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第7章 細(xì)胞重組與克隆技術(shù) 主要內(nèi)容：7.1細(xì)胞重組 7.2克隆技術(shù) 7.1 細(xì) 胞 重 組 7.1.1 細(xì)胞重組的定義 細(xì)胞重組（Cell Reconstruction）,又稱(chēng)細(xì)胞拆合是指從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組分，然后在體外一定條件下將不同細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞器及其組分進(jìn)行重組，使其重新裝配成為具有生物活性的細(xì)胞或細(xì)胞器的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 在探討真核細(xì)胞的起源時(shí)。馬吉利斯(MaRdls)曾于1972年提出了內(nèi)共生學(xué)說(shuō)：真核細(xì)胞起源于原核細(xì)胞，是幾個(gè)原核細(xì)胞共生結(jié)合的結(jié)果。如藍(lán)陰滴蟲(chóng)，細(xì)胞內(nèi)含葉綠體，就是藍(lán)藻在陰滴蟲(chóng)內(nèi)共生的結(jié)果；綠草履蟲(chóng)體內(nèi)的綠色物體，就是與之共生的一種小球藻。 這種不同細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程類(lèi)似于細(xì)胞的自然裝配。 細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程包含著細(xì)胞器的自我裝配，但這是一種活體的自我裝配，而細(xì)胞重組則是離體的裝配過(guò)程。 7.1.2 細(xì)胞重組的意義 細(xì)胞重組技術(shù)是現(xiàn)代生物工程中的熱點(diǎn)課題，細(xì)胞重組與細(xì)胞融合技術(shù)是細(xì)胞工程中的細(xì)胞或細(xì)胞器水平上主要構(gòu)建手段，它與基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、干細(xì)胞技術(shù)等結(jié)合，可以人為地獲得新物種或使細(xì)胞表達(dá)新的性狀和新的產(chǎn)物。 7.1.3 細(xì)胞重組技術(shù)發(fā)展概況 7.1.4 幾個(gè)重要概念 胞質(zhì)體(Cytoplast)：是指除去細(xì)胞核后由膜包裹的無(wú)核細(xì)胞。 微細(xì)胞(Microcell)：是指只有一條或幾條染色體和一薄層細(xì)胞質(zhì)，外面包裹一層完整的細(xì)胞質(zhì)膜的核質(zhì)體。 核體(Karyoplast)：是指與胞質(zhì)分離得到的細(xì)胞核，帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱(chēng)為核體。 7.1.5 細(xì)胞重組的方式 胞質(zhì)體(Cytoplast)：與完整細(xì)胞重組形成胞質(zhì)雜種(Cybrid)。 微細(xì)胞(Microcell)：與完整細(xì)胞重組形成微細(xì)胞異核體(Heterokaryon)。 胞質(zhì)體與核體(Karyoplast)：重新組合形成重組細(xì)胞。 7.1.6 細(xì)胞重組技術(shù) 1、顯微操縱術(shù) 一般是在顯微解剖鏡下，把細(xì)胞放入消毒的培養(yǎng)液中，同時(shí)放入冷卻系統(tǒng)中以減慢細(xì)胞發(fā)育，然后借助一臺(tái)專(zhuān)門(mén)的裝置——顯微操作儀，用細(xì)微玻璃針或用微細(xì)管、微電極、微熱電偶等斜插入細(xì)胞中去，可以挑取細(xì)胞核，人工造就去核細(xì)胞；也可以進(jìn)一步作移核實(shí)驗(yàn)與電生理實(shí)驗(yàn)。 用這種儀器能夠進(jìn)行細(xì)胞各部分的解剖、細(xì)胞各部分物質(zhì)的抽取和移植、各物質(zhì)的注入、測(cè)量微電位的變化等等。 意義: 1、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的拆合 2、為研究細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)與調(diào)控和改良動(dòng)物品種提供了一種重要手段。 2、細(xì)胞分離技術(shù) 分離細(xì)胞主要是根據(jù)細(xì)胞本身的某些特殊性質(zhì)來(lái)選擇合適的分離技術(shù)來(lái)分離具有同一性狀的細(xì)胞群、這些性質(zhì)包括：細(xì)胞大小、密度、表面電荷、表面標(biāo)志、細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)成分的熒光強(qiáng)弱、細(xì)胞對(duì)其他介質(zhì)的吸附作用 經(jīng)常采用的細(xì)胞分離方法如下： （1）差速離心（differentialcentrifugation） 　　在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器 在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。（速度升高，樣品按大小先后沉淀） 　　由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會(huì)好一些。 　　差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。對(duì)于精細(xì)的分離，則是密度梯度離心效果更好。 （2）梯度沉降分離法 主要是根據(jù)細(xì)胞大小不同分離細(xì)胞、細(xì)胞在單位重力作用下，通過(guò)密度介質(zhì)、或在低離心力作用下通過(guò)梯度密度溶液沉降，由于細(xì)胞大小不同，沉降速度不同。細(xì)胞大，沉降快。 常采用適當(dāng)?shù)姆蛛x介質(zhì)形成一定的梯度密度溶液．這此介質(zhì)主要有：血清、蔗糖等： （3）等密度沉降分離法 主要是根據(jù)細(xì)胞密度差異來(lái)分離細(xì)胞。 細(xì)胞在連續(xù)密度梯度分離介質(zhì)中、受強(qiáng)離心力的作用，最后到達(dá)與其密度相同的分離介質(zhì)層面，并保持平衡。 如果是非連續(xù)密度梯度介質(zhì)中，細(xì)胞主要集中在介于其自身密度的兩種密度介質(zhì)交界面上，從而達(dá)到分離的目的。 目前常采用的分離介質(zhì)有蛋白等。密度分離劑應(yīng)該具有無(wú)刺激，對(duì)細(xì)胞無(wú)吸附作用，產(chǎn)生的滲透壓小等特點(diǎn) （4）流式細(xì)胞儀分離法 這種方法是以免疫熒光法使熒光抗體與細(xì)胞膜表面抗原結(jié)合，然后用超聲波處理使其分散成單個(gè)細(xì)胞，再將細(xì)胞懸浮液通過(guò)一個(gè)直徑為50um的噴嘴變成極細(xì)小的微滴，每個(gè)微滴一般含有一個(gè)細(xì)胞，以l0m/s的速度噴出。經(jīng)激光照射是細(xì)胞上所帶熒光被激發(fā)而轉(zhuǎn)換成脈沖．通過(guò)測(cè)定脈沖數(shù)就可以換算出各種不同細(xì)胞表面抗原的情況。同時(shí)由于懸浮微滴中的細(xì)胞帶有不同程度的負(fù)電荷，這樣在施加電場(chǎng)后。移行偏斜的程度不同，而不帶電荷的細(xì)胞仍以直線流過(guò)、借此可以收集得到不帶電荷或帶電荷多少不同的各種細(xì)胞。 這種方法優(yōu)點(diǎn)是分離速度快，分離得到的細(xì)胞仍能保持其功能；缺點(diǎn)是需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備。 3、細(xì)胞破碎方法 細(xì)胞器的分離需要將組織細(xì)胞破碎，常用的方法有：超聲波破碎法；反復(fù)凍融法；化學(xué)裂解法；高速組織搗碎法。 （1）超聲波破碎法 原理是：超聲波發(fā)生器產(chǎn)生高強(qiáng)度超聲信號(hào)，經(jīng)換能器傳送至與其接觸的細(xì)胞溶液中，由聲波沖擊和振動(dòng)產(chǎn)生的剪切力使細(xì)胞破碎。 缺點(diǎn)是破碎過(guò)程中會(huì)產(chǎn)熱，應(yīng)該注意冷卻。有些生物大分子不宜采用。 （2）反復(fù)凍融法 使細(xì)胞溶液或組織細(xì)胞漿在超低溫冰箱或液氮罐內(nèi)凍結(jié)后，在37℃復(fù)溫融化，重復(fù)3-4次操作使細(xì)胞壁破碎。 （3）化學(xué)裂解法 在細(xì)胞懸浮液中加入某些化學(xué)物質(zhì)如十二烷基硫酸鈉等使細(xì)胞膜裂解。在使用該方法的同時(shí)常要輔助以一些機(jī)械的方法才能使細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)完全破碎；由于化學(xué)裂解劑會(huì)干擾分析，在細(xì)胞裂解后應(yīng)注意清除化學(xué)裂解劑。 （4）高速組織搗碎法 主要借助高速組織搗碎機(jī)使細(xì)胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片破碎。 由于也會(huì)發(fā)熱，可能導(dǎo)致分離物的降解，因此不能時(shí)間過(guò)長(zhǎng)．必要時(shí)可使用循環(huán)水冷卻 4、細(xì)胞器分離方法 為了研究細(xì)胞內(nèi)某種細(xì)胞器的生化組成、生理功能，或用于細(xì)胞重組，常需大量采集細(xì)胞的某些組分。常用的方法有：研磨、超聲振蕩和低滲等將組織制成勻漿，細(xì)胞中的一些亞組分就從細(xì)胞中釋放出來(lái)。然后采用以上介紹的沉降分離法實(shí)現(xiàn)分級(jí)分離。 【實(shí)驗(yàn)】細(xì)胞器分離、制備與觀察 【目的】（1）掌握分離制備動(dòng)物細(xì)胞線粒體的方法。（2）對(duì)分離得到的線粒體進(jìn)行活性鑒定。 【原理】線粒體（mitochondria）是真核細(xì)胞特有的，司能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。細(xì)胞中的能源物質(zhì)——脂肪、糖、部分氨基酸在此進(jìn)行最終的氧化，并通過(guò)耦聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細(xì)胞生理活動(dòng)之需。 將動(dòng)植物組織制成勻漿，在適當(dāng)?shù)膽腋〗橘|(zhì)中用差速離心法可以分離細(xì)胞線粒體。在一定的離心場(chǎng)中(選用離心機(jī)的一定轉(zhuǎn)速)，球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時(shí)間，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。 細(xì)胞器沉降先后順序是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。 懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性； pH7.2的條件下；亞細(xì)胞組分不容易重新聚集成團(tuán)，有利于分離。 整個(gè)操作過(guò)程樣品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。 細(xì)胞器標(biāo)記酶的測(cè)定是評(píng)價(jià)細(xì)胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無(wú)色。 ******************************************************************************* 舉例：鼠肝線粒體的分離 1．制備肝細(xì)胞勻漿： 實(shí)驗(yàn)前將鼠空腹12小時(shí)，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干水，稱(chēng)取肝組織2g，剪碎；用預(yù)冷的0.25 mol／L蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后按每克肝加4.5 mL預(yù)冷的0.25 mol／L蔗糖溶液的量，分?jǐn)?shù)次添加蔗糖溶液，在0~4℃冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿，用雙層紗布過(guò)濾。 2．差速離心： 將0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入離心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝勻漿覆蓋于上層。用冷凍控溫的高速離心按下圖順序進(jìn)行差速離心。 分離細(xì)胞核： 活性鑒定： (1) 細(xì)胞核：取核沉淀1滴涂于載玻片，加入Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸3:1）15 min，晾干。Giemsa染液染10 min，蒸餾水漂洗數(shù)秒，用濾紙吸干水、用顯微鏡(40×)檢查，細(xì)胞核呈紫紅色，混雜的胞質(zhì)為淺藍(lán)色碎片。 (2) 線粒體： 取線粒體沉淀滴在載玻片上，勿太密。滴加1％詹鈉斯綠溶液染液，10 min后用光學(xué)顯微鏡觀察，線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。 ******************************************************************************* 5、胞質(zhì)體、核體、微細(xì)胞的制備（細(xì)胞重組常用的幾個(gè)原料，重點(diǎn)介紹） （1）胞質(zhì)體 方法：細(xì)胞松弛素B處理體外培養(yǎng)細(xì)胞能誘發(fā)其排核，結(jié)合高速離心得到了胞質(zhì)體。 影響制取胞質(zhì)體的因素：容器，有玻璃片、塑料片、離心管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等，需在滅菌恒溫培養(yǎng)室中進(jìn)行。適宜的溫度、細(xì)胞松弛素B的劑量、培養(yǎng)液濃度及其血清含量、離心速度、細(xì)胞密度等。 特點(diǎn)： 植物細(xì)胞的胞質(zhì)體內(nèi)的細(xì)胞器與完整細(xì)胞相同，具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系、線粒體、溶酶體、高爾基體和中心粒及微粒、微管等骨架系統(tǒng)，各細(xì)胞器仍占有固有的位置。線粒體的運(yùn)動(dòng)十分活躍，線粒體膜上各酶系的分布及氧化磷酸化過(guò)程都照樣存在。 胞質(zhì)體內(nèi)線粒體內(nèi)自主性的DNA復(fù)制尚能有限地進(jìn)行著。蛋白質(zhì)的合成在去核后的一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)進(jìn)行。因此，去核細(xì)胞質(zhì)體是深入研究細(xì)胞質(zhì)作用的重要樣品。 （2）核體 與胞質(zhì)分離得到的細(xì)胞核，帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱(chēng)為“核體”。核體能重新再生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長(zhǎng)、分裂。 為了生產(chǎn)大量的核體，必須采用一系列的純化技術(shù)，以防夾雜完整細(xì)胞和胞質(zhì)體?？稍谌ズ颂幚砗?從離心管底部收集樣品,接種于培養(yǎng)皿內(nèi),溫育1-2h，由于核體的貼壁率大大低于殘留完整細(xì)胞的貼壁率，可從上清液中收集得到較純凈的核體。如此重復(fù)1-2次,可使核體的純度高達(dá)99％。 （3）微細(xì)胞 秋水仙素及其衍生物和長(zhǎng)春新堿等有絲分裂阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，而使染色體停滯在有絲分裂中期。 經(jīng)體外培養(yǎng)，在單個(gè)染色體或染色體周緣就會(huì)重現(xiàn)核膜而形成含有一個(gè)微核、一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的微細(xì)胞。這種微細(xì)胞僅含有一個(gè)或數(shù)個(gè)染色體的DNA，也是細(xì)胞拆合工程的一種有用材料。 （4）小結(jié) 用上述方法從活細(xì)胞中拆散出來(lái)的胞質(zhì)體、核體、微細(xì)胞為材料，通過(guò)顯微操縱術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下用顯微操縱器把材料重新組合，加入病毒或化學(xué)物質(zhì)如聚乙二醇等融合因子，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的作用，可以把它們更新裝配成新的活細(xì)胞。 胞質(zhì)體、核體和微細(xì)胞的制備 6、細(xì)胞拆合的方法 （1）物理拆合法： 早期：使用的核、質(zhì)分離方法是用紫外線或激光將核破壞，再用微玻璃針或微吸管將其他細(xì)胞核吸入 后期：將細(xì)胞融合技術(shù)與顯微外科手術(shù)結(jié)合，作微吸管將細(xì)胞核連同周?chē)倭考?xì)胞質(zhì)吸出，再吸入等量的滅活的病毒懸液，一并注入已去核的細(xì)胞中，讓其發(fā)生融合 （2）化學(xué)拆合法 ①細(xì)胞松馳素效應(yīng)： 干擾細(xì)胞質(zhì)的分裂； 引起細(xì)胞表面形狀的改變和排出細(xì)胞核； 抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)； 阻礙細(xì)胞的吞噬或胞飲； 減低細(xì)胞的粘著程度； 阻止神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)； 影響葡萄糖和核苷酸的攝?。? 影響甲狀腺素的分泌和生長(zhǎng)激素的釋放以及影響細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)； 高濃度的細(xì)胞松馳素能使離體或活體的多種細(xì)胞發(fā)生明顯的表面形態(tài)的改變。其中之一是在細(xì)胞表面產(chǎn)生所謂的“皰疹” ②胞質(zhì)體和核體的制備 將細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃或塑料平板上，一般培養(yǎng)2天以上脫核。將經(jīng)37℃預(yù)溫的CB溶液（含CB10μg/mL和小牛血清5%）5mL加入50mL離心管內(nèi)，把生長(zhǎng)有細(xì)胞的塑膠板面朝下，水平放入CB溶液中，在圓板上壓上一個(gè)圓形的栓，以防止圓板移動(dòng)位置。蓋好離心管后，放入經(jīng)37℃預(yù)溫過(guò)的轉(zhuǎn)頭內(nèi)進(jìn)行離心。多數(shù)細(xì)胞株在11000-15000r/min離心15-30min，有80%的細(xì)胞脫核 按上述去核過(guò)程，即可得到無(wú)核的胞質(zhì)體和細(xì)胞核，但在被分離出的核中帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱(chēng)為“核體” 去核前作預(yù)離心，可去除貼壁不牢的完整細(xì)胞。 去核以后一般用貼壁法純化，即可利用核體貼壁附著性弱、完整細(xì)胞附著性強(qiáng)的特點(diǎn)進(jìn)行純化。重復(fù)兩次，可把大部分完整細(xì)胞除掉 ③微核體的制備 秋水仙素及其衍生物和長(zhǎng)春新堿等有絲分裂阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，而使染色體停滯在有絲分裂中期。動(dòng)物細(xì)胞受秋水仙堿作用，形成了大小不同的多個(gè)微核，用CB使微核從細(xì)胞分離出來(lái)。 制備微核體的時(shí)候，用0.1μg/mL秋水仙堿長(zhǎng)時(shí)間（48h以上）處理細(xì)胞，細(xì)胞分裂就被控制在分裂中期，此時(shí)染色體動(dòng)力終止，在單個(gè)染色體或染色體群之周緣重現(xiàn)核膜，形成了大小不同的多數(shù)微核，此時(shí)的細(xì)胞就叫微核化細(xì)胞。一般用14000r/min離心20min 即可脫核80-90%。 7、細(xì)胞重組及細(xì)胞質(zhì)雜交 （1）動(dòng)物細(xì)胞重組及細(xì)胞質(zhì)雜交 ①進(jìn)行細(xì)胞重組時(shí)，在融合環(huán)圓板上放入核體(0.2mL)和仙臺(tái)病毒(HVJ)0.1mL以及緩沖液0.5mL進(jìn)行融合。 ②進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)雜交時(shí)，向圓板上加入完整細(xì)胞懸液0.5mL(一個(gè)圓板上約有細(xì)胞2-3×105個(gè))，放置15min以便細(xì)胞質(zhì)體和完整細(xì)胞接觸，然后吸除懸液，再加PEG 0.25mL作用30s。 ③細(xì)胞融合處理后，加培養(yǎng)液洗融合環(huán)內(nèi)的圓培養(yǎng)液反復(fù)4次吸引洗凈后，加入10%-15%小牛血清培養(yǎng)液1-2h。最后用0.1%胰酶使融合細(xì)胞從板上脫落，移入新平皿內(nèi)培養(yǎng)。 ④融合后重組細(xì)胞株的分離。 （2）植物的細(xì)胞重組 使胞質(zhì)體與核懸浮并沉淀在硝酸鈣溶液中，除去上清液，先把它們懸浮，然后以適當(dāng)比例使核與胞質(zhì)體在試管中混合，離心，隨后加入PEG處理使它們凝集，再慢慢加入硝酸鈣溶液，促使核的攝入，其后洗滌、培養(yǎng)，把異核的原生質(zhì)體培養(yǎng)成新的植株。 （3）微生物的細(xì)胞核與原生質(zhì)體融合 核體的分離：降低原生質(zhì)體滲透壓使質(zhì)膜破裂，同時(shí)保護(hù)核體和核膜的穩(wěn)定使細(xì)胞核分離出來(lái)，經(jīng)過(guò)蔗糖梯度離心純化可得到提純的核樣品 把核與營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)的受體菌原生質(zhì)體混合，在PEG的誘導(dǎo)作用下得到核與原生質(zhì)體的融合產(chǎn)物 7.2 克隆技術(shù) 7.2.1 克隆的定義 克隆(Clone)原指遺傳上完全相同的分子、細(xì)胞或來(lái)自同一祖先的生物個(gè)體的無(wú)性繁殖群體，現(xiàn)在也指一種實(shí)現(xiàn)無(wú)性繁殖的操作?？寺∈侵敢环N實(shí)現(xiàn)無(wú)性繁殖的操作，而不是一般意義上的無(wú)性繁殖。 7.2.2 克隆的理論基礎(chǔ)——細(xì)胞全能性。 克隆在植物界已有上千年的歷史。理論的上的突破在20世紀(jì)。 1902年德國(guó)植物學(xué)家哈伯蘭德提出，植物的體細(xì)胞具有母體全部的遺體信息，具有發(fā)育成為完整個(gè)體的潛能。因而每個(gè)植物細(xì)胞都可像胚胎細(xì)胞那樣，經(jīng)離體培養(yǎng)再生成為完整植株。這就是所謂的細(xì)胞全能性。 理論上，任何一個(gè)細(xì)胞都含有其生物體系基因組的全部基因，都可以被克隆。實(shí)際上，動(dòng)植物細(xì)胞克隆結(jié)果差別很大?？寺‖F(xiàn)象在植物界普遍存在。既可以是自然的，也可以是人工的。 7.2.2 克隆的理論基礎(chǔ) 與植物細(xì)胞不同，在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中分化了的細(xì)胞不再產(chǎn)生完整的充分分化的個(gè)體，然而，動(dòng)物胚胎的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育是否造成體細(xì)胞基因組的不可逆性修飾，即在發(fā)育過(guò)程中分化了的細(xì)胞是否具有與受精卵相同的核等價(jià)性或基因組連續(xù)性、一直是發(fā)育生物學(xué)要解決的問(wèn)題 早在20世紀(jì)30年代，著名的胚胎學(xué)家斯佩爾曼就已經(jīng)提出了分化了的細(xì)胞核移入卵子中能否指導(dǎo)胚胎發(fā)育這樣的設(shè)想。用兩棲類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行的一些克隆實(shí)驗(yàn)表明，早期胚胎細(xì)胞核經(jīng)移植可產(chǎn)生成熟的動(dòng)物個(gè)體。也就是說(shuō)尚未分化的胚胎細(xì)胞具有全能性?；谶@種認(rèn)知、人們采用胚胎分割及胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)成功克隆出了許多動(dòng)物。 這種對(duì)動(dòng)物細(xì)胞全能性的認(rèn)識(shí)自1997年后得到改變，體細(xì)胞克隆動(dòng)物“多利”羊的成功證明成熟的體細(xì)胞也具有全能性；后來(lái)，體細(xì)胞克隆小鼠、牛及山羊的成功，更充分證明高度分化的細(xì)胞核仍具有全能性。 因此，人們對(duì)細(xì)胞全能性有了全新的認(rèn)識(shí)。 7.2.3 克隆的技術(shù)方法 目前，克隆技術(shù)最成功的應(yīng)用體現(xiàn)在克隆動(dòng)物的培育上。下面主要介紹以細(xì)胞核移植為核心的無(wú)性繁殖技術(shù)。 （一）定義 細(xì)胞核移植技術(shù)（Cell nuclear transplantation technology)是指利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)細(xì)胞中，或者將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換，從而可能創(chuàng)造無(wú)性雜交生物新品種的一項(xiàng)技術(shù)。 **細(xì)胞核移植技術(shù) 由于主要的遺傳物質(zhì)存在于細(xì)胞核中，因此，核移植的受體將具有與核移植供體完全相同的遺傳基礎(chǔ)，因此，細(xì)胞核移植技術(shù)在動(dòng)物育種工作中具有十分重要的意義。 因?yàn)樗裰参镏械慕M織培養(yǎng)那樣，可以利用一頭優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物(例如高產(chǎn)的奶牛)復(fù)制出與它生得完全一樣的成千上萬(wàn)的細(xì)胞核移植系動(dòng)物。 細(xì)胞核移植技術(shù)是克隆技術(shù)的關(guān)鍵。 細(xì)胞核移植所得到的雜種稱(chēng)為核質(zhì)雜種。 根據(jù)細(xì)胞核移植對(duì)象的不同可分為胚胎細(xì)胞核移植、體細(xì)胞核移植等。 開(kāi)始時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞核移植主要是為了研究胚胎發(fā)育進(jìn)程中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)功能及兩者之間的關(guān)系，探索有關(guān)遺傳、發(fā)育和細(xì)胞分化等方面的理論問(wèn)題。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，這項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的組配，從而培育出新物種。 （二）發(fā)展歷史 1、提出思想 第一個(gè)提出對(duì)動(dòng)物進(jìn)行細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)的人是諾貝爾獎(jiǎng)獲得者德國(guó)胚胎學(xué)家漢斯?施佩曼博士， 他構(gòu)想了一個(gè)“奇異的實(shí)驗(yàn)”：把一個(gè)卵細(xì)胞的細(xì)胞核取出，然后把取自另一個(gè)發(fā)育到后期的胚胎的細(xì)胞核放入這個(gè)卵細(xì)胞中。 但由于技術(shù)等方面的原因使他沒(méi)能找到將細(xì)胞核導(dǎo)入卵細(xì)胞的方法。 2、建立技術(shù)及低等動(dòng)物試驗(yàn) 1952（美）羅伯特.布里格斯和T．J．金首先利用兩棲類(lèi)卵細(xì)胞建立了細(xì)胞核移植技術(shù)。 3、高等動(dòng)物試驗(yàn) 經(jīng)過(guò)大量低等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之后，研究人員開(kāi)始進(jìn)行哺乳動(dòng)物的移核試驗(yàn)。最早用來(lái)作移核試驗(yàn)的哺乳動(dòng)物是小鼠。 1977（美）杰克遜實(shí)驗(yàn)室用“亞無(wú)性繁殖”的方式，培育出7只單親小鼠。因?yàn)榇朔N小鼠的體細(xì)胞中只有母體一方的染色體，故稱(chēng)之為單親小鼠。 隨著技術(shù)發(fā)展，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞核移核實(shí)驗(yàn)開(kāi)始進(jìn)入一個(gè)令人囑目的新階段。 1981，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的卡爾?伊爾門(mén)澤和美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室的必得?霍普首次對(duì)小鼠卵進(jìn)行移核試驗(yàn)獲得成功。他們將囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的核移入去核的受精卵中，經(jīng)培養(yǎng)移核卵發(fā)育到囊胚期、再將此胚胎植入同步孕小鼠的子宮內(nèi)，最后產(chǎn)下兩雌一雄仔鼠，并發(fā)育成了可育的個(gè)體。 我國(guó)的細(xì)胞核移植技術(shù)工作開(kāi)始于20世紀(jì)50年代，主要是在兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)上進(jìn)行的。 1961，童第周等以金魚(yú)和鳑被魚(yú)為材料，進(jìn)行魚(yú)類(lèi)不同亞科間的細(xì)胞核移植獲得成功，用以研究雜交細(xì)胞核與純種細(xì)胞核在發(fā)育功能上的差異以及細(xì)胞質(zhì)對(duì)細(xì)胞核的影響。 1980.4，中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所用鯽魚(yú)做移核試驗(yàn)，成功培育出兩尾無(wú)性繁殖的幼魚(yú)。 1989，童第周、牛滿(mǎn)江將鯽魚(yú)胚胎細(xì)胞核移入鯉魚(yú)去核的未受精卵中，實(shí)現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚(yú)”新品種，這個(gè)新品種的“鯉鯽核魚(yú)”既具有鯽魚(yú)的鮮美味道，又具有鯉魚(yú)的生長(zhǎng)快速。 細(xì)胞核移植技術(shù) 2008，鯉鯽移核魚(yú)是采用無(wú)性雜交的細(xì)胞工程技術(shù)，將荷包紅鯉的囊胚細(xì)胞核移植到鯽魚(yú)的去核卵中而發(fā)育形成的后代。 其魚(yú)體呈紅色，外形特征與鯉魚(yú)相似，但也同時(shí)具有一些鯽魚(yú)的特征，具有比較穩(wěn)定的遺傳性狀。F1～F4代（1～4子代），基本性狀趨于一致。其生長(zhǎng)速度明顯快于鯽魚(yú)，并且比荷包紅鯉快35％左右。 用鯉鯽移核魚(yú)F2雄性與鏡鯉雜交而獲得的雜交一代被稱(chēng)為穎鯉。穎鯉具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，其生長(zhǎng)速度比 雙親快42％左右。 4、限制條件 細(xì)胞核移植必須有一個(gè)前提，就是要盡量保證核供體和受體細(xì)胞處于同樣的細(xì)胞周期，高等細(xì)胞發(fā)展到一定階段時(shí)都要進(jìn)行有絲分裂，而各種細(xì)胞的有絲分裂周期是各不相同的。 在哺乳動(dòng)物核移植實(shí)驗(yàn)中的核供體細(xì)胞和核受體細(xì)胞可能處在細(xì)胞周期的不同階段上?，F(xiàn)在可以通過(guò)采用“饑餓技術(shù)”來(lái)減慢細(xì)胞活動(dòng)、迫使供體細(xì)胞處于某種休眠狀態(tài)，以期獲得與受體細(xì)胞同步的狀態(tài)，便于兩者的結(jié)合。 5、 我國(guó)在細(xì)胞核移植技術(shù)選育魚(yú)類(lèi)新品種方面處于世界領(lǐng)先地位，以魚(yú)類(lèi)細(xì)胞核移植為例，詳細(xì)介紹一下細(xì)胞核移植技術(shù)要點(diǎn)： (1)供體和受體的準(zhǔn)備 供體通常為魚(yú)類(lèi)的囊胚細(xì)胞或成體細(xì)胞。 受體為成熟的卵細(xì)胞。該受體卵一般可通過(guò)人工催產(chǎn)的方法得到。卵子在接受供體核之前要先激活來(lái)獲得發(fā)育能力。 對(duì)于魚(yú)卵而言，當(dāng)它被擠入水中即可被激活。對(duì)于兩棲類(lèi)動(dòng)物的卵可采用針刺方法。最關(guān)鍵的是供體和受體在發(fā)育時(shí)間上要配合好，保證在受體成熟卵剛產(chǎn)出時(shí),供體受精卵發(fā)育至囊胚期。 (2)去卵膜和卵核 可用小鑷子在解剖顯微鏡下仔細(xì)剝?nèi)ヂ涯?，或用適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌溉芤很浕涯?，?jīng)過(guò)輕輕晃動(dòng)，使卵子從中脫出。 魚(yú)卵----極細(xì)的玻璃微針借助第二極體標(biāo)志(卵核位于極體下方)挑出細(xì)胞核。 兩棲類(lèi)----紫外線照射受體卵達(dá)到去核目的。 (3)供體細(xì)胞制備 將發(fā)育至囊胚期的胚胎或組織器官進(jìn)行機(jī)械切割，置于胰蛋白酶溶液中處理幾分鐘，直至分離出單個(gè)細(xì)胞。也可將囊胚細(xì)胞或得到的離體細(xì)胞短期培養(yǎng)后用作供體。 (4)移核 由于細(xì)胞核極小，而且脆弱，因此需要極其小心，防止損傷細(xì)胞核或傷害到細(xì)胞質(zhì)。 實(shí)際上核移植時(shí)，核周?chē)纳倭考?xì)胞質(zhì)也一起注射進(jìn)了去核后的受體細(xì)胞中了。30-40min中內(nèi)完成，溫度：16-18℃ （三）克隆動(dòng)物一般制備技術(shù) 克隆可以通過(guò)不同來(lái)源的細(xì)胞核移植來(lái)實(shí)現(xiàn)，如胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、體細(xì)胞等。 其中以胚胎細(xì)胞克隆的應(yīng)用比較普遍，以體細(xì)胞克隆的意義最大。 1、移植細(xì)胞核的來(lái)源不同分為 胚胎細(xì)胞核移植法 胚胎干細(xì)胞核移植 胎兒成纖維細(xì)胞核移植 體細(xì)胞克隆技術(shù) （1）胚胎細(xì)胞核移植法 將未著床的早期胚胎分散成單個(gè)的細(xì)胞，在電流的作用下，使單個(gè)細(xì)胞與去除染色體的未受精的卵母細(xì)胞融合。發(fā)育成胚胎后，移入受體妊娠產(chǎn)仔。 原則上，一枚早期胚胎有多少個(gè)細(xì)胞，通過(guò)這種方法就可以克隆出多少個(gè)個(gè)體。還可將細(xì)胞反復(fù)克隆出更多的胚胎，產(chǎn)生更多克隆動(dòng)物。 哺乳動(dòng)物的胚胎細(xì)胞在分裂成8細(xì)胞以前，所有的單卵裂球均為全能細(xì)胞，即每個(gè)卵裂球均能表達(dá)此個(gè)體的全部基因。理論上這時(shí)的每個(gè)卵裂球經(jīng)過(guò)核移植，都能發(fā)育成遺傳性狀完全相同的個(gè)體。 這些工作為進(jìn)一步研究細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的相互關(guān)系建立了很好的模型。 （2）胚胎干細(xì)胞核移植 將胚胎或胎兒的原始生殖細(xì)胞經(jīng)過(guò)抑制分代培養(yǎng)后，細(xì)胞數(shù)量增多，單細(xì)胞卻不分化。因此，每個(gè)細(xì)胞仍然具有細(xì)胞全能性而發(fā)育成個(gè)體的能力，這樣的細(xì)胞被稱(chēng)為胚胎干細(xì)胞系。 再利用細(xì)胞核移植技術(shù)，可以比胚胎核移植生產(chǎn)出更多的動(dòng)物個(gè)體。 目前僅有小鼠分離克隆出其胚胎干細(xì)胞系并成功克隆出成體鼠。 （3）胎兒成纖維細(xì)胞核移植 從妊娠早期胎兒分離出胎兒成纖維細(xì)胞，采用細(xì)胞核移植方法克隆出胚胎，經(jīng)移植受體后，妊娠產(chǎn)仔，克隆出動(dòng)物個(gè)體。 （4）體細(xì)胞克隆技術(shù) 將動(dòng)物體細(xì)胞經(jīng)過(guò)抑制培養(yǎng)，使其處于休眠狀態(tài)，利用細(xì)胞核移植技術(shù)將其導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞，發(fā)育成胚胎后移植至受體，妊娠產(chǎn)仔，克隆出成體動(dòng)物。 ******************************************************************************* 克隆羊多莉——培育過(guò)程： 克隆羊多利是由英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)羅斯林學(xué)院 (Edinburgh’s Roslin Institute)的胚胎學(xué)家伊恩·威爾馬特 (Ian Wilmut)領(lǐng)導(dǎo)的科研小組從一只成年綿羊的乳腺細(xì)胞克隆出來(lái)的。 1. 取處于后三分之一妊娠期的6歲母綿羊的乳腺細(xì)胞作核供體細(xì)胞，用“饑餓法”時(shí)期進(jìn)入休眠狀態(tài)而使全部基因具有活性。 2. 從蘇格蘭黑面母綿羊摘取卵細(xì)胞，通過(guò)手術(shù)去除其細(xì)胞核（DNA的載體）作為受體細(xì)胞。 3. 把白羊的乳腺細(xì)胞放入黑羊的已去除細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，以一種弗蘭肯斯坦（Frankensfein）式的技巧，用電脈沖使這些細(xì)胞的膜不僅結(jié)合在一起，而且，兩個(gè)細(xì)胞即刻合而為一。 4. 將新的卵細(xì)胞植入羊的的結(jié)扎的輸卵管內(nèi)，6天后發(fā)育成桑椹期胚胎或囊胚，再移入假孕母羊子宮內(nèi)。 5. 產(chǎn)下多莉即為6歲母羊的復(fù)制品，也為白色。 **克隆動(dòng)物成功與否的關(guān)鍵問(wèn)題 首先是核移植過(guò)程中要分離得到供體細(xì)胞和作為受體細(xì)胞的卵細(xì)胞 。 其次要取處在適當(dāng)發(fā)育階段及細(xì)胞周期的受體和供體細(xì)胞，受體細(xì)胞和供體細(xì)胞處于細(xì)胞周期中的同一時(shí)期 ，核移植成功的幾率最大。 受體細(xì)胞在細(xì)胞周期中所處的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)核實(shí)驗(yàn)成功與否的影響要大于供體細(xì)胞所處的時(shí)間的影響，一般取G2期進(jìn)行核移植的效果都較好。 另外，細(xì)胞誘導(dǎo)分裂成熟的因子（MPF）的活性有關(guān)。 ******************************************************************************* 7.2.4 克隆技術(shù)的應(yīng)用與意義 能使異種動(dòng)物借腹妊娠、產(chǎn)仔，加快珍稀動(dòng)物繁殖，搶救瀕危動(dòng)物(如大熊貓)； 建立重要疾病的基因模型，生產(chǎn)生物活性藥物。 為了解細(xì)胞發(fā)育的潛能性、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間相互關(guān)系、胚胎發(fā)生死亡及其調(diào)控研究提供了新視角，因此對(duì)揭示生命科學(xué)重大基礎(chǔ)理論問(wèn)題具有重要的科學(xué)價(jià)值。 動(dòng)物克隆近幾年取得的一些突破性進(jìn)展，為動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的調(diào)控及發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展必將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。盡管目前這種方法尚不成熟，但它已顯示出誘人的應(yīng)用的前景。 1、檢驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞的全能性 在多莉羊誕生之前，普遍認(rèn)為低等生物和高等植物的細(xì)胞具有全能性，而高等動(dòng)物的體細(xì)胞沒(méi)有全能性。 目前克隆技術(shù)取得的結(jié)果，為再生、修復(fù)、治療組織器官缺損等奠定了理論基礎(chǔ)，也增加了采用高度分化的體細(xì)胞克隆各種動(dòng)物的信心。 2、加速動(dòng)物繁殖、優(yōu)良育種、保護(hù)珍貴動(dòng)物 由于體細(xì)胞數(shù)量巨大和易于獲得，因此動(dòng)物克隆技術(shù)有助于加速動(dòng)物育種的進(jìn)程。 利用優(yōu)良動(dòng)物品種的體細(xì)胞作核供體克隆動(dòng)物，可以避免自然條件下選種所受到的動(dòng)物生育周期和生育效率的限制，從而大大縮短育種年限，提高育種效率。（大熊貓交配的季節(jié)在春季三至五月份，通常不超過(guò)2－4天。 ） 也可以結(jié)合基因工程技術(shù)將具有特殊功能的基因(如具有一些經(jīng)濟(jì)性狀、抗蟲(chóng)、抗病等)導(dǎo)入體細(xì)胞，然后用克隆技術(shù)培育出人們希望的動(dòng)物新品種。 2001.4，一種具有極高科學(xué)價(jià)值的商品—利用克隆技術(shù)培育的金魚(yú)由美國(guó)一家基因復(fù)制公司投放市場(chǎng)，這標(biāo)志著克隆動(dòng)物已經(jīng)開(kāi)始了商業(yè)化歷程。 3、克隆瀕危物種 2002年4月27日,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)成功克隆了第一頭優(yōu)質(zhì)中國(guó)黃牛, 這標(biāo)志著中國(guó)在動(dòng)物體細(xì)胞克隆領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展。這頭名為“波娃”的體細(xì)胞克隆中國(guó)黃牛所使用的核供體細(xì)胞來(lái)源于一頭不足六個(gè)月的冀南牛純種小母牛的耳朵皮膚組織,而使用的卵母細(xì)胞取自于屠宰場(chǎng)宰殺后的母牛卵巢?！安ㄍ蕖迸c其供體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)完全相同,而與其代孕母親———荷斯坦奶牛在遺傳上分屬不同來(lái)源。該次克隆成功屬?lài)?guó)際首次,此次克隆中國(guó)優(yōu)質(zhì)黃牛的成功使目前挽救瀕臨滅絕的優(yōu)良黃牛品種成為可能。 4、克隆寵物 2004年8月6日美聯(lián)社報(bào)道:美國(guó)加州“遺傳儲(chǔ)存與克隆”公司近日正式宣布,他們成功地培育出了世界上首對(duì)克隆寵物貓,今后,他們將在世界范圍內(nèi)推廣寵物克隆業(yè)務(wù),需要交納5萬(wàn)美元的“克隆費(fèi)”,你家的寵物就可以有個(gè)一模一樣的伙伴了。 5、醫(yī)藥領(lǐng)域 由于克隆動(dòng)物的遺傳背景相同，因此它們是模擬疾病、基因治療、器官移植等研究的良好實(shí)驗(yàn)材料，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。 利用克隆技術(shù)，可以用患者本人細(xì)胞培育出新組織，用來(lái)治療糖尿病、帕金森氏癥、神經(jīng)損傷等多種疾病。用這種方法培育出的組織不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，具有與患者正常組織完全相同的基因構(gòu)成。 隨著人類(lèi)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的完善，科學(xué)家已開(kāi)始研究利用克隆技術(shù)培育人胚胎，希望大批量生產(chǎn)治療疾病的干細(xì)胞 。 移植器官來(lái)源不足是各國(guó)存在的普遍問(wèn)題，所以人們開(kāi)始致力于異種器官移植和克隆器官移植的研究。利用克隆動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞作異源移植，以解決人類(lèi)移植器官供求矛盾。 目前我國(guó)的年器官移植數(shù)量已經(jīng)位居世界第二，其種類(lèi)和成功率也都達(dá)到或接近國(guó)際先進(jìn)水平。 但還存在著基礎(chǔ)研究薄弱、研究體系分散和社會(huì)捐獻(xiàn)活體器官意識(shí)不強(qiáng)、數(shù)量較低以及相應(yīng)立法不完備等問(wèn)題。 未來(lái)人類(lèi)器官移植治療將集中在人對(duì)人的同體器官移植、動(dòng)物對(duì)人的異體器官移植和克隆人體器官移植等方面。 其中克隆人體器官更具有光明的前景，將解決一系列移植方面的關(guān)鍵問(wèn)題，不過(guò)目前其實(shí)際運(yùn)用還為時(shí)過(guò)早，因?yàn)殡m然現(xiàn)在可以復(fù)制具有機(jī)械功能的臟器，但如何還原其生化作用還有待于探索。 7.2.5 正確看待克隆技術(shù) 1、技術(shù)尚不成熟 現(xiàn)階段克隆動(dòng)物等技術(shù)尚不成熟，還處于探索階段。目前所得到的克隆動(dòng)物具有極大的偶然性和隨機(jī)性。迄今為止，克隆試驗(yàn)的成功率始終很低。（在培育多莉的過(guò)程中，科學(xué)家共克隆出277個(gè)綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產(chǎn)的只有多莉一個(gè)。此外，克隆動(dòng)物夭折率高，不少克隆動(dòng)物天生患有疾病或體形過(guò)大。） 2、克隆動(dòng)物的體細(xì)胞突變、壽命及其他遺傳問(wèn)題 基因突變與DNA復(fù)制次數(shù)緊密相關(guān)。分裂越多的體細(xì)胞發(fā)生突變的可能性就越大，這與通過(guò)克隆迅速獲得大量動(dòng)物個(gè)體的目的相矛盾，是克隆動(dòng)物材料來(lái)源不可避免的問(wèn)題。 同時(shí)，由于克隆是無(wú)性繁殖，克隆動(dòng)物沒(méi)有遺傳物質(zhì)的交流和互補(bǔ)，將會(huì)加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。 此外，出于體細(xì)胞分裂代數(shù)是有限的，因此克隆動(dòng)物的壽命是否會(huì)受到體細(xì)胞分裂代數(shù)的影響，也尚不清楚。 2002年1月， “多莉”被診斷患有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎，這是科學(xué)家對(duì)克隆生命的前景表示出擔(dān)擾。 綿羊的平均壽命為為13年，多莉5歲半就患關(guān)節(jié)炎顯然過(guò)早。 在多莉誕生后的3年多時(shí)間內(nèi)，已獲得了許多成活的體細(xì)胞克隆動(dòng)物。但是，在大多數(shù)研究中，都出現(xiàn)了高頻率的出生體重增加，以及胎兒或新生兒的死亡。因此、就目前的研究來(lái)看，動(dòng)物克隆技術(shù)要實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化是非常困難的。 3、是否是完全的“復(fù)制” 就遺傳的角度而言?？寺?dòng)物的性狀可能與其來(lái)源的親本完全相同，但是至少以下一些因素會(huì)影響克隆動(dòng)物的遺傳性狀： (1)細(xì)胞突變 (2)受體卵細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)差異 (3)受體遺傳上或生理上的差異 (4)后期生長(zhǎng)的環(huán)境與馴化 大多數(shù)人認(rèn)為，克隆是復(fù)制的同義詞，復(fù)制品與原件是完全一樣的。DNA的復(fù)制結(jié)果就是如此，所以復(fù)制用于DNA的合成是一個(gè)非常確切的術(shù)語(yǔ)。 克隆則是一個(gè)過(guò)程，克隆產(chǎn)生的個(gè)體還需進(jìn)行胚胎發(fā)育和胎后發(fā)育，克隆個(gè)體與原件之間有一段年齡差異。由于發(fā)育過(guò)程既受基因主宰又受環(huán)境調(diào)控，而克隆與其原本盡管基因相同，所處環(huán)境卻絕不會(huì)相同，所以，克隆與其原本不可能像復(fù)制品與原件那樣完全一樣的。 再者，雖然克隆個(gè)體是由核移植產(chǎn)生的，但由于重建細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)并非來(lái)自原本，而我們知道細(xì)胞質(zhì)中也有遺傳物質(zhì)，它們必然會(huì)對(duì)個(gè)體產(chǎn)生影響，所以不能把克隆個(gè)體看成是原本的復(fù)制品。 盡管從遺傳結(jié)構(gòu)上看克隆個(gè)體和原本是姐妹(兄弟)關(guān)系，但從年齡上看它們卻是親子關(guān)系。無(wú)性繁殖的生物仍然有”代”的概念，克隆個(gè)體也應(yīng)有”代”的概念。 而且，克隆個(gè)體和原本是可以同時(shí)存在。因此，準(zhǔn)確地說(shuō)，克隆個(gè)體可以看成是原本的再生，但不是原本的復(fù)活。 4、克隆動(dòng)物可應(yīng)用型的思考 有性生殖是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中的自我選擇、適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果，是一種有利于種族繁衍和生存的生殖方式。 從這個(gè)角度來(lái)講，用克隆動(dòng)物繁殖生物可能給生物的生存和自然界帶來(lái)意想不到的后果，同時(shí)，最關(guān)鍵的是，這種繁殖方式會(huì)造成基因的丟失，不利于遺傳物質(zhì)和生物多樣性的保護(hù)。于是，有學(xué)者認(rèn)為，克隆動(dòng)物是違反生物進(jìn)化規(guī)律的，是一種倒退。 5、總之，克隆技術(shù)的低效率以及克隆動(dòng)物后代出現(xiàn)的體重增加、體弱多病等事實(shí)，使得單獨(dú)的克隆技術(shù)在近期內(nèi)難以得到推廣應(yīng)用。在克隆技術(shù)還不成熟的今天，人類(lèi)要克隆出健康的動(dòng)物是相當(dāng)困難的，克隆技術(shù)在實(shí)踐中真正應(yīng)用還有相當(dāng)長(zhǎng)的路要走。 **克隆人問(wèn)題 克隆不能產(chǎn)生相同的人 人類(lèi)克隆自己是不道德的 許多國(guó)家都立法禁止克隆人 “科學(xué)是一柄雙刃劍”，如果有人利用克隆技術(shù)來(lái)克隆人，那會(huì)給人類(lèi)帶來(lái)無(wú)窮的災(zāi)難。