 其他 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本方法規(guī)定的各項性能指標。 本方法參比標準為GB/T 21312-2007 《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》。附錄A 定性方法性能指標計算方法 表A.1 性能指標計算表 樣品情況a 檢測結(jié)果b 總數(shù) 陽性 陰性 陽性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異（х2） c2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21）， 自由度（df）=1 靈敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特異性（p-，%） p-=N22/N2. 假陰性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特異性 相對準確度，%c （N11+N22）/（N1.+N2.） 注： a由參比方法檢驗得到的結(jié)果或者樣品中實際的公議值結(jié)果； b由待確認方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用確認后的結(jié)果。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測結(jié)果相對準確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。 本方法負責起草單位：黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院。 驗證單位：國家農(nóng)林副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、海南省藥品檢驗所。 主要起草人：佟曉芳，楊光，趙平，陳薇薇，李春娟，姜金斗，王玉芝，陳堅。